瓦尼桑黃核苷類(lèi)成分的液體發(fā)酵工藝優(yōu)化及其細(xì)胞毒活性

祝梓旋, 張?jiān)姾? 田 興, 李雪妍, 鄒 坤,尉小琴,李 嘯,曾建紅, 馬明華, 王 倩, 劉呈雄*, 劉朝霞*

(1.三峽大學(xué)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北,宜昌 443003;2.宜昌市森林火災(zāi)預(yù)防中心, 湖北,宜昌 443000; 3.宜昌人福藥業(yè)有限公司,湖北,宜昌 443000)

瓦尼桑黃(Sanghuangporusvaninii)又稱(chēng)楊樹(shù)桑黃,擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycota)層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)真菌.研究表明,桑黃富含萜類(lèi)、多糖類(lèi)、核苷酸類(lèi)[1]以及黃酮類(lèi)等多種活性成分,具有抗腫瘤[2-3]、抗炎癥、抗氧化、降血糖[4-6]、護(hù)肝等功效[7].目前市面上銷(xiāo)售的桑黃主要有桑樹(shù)桑黃(Sanghuangporussanghuang)、瓦尼桑黃以及粗毛纖孔菌(Inonotushispidus).與其他品種相比,瓦尼桑黃品質(zhì)穩(wěn)定,生長(zhǎng)條件容易控制,可以進(jìn)行人工栽培,是最易栽培的品種[8-9].

瓦尼桑黃在食品、藥品等方面都有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值[10-11].但野生桑黃稀少,且生長(zhǎng)周期長(zhǎng),通過(guò)野生環(huán)境來(lái)獲得桑黃子實(shí)體難以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求[12-13].液體發(fā)酵能夠?yàn)榫z生長(zhǎng)提供最佳的營(yíng)養(yǎng),使菌絲快速生長(zhǎng),迅速擴(kuò)繁,在短時(shí)間可達(dá)到一定生物量.與子實(shí)體培養(yǎng)相比,液體發(fā)酵技術(shù)不僅有周期短、效率高、規(guī)模大、質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),而且能對(duì)各種生長(zhǎng)影響因子進(jìn)行控制和優(yōu)化,便于更好地從發(fā)酵液中分離提取活性物質(zhì),應(yīng)用前景廣闊[14].

核苷(nucleoside)是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素.在人體內(nèi),核苷可以干擾或直接參加核酸的新陳代謝[15],有抗病毒、抗腫瘤、抗菌等活性[16],目前已開(kāi)發(fā)成多種藥品,如碘苷、利巴韋林、阿昔洛韋等[17].天然核苷類(lèi)成分在各種動(dòng)植物中均存在[18],在許多藥用真菌中也富含核苷類(lèi)物質(zhì)[19-21],近年來(lái)從真菌中獲取核苷類(lèi)活性成分受到了越來(lái)越多的關(guān)注,如蟲(chóng)草中所含的蟲(chóng)草素、鳥(niǎo)苷、尿苷等被報(bào)道有抗腫瘤[22]、提高免疫力、抗菌等[23]藥理活性;猴頭菌所含核苷具有ABTS、DPPH等自由基清除活性而發(fā)揮抗氧化作用[24].目前,已有研究報(bào)道從瓦尼桑黃以及桑樹(shù)桑黃子實(shí)體中測(cè)定并分離得到核苷類(lèi)物質(zhì),有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等豐富的藥理活性[1, 25],具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值,但與液體發(fā)酵相比,傳統(tǒng)的子實(shí)體培養(yǎng)具有成本高、周期長(zhǎng)和產(chǎn)品不穩(wěn)定等缺點(diǎn).為解決桑黃子實(shí)體培養(yǎng)的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題,本研究以核苷類(lèi)成分為目標(biāo)產(chǎn)物,優(yōu)化桑黃液體發(fā)酵條件,并尋找影響桑黃核苷產(chǎn)量的關(guān)鍵因素以提高核苷產(chǎn)量,最終通過(guò)對(duì)瓦尼桑黃液體發(fā)酵條件、培養(yǎng)基配比、外源添加前體物質(zhì)以及調(diào)控因子的工藝優(yōu)化,使瓦尼桑黃液體發(fā)酵核苷產(chǎn)量提高了32.3倍,隨后通過(guò)MTT法比較了發(fā)酵優(yōu)化前后以及子實(shí)體核苷富集產(chǎn)物的體外細(xì)胞毒活性,為桑黃液體深層培養(yǎng)和進(jìn)一步應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

供試菌株:瓦尼桑黃(Sanghuangporusvaninii)菌株QJF-8,保藏編號(hào)為CGMCC No.40120,由湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保藏.

固體培養(yǎng)基:PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂).

液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖20.00 g·L-1、酵母粉5.00 g·L-1、硫酸鎂0.50 g·L-1、氯化鈉0.50 g·L-1、磷酸二氫鉀0.50 g·L-1.

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20.00 g·L-1、酵母粉5.00 g·L-1、硫酸鎂0.50 g·L-1、氯化鈉0.50 g·L-1.

1.2 試劑藥品

分析純?cè)噭?鹽酸(國(guó)藥集團(tuán))、氫氧化鈉(國(guó)藥集團(tuán))、葡萄糖(科密歐)、蔗糖(科密歐)、乳糖(科密歐)、甘露醇(麥克林)、磷酸二氫鉀(麥克林)、氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán))、L-谷氨酸(國(guó)藥集團(tuán))、甘氨酸(國(guó)藥集團(tuán))、無(wú)水硫酸鎂(科密歐)、腺嘌呤(麥克林)、次黃嘌呤(麥克林)、DL-天冬氨酸(麥克林)、L-谷氨酰胺(麥克林)、槲皮素(麥克林)、丙酮酸鈉(國(guó)藥集團(tuán))、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(源葉)、1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(普諾賽)、四季青胎牛血清(天杭生物)、MTT(Amersco)、胰酶(Gibco).

普通生化試劑:蛋白胨(奧博星)、酵母粉(索萊寶)、牛肉膏(奧博星).

1.3 儀器與設(shè)備

XQTY-50ES型振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器)、LRH-150型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器)、HIRAYAMA HVE-50型立式壓力蒸汽滅菌器(日本W(wǎng)ade Stainless Kogyo)、FA1004型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器)、UV-5500PC型分光光度計(jì)(上海元析儀器)、SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備).

1.4 瓦尼桑黃菌株培養(yǎng)

1.4.1 菌株的復(fù)蘇 用PDA培養(yǎng)基,接種后在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)14 d.

1.4.2 種子液體培養(yǎng) 取培養(yǎng)好的PDA固體母種5 mm 共5塊于液體種子培養(yǎng)基中,裝液量200 mL(每500 mL),在28 ℃、140 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d后收集種子液.

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液培養(yǎng)好后,以10%體積分?jǐn)?shù)接種于液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,裝液量50 mL(每150 mL),在28 ℃、140 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d.

1.5 瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取0.1 mg·mL-1腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液(HPLC≥99%)1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL,分別置50 mL容量瓶中,加水定容至刻度線,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外-可見(jiàn)分光光度法(《中華人民共和國(guó)藥典 2020年版》通則0401),在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.如圖1,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為:y=58.671x-0.0019(R2=0.9998).

圖1 腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5.2 樣品核苷產(chǎn)量測(cè)定 分別收集發(fā)酵液及菌絲體,菌絲體于50 ℃烘干至恒重后加10 mL純水,在40 ℃溫度下超聲提取40 min.將發(fā)酵液與菌絲體提取液配成合適濃度的供試品溶液,參照紫外-可見(jiàn)分光光度法(《中華人民共和國(guó)藥典 2020年版》通則0401),在260 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定發(fā)酵液與菌絲體供試液吸光值,以相應(yīng)培養(yǎng)基為空白,計(jì)算發(fā)酵液及菌絲體核苷總產(chǎn)量.

1.6 瓦尼桑黃核苷發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

1.6.1 接種量對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 按基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基方案,設(shè)置接種量(體積分?jǐn)?shù),下同)分別為4%、6%、8%、10%、12%,裝液量(每150 mL)、初始pH 7、28 ℃、140 r·min-1培養(yǎng)7 d,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.6.2 培養(yǎng)溫度對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 按基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基方案,將溫度梯度調(diào)整為20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃,裝液量50 mL(每150 mL)、接種量10%、初始pH 7、140 r·min-1培養(yǎng)7 d,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.6.3 初始pH對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 按基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基方案,用1 moL·L-1HCl或NaOH溶液將發(fā)酵液初始pH梯度調(diào)整為4、5、6、7、8、9,裝液量50 mL(每150 mL)、接種量10%、28 ℃、140 r·min-1培養(yǎng)7 d,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.6.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 按基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基方案,分別設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為100、120、140、160、180 r·min-1,裝液量50 mL(每150 mL)、初始pH 7、接種量10%、28 ℃培養(yǎng)7 d,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.6.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 按基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配制,設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間梯度為1、2、3、4、5、6、7 d.裝液量50 mL、初始pH=7、接種量10%、在28 ℃、140 r·min-1條件下培養(yǎng),進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.7 瓦尼桑黃核苷液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.7.1 碳源、氮源的單因素篩選試驗(yàn)

碳源篩選實(shí)驗(yàn):分別以20.00 g·L-1的蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇代替液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖,培養(yǎng)基其他組分不變,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

氮源篩選實(shí)驗(yàn):分別以5.00 g·L-1的蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉代替液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母粉,培養(yǎng)基其他組分不變,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

根據(jù) 《預(yù)算績(jī)效管理工作規(guī)劃(2012—2015年)》的要求，各級(jí)財(cái)政部門(mén)應(yīng)加快對(duì)績(jī)效指標(biāo)的研究設(shè)計(jì)和修訂補(bǔ)充，初步形成涵蓋各類(lèi)各項(xiàng)支出，符合目標(biāo)內(nèi)容，突出績(jī)效特色，細(xì)化、量化的績(jī)效指標(biāo)。從近幾年水利重大試點(diǎn)項(xiàng)目預(yù)算績(jī)效管理工作實(shí)踐來(lái)看，在預(yù)算項(xiàng)目績(jī)效指標(biāo)體系建設(shè)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)遵循以下主要原則：

1.7.2 碳源、氮源正交試驗(yàn) 根據(jù)碳源與氮源的單因素篩選的結(jié)果,選擇試驗(yàn)結(jié)果較好的碳源、氮源各兩個(gè):葡萄糖(A)、蔗糖(B)、蛋白胨(C)、牛肉膏(D)作為正交試驗(yàn)中的因素,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),各因素水平如表1所示.

1.7.3 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn) 得到最佳碳氮比的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,參考現(xiàn)有瓦尼桑黃培養(yǎng)基研究結(jié)果以及核苷合成代謝途徑,選取MgSO4(E)、CaCl2(F)、ZnSO4(G)、MnSO4(H)作為正交試驗(yàn)中的4因素[19, 26-27],設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),各因素水平如表2所示.

表2 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9(34)

1.8 不同前體物質(zhì)、調(diào)控因子及其濃度篩選試驗(yàn)

1.8.1 前體物質(zhì)篩選 在核苷的從頭合成途徑過(guò)程中需要消耗L-谷氨酰胺、DL-天冬氨酸、腺嘌呤等前體物質(zhì)[28].但在生物體內(nèi)這些前體物質(zhì)不僅用于產(chǎn)物的合成,還需為自身的生長(zhǎng)和其它代謝活動(dòng)提供充足能量,有關(guān)研究表明,通過(guò)外源添加前體物質(zhì)能夠有效提高核苷類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)量[29-30].本研究從此入手,選擇次黃嘌呤、DL-天冬氨酸、腺嘌呤、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-谷氨酸作為試驗(yàn)對(duì)象,探究外源前體物質(zhì)對(duì)瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量的影響.在1.7試驗(yàn)基礎(chǔ)上,分別在培養(yǎng)基中加入1 g·L-1不同前體物質(zhì):次黃嘌呤、DL-天冬氨酸、腺嘌呤、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-谷氨酸,每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.8.2 前體物質(zhì)濃度篩選 根據(jù)試驗(yàn)1.8.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇腺嘌呤和次黃嘌呤,進(jìn)行下一步濃度篩選試驗(yàn).設(shè)置質(zhì)量濃度為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 g·L-1七個(gè)水平的次黃嘌呤與腺嘌呤,每個(gè)水平重復(fù)3次.

1.8.3 調(diào)控因子篩選 核苷的生物合成涉及多種途徑如磷酸戊糖途徑、核苷酸的從頭合成途徑、補(bǔ)救途徑等,并有多種代謝酶參與其中[31].已有研究證明可通過(guò)提高關(guān)鍵酶活性,或通過(guò)增加HMP途徑碳流量、抑制糖酵解途徑、調(diào)控傳導(dǎo)通路等來(lái)提高核苷的生物合成[32-33].基于此,本研究在試驗(yàn)1.7基礎(chǔ)上,分別在培養(yǎng)基中加入0.5 g·L-1不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):檸檬酸鈉[20, 34]、丙酮酸鈉[33, 35]、維生素B7、維生素B12[36]、槲皮素[32]、氟化鈉[37]、硝普鈉[38],每組設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.8.4 調(diào)控因子濃度篩選 根據(jù)試驗(yàn)1.8.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù),設(shè)置質(zhì)量濃度為1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 g·L-1六個(gè)水平的丙酮酸鈉;0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 g·L-1六個(gè)水平的槲皮素,每個(gè)水平重復(fù)3次.

1.8.5 前體及調(diào)控因子正交試驗(yàn) 根據(jù)不同前體物質(zhì)、調(diào)控因子及其濃度篩選試驗(yàn)結(jié)果,選擇優(yōu)化效果最佳的次黃嘌呤(I)、腺嘌呤(J)、丙酮酸鈉(K)、槲皮素(L)作為正交實(shí)驗(yàn)的四因素.參考表3為L(zhǎng)9(34)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn).

表3 前體及調(diào)控因子正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9(34)

1.9 瓦尼桑黃核苷類(lèi)成分的細(xì)胞毒活性研究

1.9.2 MTT法測(cè)定富集產(chǎn)物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 的細(xì)胞毒活性

1) 樣品溶液的配制.稱(chēng)取32.0 mg瓦尼桑黃發(fā)酵優(yōu)化前后以及子實(shí)體的核苷富集產(chǎn)物,分別溶于100 μL DMSO中,充分搖勻溶解,配成2.4 mg·mL-1的樣品溶液,在無(wú)菌操作臺(tái)中使用0.22 μm微孔的滅菌濾膜過(guò)濾除菌,得到樣品母液.隨后將樣品母液用1640培養(yǎng)基梯度稀釋為5、10、20、40、80、160、320 μg·mL-1的七個(gè)劑量組.

2) 富集產(chǎn)物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒活性試驗(yàn).選擇處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人肝癌細(xì)胞HepG2,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個(gè)(每mL).接入96孔板中,孔板周?chē)?00 μL空白培養(yǎng)基填充,并將96孔板第一個(gè)孔設(shè)置為調(diào)零孔,其余實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μL腫瘤細(xì)胞混懸液,充分振蕩96孔板以保證各孔內(nèi)細(xì)胞均勻分布,且每孔的細(xì)胞數(shù)量大致相同,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.將接種后的細(xì)胞板在37 ℃的5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h.培養(yǎng)結(jié)束,分別加入不同濃度的樣品溶液在37 ℃的5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每孔加入20 μL的5 mg·mL-1MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后終止培養(yǎng).用移液槍小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO溶液,用細(xì)胞培養(yǎng)板振蕩器振蕩5 min,使用酶標(biāo)儀在492 nm下測(cè)定各孔吸光值,按照公式計(jì)算瓦尼桑黃核苷成分對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率.抑制率的具體計(jì)算公式為:

抑制率=[1-D(492)試驗(yàn)/D(492)對(duì)照]×100%.

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 瓦尼桑黃核苷發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 接種量對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 將不同接種量條件下的瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量進(jìn)行比較,結(jié)果如圖2a.隨著接種量的增加,瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量也呈上升趨勢(shì),在接種量10%時(shí)達(dá)到最大值:9.13±0.42 mg·L-1.當(dāng)接種量達(dá)到12%時(shí),可能由于接種量過(guò)高,菌絲過(guò)早進(jìn)入發(fā)酵終點(diǎn),進(jìn)而提前老化自溶產(chǎn)生了副產(chǎn)物,抑制了核苷產(chǎn)量.因此選擇10%為最適接種量.

圖2 不同培養(yǎng)條件對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 將不同培養(yǎng)溫度條件下的瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量進(jìn)行比較,結(jié)果如圖2b.如圖所示,起初隨著溫度的提高,核苷產(chǎn)量無(wú)明顯差異,但當(dāng)溫度提高至28 ℃時(shí),隨著溫度的提高產(chǎn)量也隨之增加,32 ℃時(shí)達(dá)到最大值10.03 ± 0.31 mg·L-1,超過(guò)32 ℃后又出現(xiàn)下降趨勢(shì),可見(jiàn)本試驗(yàn)中,稍高溫度更利于目標(biāo)產(chǎn)物的生成,因此選擇32 ℃為最適的培養(yǎng)溫度.

2.1.3 初始pH對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 將不同初始pH條件下的瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量進(jìn)行比較,如圖2c可知,pH在4～7階段時(shí),核苷產(chǎn)量沒(méi)有明顯差異,在pH=7時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大13.24 ± 0.39 mg·L-1.但高于7后出現(xiàn)了明顯的下降,說(shuō)明中性及弱酸性更有利于瓦尼桑黃核苷成分的合成,而堿性條件會(huì)抑制核苷的生成,因此選擇7為最適初始pH.

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 將不同搖床轉(zhuǎn)速條件下的瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量進(jìn)行比較,結(jié)果如圖2d,在100～140 r·min-1的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi),隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加,核苷產(chǎn)量也隨之提高,轉(zhuǎn)速超過(guò)140 r·min-1后,隨著轉(zhuǎn)速的增加核苷的產(chǎn)量反而有下降的趨勢(shì).因此瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速確定為140 r·min-1,在此條件下核苷產(chǎn)量為14.22 ± 0.44 mg·L-1.

2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響 將不同培養(yǎng)時(shí)間下的瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量進(jìn)行比較,結(jié)果如圖2e所示,核苷產(chǎn)量在培養(yǎng)第3 d開(kāi)始增長(zhǎng),在第5 d達(dá)到最大值15.33 ± 0.29 mg·L-1,培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)5 d后略有下降.可能過(guò)長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致出現(xiàn)菌絲體老化、初級(jí)代謝產(chǎn)物分解等現(xiàn)象,故選擇最適培養(yǎng)時(shí)間為5 d.

綜上所述,試驗(yàn)2.1對(duì)瓦尼桑黃產(chǎn)核苷的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,單因素試驗(yàn)表明:接種量10%;培養(yǎng)溫度32 ℃;初始pH為7;搖床轉(zhuǎn)速140 r·min-1;培養(yǎng)時(shí)間5 d為最優(yōu)發(fā)酵條件,在此最優(yōu)條件下核苷產(chǎn)量為15.33 ± 0.29 mg·L-1.

2.2 瓦尼桑黃核苷液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.2.1 最佳碳源的選擇 圖3a為不同碳源培養(yǎng)基對(duì)核苷產(chǎn)量的影響,由圖可知,蔗糖、葡萄糖、乳糖作為碳源時(shí),瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量高于其他碳源,表明瓦尼桑黃菌體對(duì)蔗糖、葡萄糖、乳糖的利用率較高,但考慮到蔗糖、葡萄糖價(jià)格更為低廉,因此選擇蔗糖和葡萄糖作為正交試驗(yàn)中的碳源.

圖3 不同碳源(a)、氮源(b)對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響

2.2.2 最佳氮源的選擇 圖3b為不同氮源培養(yǎng)基對(duì)核苷產(chǎn)量的影響,從圖可以看出,瓦尼桑黃在含酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉的培養(yǎng)基中均能得到較好的生長(zhǎng),但在含蛋白胨、牛肉膏的培養(yǎng)基中核苷產(chǎn)量更高,因此選擇蛋白胨和牛肉膏作為正交試驗(yàn)中的氮源.

2.2.3 碳源、氮源最佳組合確定 由表4可知,以核苷的產(chǎn)量作為正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),極差值顯示牛肉膏對(duì)核苷產(chǎn)量影響最大,其次是蔗糖,蛋白胨和葡萄糖影響最小.碳氮比最佳組合為A1B2C2D1:葡萄糖15.00 g·L-1,蔗糖20.00 g·L-1,蛋白胨5.00 g·L-1,牛肉膏2.50 g·L-1.

表4 C/N正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

2.2.4 無(wú)機(jī)鹽最佳組合確定 按照表2進(jìn)行正交試驗(yàn),以總核苷的產(chǎn)量為優(yōu)化的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),從表5可以看出4種無(wú)機(jī)鹽對(duì)核苷含量影響從大到小依次為MnSO4、CaCl2、ZnSO4、MgSO4.各因素最佳組合為E2D3F2G1:MgSO41.00 g·L-1,CaCl21.50 g·L-1,ZnSO41.00 g·L-1,MnSO40.50 g·L-1.

表5 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

綜上所述,試驗(yàn)2.2對(duì)瓦尼桑黃產(chǎn)核苷的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選得到了核苷利用率較高的碳源、氮源各兩種,進(jìn)而通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)探究了最適碳氮組合以及最適無(wú)機(jī)鹽組合,結(jié)果表明最優(yōu)培養(yǎng)基配比為:葡萄糖15.00 g·L-1,蔗糖20.00 g·L-1,蛋白胨5.00 g·L-1,牛肉膏2.50 g·L-1,MgSO41.00 g·L-1,CaCl21.50 g·L-1,ZnSO41.00 g·L-1,MnSO40.50 g·L-1.

2.2.5 最佳培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基配比驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)發(fā)酵條件以及最佳培養(yǎng)基配比進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),在最優(yōu)工藝下設(shè)置三組平行試驗(yàn),測(cè)得核苷產(chǎn)量為21.05 ± 0.61 mg·L-1,該試驗(yàn)結(jié)果具有良好的重復(fù)性.

2.3 不同前體物質(zhì)及濃度篩選試驗(yàn)

2.3.1 前體物質(zhì)篩選 利用發(fā)酵法生產(chǎn)核苷時(shí),培養(yǎng)基中含有嘌呤類(lèi)或嘧啶類(lèi)物質(zhì)能夠激活補(bǔ)救途徑,從而直接利用前體物質(zhì)用于產(chǎn)物合成,相比于從頭合成途徑,補(bǔ)救途徑所含的酶促反應(yīng)少,同時(shí)可以有效減少ATP的消耗,更有利于核苷的合成[20].

由表6可知,在培養(yǎng)基中加入各種前體物質(zhì),瓦尼桑黃液體發(fā)酵核苷產(chǎn)量均得到了提升.但加入1.00 g·L-1的腺嘌呤時(shí),核苷產(chǎn)量最高,達(dá)到246.33 ± 7.3 mg·L-1;加入1.00 g·L-1的次黃嘌呤時(shí)核苷產(chǎn)量次之,達(dá)到223.38 ± 5.9 mg·L-1.核苷產(chǎn)量從高到低依次為:腺嘌呤、次黃嘌呤、L-谷氨酸、甘氨酸、DL-天冬氨酸、L-谷氨酰胺.

2.3.2 前體物質(zhì)濃度篩選 圖4為不同濃度腺嘌呤以及次黃嘌呤對(duì)瓦尼桑黃液體發(fā)酵核苷產(chǎn)量的影響.由圖可知,加入次黃嘌呤和腺嘌呤的最佳濃度分別為1.50 g·L-1以及2.50 g·L-1,此時(shí)瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量最高,分別為:247.68 ± 8.8 mg·L-1,281.10 ± 8.3 mg·L-1.

圖4 不同濃度腺嘌呤(a)、次黃嘌呤(b)對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響

2.4 不同調(diào)控因子及濃度篩選試驗(yàn)

2.4.1 調(diào)控因子篩選 如表7所示為七種調(diào)控因子對(duì)瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量的影響.當(dāng)調(diào)控因子添加量為0.50 g·L-1時(shí),丙酮酸鈉組核苷產(chǎn)量最高,其次是槲皮素組.適當(dāng)?shù)谋徕c對(duì)丙酮酸激酶產(chǎn)生抑制作用,因此部分葡萄糖不能通過(guò)糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸,轉(zhuǎn)而進(jìn)入磷酸戊糖途徑,通過(guò)嘌呤核苷酸途徑合成核苷,從而提高了核苷產(chǎn)量[33, 35];槲皮素可以有效抑制XOD(黃嘌呤氧化酶xanthine oxydase)活性,減少了次黃嘌呤的分解,進(jìn)而提高其轉(zhuǎn)化率,此外,6-磷酸葡萄糖脫氫酶、腺苷琥珀酸合成酶與腺苷酸環(huán)化酶活性均得到顯著提高,更多碳流分配到磷酸戊糖途徑用于產(chǎn)物合成[32].綜上所述,選擇丙酮酸鈉和槲皮素進(jìn)行下一步的最佳濃度試驗(yàn)以及正交試驗(yàn).

表7 調(diào)控因子篩選結(jié)果

2.4.2 調(diào)控因子濃度篩選 由圖5可知,加入丙酮酸鈉和槲皮素的最佳濃度分別為3.0 g·L-1以及0.15 g·L-1,此時(shí)瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量最高,分別為:71.94 ± 1.60 mg·L-1、31.03 ± 0.33 mg·L-1.

圖5 不同濃度丙酮酸鈉(a)、槲皮素(b)對(duì)瓦尼桑黃核苷發(fā)酵的影響

2.5 前體及調(diào)控因子正交試驗(yàn)

以核苷的產(chǎn)量為優(yōu)化的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),從表8可以看出4種物質(zhì)對(duì)核苷含量影響從大到小依次為次黃嘌呤、腺嘌呤、槲皮素、丙酮酸鈉.各因素最佳組合為I2J2K3L3:次黃嘌呤1.50 g·L-1,腺嘌呤2.50 g·L-1,丙酮酸鈉3.50 g·L-1,槲皮素0.25 g·L-1.

表8 前體物質(zhì)及調(diào)控因子正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

2.6 最佳條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)發(fā)酵條件以及最佳培養(yǎng)基配比進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),在最優(yōu)條件下設(shè)置三組平行試驗(yàn),測(cè)得核苷產(chǎn)量為291.16 ± 6.21 mg·L-1,驗(yàn)證結(jié)果與2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差較小,試驗(yàn)表明該最優(yōu)條件成功提高了瓦尼桑黃液體發(fā)酵核苷產(chǎn)量且具有良好的重復(fù)性.

2.7 樣品對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率

如圖6分別為發(fā)酵子實(shí)體、優(yōu)化后以及優(yōu)化前的瓦尼桑黃核苷富集產(chǎn)物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,瓦尼桑黃核苷富集產(chǎn)物具有良好的人肝癌HepG2細(xì)胞毒活性.但優(yōu)化后的富集產(chǎn)物活性更好,在5～320 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi),具有濃度依賴(lài)性,抑制率與濃度成正比,當(dāng)樣品濃度為320 μg·mL-1時(shí)抑制率達(dá)67.82%,經(jīng)計(jì)算得其IC50值為76.33 ± 2.38 μg·mL-1.但優(yōu)化前和子實(shí)體的核苷富集產(chǎn)物的抑制效果并不理想,在最高濃度時(shí)抑制率分別為22.41%、50.76%.

3 總結(jié)與討論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合,優(yōu)化了瓦尼桑黃液體發(fā)酵條件以及培養(yǎng)基配比,探討了不同前體物質(zhì)和調(diào)控因子對(duì)核苷產(chǎn)量的影響.實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)發(fā)酵條件為:接種量10%、初始pH=7、培養(yǎng)溫度32 ℃、搖床轉(zhuǎn)速140 r·min-1、培養(yǎng)時(shí)間5 d.最佳培養(yǎng)基組分為:葡萄糖15.00 g·L-1、蔗糖20.00 g·L-1、蛋白胨5.00 g·L-1、牛肉膏2.50 g·L-1、MgSO41.00 g·L-1、CaCl21.50 g·L-1、ZnSO41.00 g·L-1、MnSO40.50 g·L-1、次黃嘌呤1.50 g·L-1、腺嘌呤2.50 g·L-1、丙酮酸鈉3.50 g·L-1、槲皮素0.25 g·L-1.在該最優(yōu)工藝下瓦尼桑黃液體發(fā)酵核苷產(chǎn)量為291.16 ± 6.21 mg·L-1,提高了32.3倍,且該產(chǎn)量高于目前所報(bào)道的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式子實(shí)體的核苷產(chǎn)量.

此外,本論文對(duì)液體發(fā)酵工藝優(yōu)化前后的桑黃核苷類(lèi)成分進(jìn)行了體外細(xì)胞毒活性比較.實(shí)驗(yàn)證明,瓦尼桑黃核苷類(lèi)成分具有良好的抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性,且優(yōu)化后的核苷富集產(chǎn)物活性更好,優(yōu)化后的富集產(chǎn)物對(duì)該細(xì)胞的抑制IC50值為:76.33 ± 2.38 μg·L-1.由此可見(jiàn)發(fā)酵工藝的優(yōu)化不僅提高了瓦尼桑黃的核苷產(chǎn)量,其核苷類(lèi)富集產(chǎn)物的體外細(xì)胞毒活性也得到了提高.

影響微生物發(fā)酵產(chǎn)核苷能力的因素主要有兩個(gè).一方面是隨著核苷的生成,產(chǎn)物的原料以及ATP等能量的供應(yīng)不足,對(duì)于這種情況,外源加入前體物質(zhì),通過(guò)補(bǔ)救途徑進(jìn)行生物合成是一種十分有效的解決方式[30, 40].另一方面,核苷的從頭合成途徑要涉及十步反應(yīng),代謝過(guò)程復(fù)雜,受多種代謝酶以及通路限制[41].因此調(diào)控代謝通路、改變合成途徑中限速酶活性從而提高微生物的產(chǎn)核苷性能,也同樣具有很好的研究意義.從圖7瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量?jī)?yōu)化趨勢(shì)圖可看出,在本實(shí)驗(yàn)中,前體物質(zhì)供應(yīng)不足是制約瓦尼桑黃產(chǎn)核苷性能的關(guān)鍵因素之一.在培養(yǎng)過(guò)程中添加適量的前體物質(zhì)可以使瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量大為提升.因此下一步試驗(yàn)可以深入考察更多前體物質(zhì)以及不同添加方式等對(duì)瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量的影響,使核苷產(chǎn)量進(jìn)一步提高.

圖7 瓦尼桑黃核苷產(chǎn)量?jī)?yōu)化趨勢(shì)圖