兔心肌中次黃嘌呤純化工藝的優(yōu)化

宋 艷，王智鼎，李岳飛，邱 嵐，姜秀梅，孫德軍

(1．吉林大學(xué) 再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 生物技術(shù)藥物教研室，吉林 長春 130021;2．吉林省輝發(fā)制藥股份有限公司，吉林 輝南 135100)

兔心肌中次黃嘌呤純化工藝的優(yōu)化

宋 艷1，王智鼎1，李岳飛1，邱 嵐2，姜秀梅2，孫德軍1

(1．吉林大學(xué) 再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 生物技術(shù)藥物教研室，吉林 長春 130021;2．吉林省輝發(fā)制藥股份有限公司，吉林 輝南 135100)

目的 探索從兔心肌中提取次黃嘌呤的最佳工藝。方法 比較三氟乙酸法、酶解法、酸堿法和醇沉法提取的次黃嘌呤的產(chǎn)率和純度，得到優(yōu)化制備工藝。結(jié)果 利用醇沉法，向細(xì)胞充分破碎后的勻漿液中加入4倍體積的純水，超聲提取，向提取液中加入乙醇至濃度60%，置60℃水浴反應(yīng)120 min，提取的次黃嘌呤產(chǎn)率為0．83 mg/g，純度為82．4%。結(jié)論 經(jīng)過純化工藝比較，醇沉法提取的次黃嘌呤的含量和純度優(yōu)于其他方法。

次黃嘌呤;純化;工藝;優(yōu)化

次黃嘌呤(Hypoxanthine)又稱6-羥基嘌呤，分子式:C5H4N4O，相對分子質(zhì)量為136．11，針狀結(jié)晶，易溶于稀酸和堿，水中溶解度約為1．4 mg/mL(100℃)，熔點(diǎn)＞360℃;次黃嘌呤是一種非常重要的生物嘌呤堿，具有降低血壓、平喘、治療痛風(fēng)等藥理活性，在人體內(nèi)分布廣泛，能夠參與調(diào)節(jié)人體內(nèi)的一些重要生理機(jī)能，還可用于治療各種原因所致的白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥等疾病。

肌氨肽苷由哺乳動物心肌和骨骼肌中提取的次黃嘌呤和多肽組成，但現(xiàn)今許多企業(yè)應(yīng)用到肌氨肽苷生產(chǎn)中的次黃嘌呤，無法生物制備得到，而主要采用添加化學(xué)品次黃嘌呤的方式來解決。國內(nèi)已有從動物組織中提取次黃嘌呤的報道［1-3］，但還未見從兔心中提取次黃嘌呤的相關(guān)報道。

本文主要研究了從家兔的心肌組織中提取次黃嘌呤的工藝，并比較它們之間的優(yōu)缺點(diǎn)，從而選擇產(chǎn)率高、純度好的工藝用于次黃嘌呤的生產(chǎn)。

1 材料

家兔均為大型飼養(yǎng)場圈養(yǎng)，飼養(yǎng)方式主要以食草為主，輔以飼料，屠宰后迅速采集新鮮兔心，棄去脂肪含量高的兔心，選取顏色呈暗紅色，大小適宜的優(yōu)質(zhì)兔心料。

木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司;次黃嘌呤對照品(批號:140661-200402)，中國藥品生物制品檢定所。

LC-100型液相色譜儀(包括LC-UV100紫外可見光檢測器、G1313AALS自動進(jìn)樣系統(tǒng)、LC-P100高壓恒流泵)，WUFENG公司;TDL-40B型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-4802型紫外可見分光光度計，Unico公司。

2 方法

2．1 樣品處理

取新鮮兔心，去除結(jié)締組織和脂肪組織，絞肉機(jī)破碎后，稱重，加入一定量的水勻漿，收集勻漿液，180 Hz超聲波提取30 min，得混懸液。將混懸液在4℃、4 000 r/min離心30 min，取上清，用無紡布粗過濾。將上清液平均分成4份，每份重0．10 kg，體積100 mL。

2．2 提取方法

2．2．1 三氯乙酸法 取上清液100 mL，加水至200 mL，按體積比的0．05%加入三氯乙酸，邊加邊攪拌，溶液變渾濁，放置20 min，4℃，3 800 r/min離心20 min，取上清液檢測黃嘌呤的純度及產(chǎn)率。

2．2．2 酶解法 取上清液100 mL，加熱煮沸，煎煮15 min后，放置降溫至60℃，按質(zhì)量比0．02%加入木瓜蛋白酶，置于60℃水浴保溫3 h，每30 min攪拌一次，3 h后，3 800 r/min離心15 min，取離心液檢測次黃嘌呤的純度及產(chǎn)率。

2．2．3 酸堿法 取上清液100 mL，用10%HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3．5，加熱煮沸，煎煮15 min，室溫放置1 h，冷凍過夜，微熱解凍，用硅藻土過濾，得濾液。用10%NaOH溶液調(diào)節(jié)濾液pH值至8．5，加熱煮沸，煎煮15 min，常溫放置過夜，將分層的組織液用硅藻土過濾，得濾液。用10%HCl溶液調(diào)節(jié)濾液pH值為7．0。檢測次黃嘌呤的純度及產(chǎn)率。

2．2．4 醇沉法 取上清液100 mL，加入乙醇至終濃度為60%，60℃恒溫水浴反應(yīng)2 h，3 800 r/min離心15 min，取上清液檢測次黃嘌呤的純度及產(chǎn)率。

2．3 樣品含量和純度的測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定次黃嘌呤的純度和產(chǎn)率。色譜柱為迪馬公司C18柱(150 mm×4．6 mm)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為 20 μL，檢測波長為250 nm，流動相為0．1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 5．6)，流速為 0．5 mL/min，洗脫時間設(shè)定為 20 min，采用外標(biāo)法計算次黃嘌呤的含量并換算成產(chǎn)率，采用次黃嘌呤峰面積與總面積的比值計算純度。

3 結(jié)果

3．1 不同提取方法的比較

HPLC檢測結(jié)果表明，不同的提取方法得到的次黃嘌呤的產(chǎn)率和純度差異較大，醇沉法的含量和純度較好，結(jié)果見表1。

表1 不同的提取方法得到的次黃嘌呤含量和純度的結(jié)果

3．2 醇沉法的優(yōu)化研究

3．2．1 兔心肌勻漿液加水量的研究 向勻漿液中加入水，加水量從1～5倍體積，加入適量的乙醇液，恒溫反應(yīng)一段時間，3 800 r/min離心15 min，分別取上清液檢測次黃嘌呤的含量。次黃嘌呤的產(chǎn)率分別為0．65，0．68，0．74，0．83 和0．84 mg/g，當(dāng)加入水的體積是勻漿液體積的的4倍時，次黃嘌呤產(chǎn)率較高，加水量的繼續(xù)增加，溶液中次黃嘌呤的產(chǎn)率略微升高，從生產(chǎn)操作方面考慮，兔心肌勻漿液中加水的量確定為4倍。

3．2．2 兔心肌勻漿液乙醇加入量的研究 在反應(yīng)溫度、促進(jìn)次黃嘌呤溶解所需水量、保溫時間等其他條件不變的情況下，向勻漿液中梯度加入乙醇，使乙醇的終濃度為50%，60%，70%和80%，恒溫反應(yīng)一段時間，3 800 r/min離心15 min，分別取上清液檢測次黃嘌呤的含量。次黃嘌呤的產(chǎn)率分別為0．68，0．83，0．83和 0．84 mg/g。結(jié)果表明，較低的乙醇濃度不能夠使次黃嘌呤有效的釋放出來，當(dāng)乙醇的濃度為60%時，溶液中次黃嘌呤的含量達(dá)到較高值，乙醇濃度的繼續(xù)增加，次黃嘌呤的產(chǎn)率增加并不明顯，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，確定乙醇的終濃度為60%。

3．2．3 反應(yīng)溫度的研究 向兔心組織液中加入一定濃度的乙醇溶液后，加熱處理，對反應(yīng)的溫度進(jìn)行了探索，分別設(shè)定反應(yīng)溫度為40，60，80和100℃，保溫一段時間，3 800 r/min離心15 min，分別取上清液檢測次黃嘌呤的含量。次黃嘌呤的產(chǎn)率分別為0．55，0．83，0．84 和 0．84 mg/g。結(jié)果表明，當(dāng)溫度為60℃時，次黃嘌呤的含量達(dá)到較高值，繼續(xù)升高溫度，次黃嘌呤的產(chǎn)率升高并不明顯，從經(jīng)濟(jì)和操作方面考慮，反應(yīng)溫度設(shè)置為60℃。

3．2．4 保溫時間的研究 對濾液加入一定濃度的乙醇溶液后，加熱處理，對保溫時間進(jìn)行了研究，保溫時間分別設(shè)為 0，60，90，120 和 150 min，3 800 r/min離心15 min，分別取上清液檢測次黃嘌呤的含量。次黃嘌呤的產(chǎn)率分別為0．23，0．55 ，0．67，0．83和0．84 mg/g。結(jié)果表明，隨著保溫時間的延長，次黃嘌呤的產(chǎn)率顯著增加，時間為120 min，次黃嘌呤的產(chǎn)率達(dá)到較大值，120 min后，次黃嘌呤的產(chǎn)率無明顯變化，從生產(chǎn)操作和經(jīng)濟(jì)方面考慮，把保溫時間設(shè)定為120 min。

4 討論

取加入4倍體積水勻漿的兔心組織液上清液100 mL，加入乙醇至終濃度為60%，60℃恒溫水浴，反應(yīng)2 h，3 800 r/min離心15 min，取上清液檢測次黃嘌呤的純度為82．4%，含量為0．83 mg/g。

從兔心肌中提取次黃嘌呤的過程中，得到能最大限度提取次黃嘌呤的控制點(diǎn)，即在細(xì)胞充分的破碎后次黃嘌呤完全釋放，再在絞碎后的組織勻漿液中加入4倍體積的純水，乙醇的濃度控制在60%，60℃水浴120 min，次黃嘌呤的產(chǎn)率最高，較報道的從其他動物組織中提取次黃嘌呤的方法簡便，可操作性強(qiáng)，是一種適于工業(yè)化生產(chǎn)的新工藝。

［1］ 王夢月，韋竟斐，史海明，等．HPLC法測定海龍中胸腺嘧啶、次黃嘌呤、尿嘧啶的含量［J］．中國中藥雜志，2010，35(17):2277-2280．

［2］ 王翠麗，王 永，徐亞歐，等．山羊、藏系綿羊和黃牛肉中次黃嘌呤核苷酸含量比較［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49(11):2860-2863．

［3］ 周 冉，李淑芬．RP-HPLC同時快速測定鹿茸中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷含量［J］．藥物分析雜志，2009，29(4):575-578．

Optimization of rabbit myocardial hypoxanthine purification process

SONG Yan1，WANG Zhi-ding1，LI Yue-fei1，QIU Lan2，JIANG Xiu-mei2，SUN De-jun1
(1．Department of Biomedicine，Institute of Frontier Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China;2．Huifa Pharmaceutial Co．，Ltd．，Jilin Province，Huinan 135100，China)

Purpose To investigate the content of the different extraction methods of preparation of rabbit myocardial tissue fluid hypoxanthine，to determine the hypoxanthine optimal purification process．Methods Determination of the Trifluoroacetic acid method，enzymatic，ethanol and acid-base extraction hypoxanthine content and purity．Results The tissue fluid too the cells fully broken in four times the volume of pure water，adding ethanol to a concentration of 60%water bath at 60 ℃ for 2 h，extracted hypoxanthine content of 1．410 mg/mL．Conclusion The purification process，compared to the content and purity of the alcohol precipitation extracted hypoxanthine is superior to other methods．

hypoxanthine;purification;process;optimization

TQ464．5

A

1005-1678(2012)06-0839-03

2012-07-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)(2006AA020503)

宋 艷，女，碩士研究生;孫德軍，通信作者，Tel:0431-85619233，E-mail:sundjjl@yahoo．com．cn。