高效液相色譜法同時測定胃特安片中4 種成分含量*

徐 蘭，李 剛，彭 秘，肖漢揚，胡文弋，陳昊東，劉碧瑩，張增珠

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院，江西 南昌 330002）

胃特安片為醫(yī)院制劑，由枳實、澤瀉、白術(shù)、川芎、厚樸、半夏、陳皮、黃柏8味中藥材組方，具有和胃止痛、健脾消食、安神寧心等功效，臨床主要用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎等疾病［1］。方中，枳實具有破氣消積、化痰散痞等功效［2］，被廣泛應(yīng)用于治療心血管、胃腸道等疾病，其有效成分為辛弗林［3］；澤瀉具有利水滲濕、泄熱、化濁調(diào)脂等功效，可用于治療小便不利、水腫脹滿、泄瀉尿少、高脂血癥等［4］，其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C［5］；陳皮可理氣健脾、燥濕化痰，主要活性成分為橙皮苷［6］。枳實和澤瀉為君藥，但目前尚未對兩藥的主要成分進(jìn)行含量測定，無法有效控制胃特安片的質(zhì)量。胃特安片含有多種中藥材，不同組分間協(xié)同發(fā)揮藥效，基質(zhì)、成分較復(fù)雜。為提高檢測準(zhǔn)確度，參考文獻(xiàn)［2-16］，以及2020年版《中國藥典（一部）》中枳實［7］258、澤瀉［7］239和陳皮［7］199含量測定項下的指標(biāo)性成分，本研究中建立了同時測定胃特安片中辛弗林、橙皮苷、23 - 乙酰澤瀉醇B 和23-乙酰澤瀉醇C 4 種成分含量的高效液相色譜法，旨在提高胃特安片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 16 型高效液相色譜儀［配有LC - 16 型泵，SPD-M40型二極管陣列（DAD）檢測器］，AUW220D型電子分析天平（精度為十萬分之一），均購自日本Shimadzu公司；KM - 410C 型智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司，功率為220 W，頻率為70 kHz）；AZJ-2002-C型超純水儀（美國Millipore 公司）；DFT - 50 型手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；DK -98 - ⅡA 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；TGL-16C 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

辛弗林對照品（批號為110727 - 202110，含量為99.8%），橙皮苷對照品（批號為110721-202220，含量為97.2%），23-乙酰澤瀉醇B對照品（批號為111846-202006，含量為98.3%），23-乙酰澤瀉醇C 對照品（批號為112062 - 202102，含量為99.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純，西隴化工股份有限公司）；庚烷磺酸鈉（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號為39083，含量為99.9%）；胃特安片（醫(yī)院自制，批號分別為20220218，20220516，20220722，規(guī)格為每片0.4 g）；水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Intersil ODS - 3 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈，B為磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀0.6 g，庚烷磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1 000 mL），梯度洗脫（0～7 min 時12%A，7～14 min 時12%A →75%A，14～20 min 時75%A →90%A，20～25 min 時90%A，25～30 min 時90%A →12%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm（0～7 min，辛弗林），283 nm（7～10 min，橙皮苷），246 nm（10～20 min，23-乙酰澤瀉醇C），208 nm（20～30 min，23-乙酰澤瀉醇B）；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取辛弗林對照品8.300 6 mg、橙皮苷對照品9.432 7 mg、23-乙酰澤瀉醇B對照品7.328 6 mg、23-乙酰澤瀉醇C對照品4.451 6 mg，精密稱定，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.828 4，0.916 9，0.720 4，0.441 6 mg/mL 的對照品貯備液；分別精密量取上述對照品貯備液各0.5 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為16.57，18.34，14.41，8.83 μg/ mL 的混合對照品溶液。取樣品適量，粉碎，取細(xì)粉（過60 目篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率為220 W，頻率為70 kHz）處理60 min，靜置并冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為5 000 r/min）10 min，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按處方工藝分別制備缺澤瀉、枳實和陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果4 種成分的色譜峰分離度大于1.5，理論板數(shù)均大于3 000，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

1.辛弗林 2.橙皮苷 3.23 - 乙酰澤瀉醇C 4.23 - 乙酰澤瀉醇BA.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C - E.陰性對照品溶液（分別缺枳實、澤瀉、陳皮）圖1 高效液相色譜圖1.Synephrine 2.Hesperidin 3.Alisol C 23 - acetate 4.Alisol B 23 - acetateA.Mixed reference solution B.Test solution C - E.Negative reference solution（lacking Aurantii Fructus Immaturus，Alismatis Rhizoma，and Citri Reticulatae Pericarpium，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項下4種成分的對照品貯備液0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，各待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得各待測成分的回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 6）

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液和供試品溶液各20 μL，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果混合對照品溶液中辛弗林、橙皮苷、23 - 乙酰澤瀉醇B 和23 - 乙酰澤瀉醇C 峰面積的RSD分別為1.68%，2.47%，1.02%，1.41%（n= 6），供試品溶液中以上4 種成分峰面積的RSD分別為0.85%，1.94%，1.35%，0.92%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液適量，分別于室溫放置0，2，4，6，8，12 h 時按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果辛弗林、橙皮苷、23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C 峰面積的RSD分別為3.48%，2.86%，3.81%，4.24%（n= 6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為20220516）6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果辛弗林、橙皮苷、23 - 乙酰澤瀉醇B 和23 - 乙酰澤瀉醇C 的含量分別為0.414 0，0.457 8，0.357 3，0.219 5 mg/ g，RSD分別為2.92%，2.80%，3.02%，3.95%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知4 種成分含量的樣品（批號為20220516）適量，粉碎（過60目篩），取細(xì)粉1.0 g，精密稱定，分別精密加入4 種成分對照品貯備液各500 μL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 樣品含量測定

取樣品（批號分別為20220218，20220516，20220722）適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算樣品中4 種成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中4種成分含量測定結(jié)果（mg/片）Tab.3 Results of the content determination of four components in Weite'an Tablets（mg / tablet）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

全波長范圍掃描4 種化合物，辛弗林、橙皮苷、23-乙酰澤瀉醇B 和23 - 乙酰澤瀉醇C 分別于275，283，208，246 nm 波長處有明顯吸收，差異較大，雜質(zhì)干擾較少。采用DAD 檢測器實時掃描功能，獲得所有波長下的色譜圖和即時色譜圖，可提高檢測效率，實現(xiàn)了在同一色譜條件下4 種活性成分最大吸收波長處同時測定含量的目的。

3.2 流動相選擇

因辛弗林為含氮生物堿類化合物［3］，極性較強(qiáng)，一般流動相系統(tǒng)中不易在色譜柱上保留，如前期試驗考察乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水等流動相系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)，辛弗林在色譜柱上呈極弱保留，且保留時間很不穩(wěn)定。在乙腈- 磷酸二氫鉀溶液中加入離子對試劑庚烷磺酸鈉后，辛弗林在色譜柱上的保留時間延長，穩(wěn)定性較好，且胃特安片中其他組分未產(chǎn)生明顯干擾，故本研究中選擇2.1項下流動相系統(tǒng)。

3.3 提取溶劑與方法選擇

本研究中考察了不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、乙腈、2%冰醋酸溶液對待測成分提取效果的影響，結(jié)果顯示，酸性溶劑提取后測得樣品中辛弗林的含量最高，這可能是由于辛弗林屬生物堿類化合物［8］，在酸性溶劑中可成鹽而增加了溶解度，但其他3種成分的含量非常低。不同提取溶劑中，4種成分總含量從大到小依次為甲醇、75%甲醇溶液、50%甲醇溶液、2%冰醋酸溶液、乙腈。4 種成分結(jié)構(gòu)中均含有羥基，在醇溶液中有較高的溶解度，綜合考慮后選擇甲醇為提取溶劑。曾考察不同提取方法（回流、超聲）和提取時間（30，60，90 min）對待測成分提取效果的影響，結(jié)果顯示，超聲提取法效果優(yōu)于回流提取法。超聲提取法有利于甲醇滲透穿過枳實、澤瀉和陳皮的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，能很好地將4種成分同時溶出，提取率較高，且操作簡便；超聲提取時間越長，提取效果越好，但超聲處理60 min和90 min 所測得4 種成分的含量無顯著差異。故最終選擇2.2項下供試品溶液的制備方法。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于胃特安片中多種成分含量的同時測定。