新型冠狀病毒疫苗受體結(jié)合域抗原含量檢測(cè)方法建立*

何 歡，李文東，李玉立，邵天舒，梅 婕，李 瀟

（北京市藥品檢驗(yàn)研究院·北京市疫苗檢驗(yàn)中心·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

高致病性人類冠狀病毒嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）-CoV、中東呼吸綜合征（MERS）-CoV、新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）嚴(yán)重威脅人類健康，分別引起SARS、MERS 和新型冠狀病毒肺炎（COVID - 19）［1-2］。SARS-CoV 于2003 年全球大流行，病死率約為9.56%（774/ 8 098）［3］。MERS - CoV 于2012 年在沙特阿拉伯首次報(bào)道，而后在27 個(gè)國(guó)家/ 地區(qū)流行，病死率約為34.40%（858/ 2 494）［4］。SARS - CoV - 2 于2019 年暴發(fā)，并在全球迅速傳播［1］。與SARS-CoV和MERS-CoV相比，SARS-CoV - 2 造成的感染、死亡和經(jīng)濟(jì)破壞更大［2］。新型冠狀病毒疫苗（簡(jiǎn)稱新冠疫苗）已上市及后續(xù)研發(fā)涉及品種多、用量大，給藥品監(jiān)管部門帶來了挑戰(zhàn)。因此，建立通用性更強(qiáng)的方法、提高新冠疫苗的檢驗(yàn)效率迫在眉睫。新型冠狀病毒（簡(jiǎn)稱新冠病毒）和其他新出現(xiàn)的致病性人類冠狀病毒的基因組編碼4 個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白［棘突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣殼（N）］、16 種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp 1 - 16）和5～8 種輔助蛋白。其中，S 蛋白可進(jìn)一步分為N- 末端結(jié)構(gòu)域（NTD）和受體結(jié)合域（RBD），在病毒附著中起融合、進(jìn)入和傳播作用［5］。冠狀病毒S蛋白的RBD必須先與宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)合［6-7］。國(guó)內(nèi)的新冠疫苗主要為新冠滅活疫苗和新冠重組亞單位疫苗，其中國(guó)內(nèi)上市的新冠重組亞單位疫苗基于RBD 蛋白為免疫靶點(diǎn)［8］，新冠滅活疫苗攜帶整個(gè)新冠病毒蛋白，故RBD 蛋白是目前新冠疫苗體外檢測(cè)的理想通用靶點(diǎn)。目前，各個(gè)新冠疫苗生產(chǎn)企業(yè)均用不同來源的抗體進(jìn)行體外效力檢測(cè)，對(duì)目的抗原也無統(tǒng)一的檢測(cè)方法。本研究中擬通過建立通用的新冠疫苗RBD 抗原的體外檢測(cè)方法，檢測(cè)不同技術(shù)路線新冠疫苗的目的抗原含量，為后續(xù)其他技術(shù)路線的新冠疫苗提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Multiskan Sky型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

1.2 試藥

新冠滅活疫苗（Vero細(xì)胞，X公司和Y公司各10批）；新冠重組亞單位疫苗（CHO 細(xì)胞，Z 公司5 批）；SARSCoV - 2（2019 - nCoV）Spike RBD 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）Kit試劑盒（Sino Biological，Cat號(hào)為KIT40592，批號(hào)分別為CW15OC2701，CW16MA1401，CW16JU1402），配有包被上嵌合抗SARS - CoV - 2（2019 - nCoV）Spike RBD 的酶標(biāo)板，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的SARS -CoV - 2（2019 - nCoV）Spike RBD 探測(cè)抗體（質(zhì)量濃度為0.2 mg/ mL），SARS - CoV - 2（2019 - nCoV）Spike RBD 重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度為30 ng/mL），20 倍洗滌液（每瓶25 mL），20 倍稀釋液（每瓶8 mL），標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（2 mL）；顯色液A（Cat號(hào)為5120-0048），顯色液B（Cat號(hào)為5120-0037），均購自美國(guó)Sera Care公司。

2 方法

2.1 溶液制備

洗滌液：用純化水將20倍洗滌液稀釋20倍。

終止液：向適量純化水中加入硫酸55 mL，用純化水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。

稀釋液：用純化水將20倍稀釋液稀釋20倍。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1 mL，置標(biāo)準(zhǔn)品安瓿瓶中，溶解，即得質(zhì)量濃度為30 000 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液；用稀釋液將其定量稀釋至質(zhì)量濃度分別為250，125，62.5，31.25，15.62，7.81 pg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液：取X 公司樣品，將樣品和X 解吸附劑按1∶1 混勻，室溫反應(yīng)1 h，每20 min 振蕩混勻，用稀釋液稀釋1 倍，即得供試品溶液X。取Y 公司樣品，將樣品和Y解吸附劑按1∶1混勻，室溫解離（轉(zhuǎn)速為180 r/min）1 h，用稀釋液稀釋1 倍，即得供試品溶液Y。取Z 公司樣品，將樣品和Z 解吸附劑按1∶1 混勻，37 ℃水浴30 min，取10 μL，置990 μL稀釋液中，混勻；取10 μL，置990 μL稀釋液中，混勻；取100 μL，置1.9 mL 稀釋液中，混勻，即得供試品溶液Z。

2.2 方法

檢測(cè)方法：實(shí)驗(yàn)前，將試劑盒內(nèi)所有組分和待測(cè)樣本溫度恢復(fù)至室溫，將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和空白對(duì)照（稀釋液）按每孔100 μL 分別加入酶標(biāo)板，3 個(gè)復(fù)孔，室溫孵育2 h，洗滌液洗滌3 次，拍干；按每孔100 μL 加入工作濃度檢測(cè)抗體，室溫孵育1 h，洗滌液洗滌3 次，拍干；按每孔50 μL分別加入顯色液A和B，室溫避光孵育20 min，每孔加入50 μL 終止液。5 min 內(nèi)讀取450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

計(jì)算方法：將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值減去空白對(duì)照吸光度值，得到吸光度校正值。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品吸光度校正值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=a X+b，決定系數(shù)（R2）≥0.99。根據(jù)曲線計(jì)算樣品質(zhì)量濃度，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得樣品RBD抗原含量。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察和定量下限：取2.1項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算R2，并測(cè)定校正標(biāo)樣后回算得出的質(zhì)量濃度，重復(fù)3次。結(jié)果3次試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.996 6，0.995 8，0.997 5（表1）；以6 個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定校正標(biāo)樣后回算得出的質(zhì)量濃度均在± 15%內(nèi)，符合2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則9012 相關(guān)要求［9］。該方法的定量下限為7.81 pg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，用稀釋液定量稀釋至質(zhì)量濃度分別為200，150，60，7.81 pg/mL，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定校正濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度在同一酶標(biāo)板上重復(fù)測(cè)定6次；或取3批（批號(hào)分別為CW150C2701，CW16MA1401，CW16JU1402）標(biāo)準(zhǔn)品，按2.1 項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2項(xiàng)下方法于3 d內(nèi)測(cè)定，每天每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定6 次。用校正濃度除以標(biāo)示濃度，計(jì)算批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度，準(zhǔn)確度（%）=測(cè)得值/真實(shí)值×100%，并計(jì)算測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（變異系數(shù)）。結(jié)果顯示，該方法的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度均值均在質(zhì)控標(biāo)示值的±15%內(nèi)，變異系數(shù)均在±10%內(nèi)，均符合2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則9012 相關(guān)要求［9］，表明儀器精密度良好。詳見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the precision test（n = 6）

稀釋可靠性試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，用稀釋液定量稀釋至質(zhì)量濃度分別為150，75，37.5 pg/mL，按2.2 項(xiàng)下方法測(cè)定，各濃度于同1 d 內(nèi)重復(fù)測(cè)定6 次或3 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果顯示，該方法的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度均值均在質(zhì)控標(biāo)示值的± 15%內(nèi)，變異系數(shù)均在±10%內(nèi)，均符合2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則9012相關(guān)要求［9］，表明稀釋可靠性良好。詳見表3。

表3 稀釋可靠性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the diluted stability test（n = 6）

加樣回收試驗(yàn)：取X，Y，Z 公司樣品，按2.1 項(xiàng)下方法處理，將X 公司樣品批次2 處理后的樣品X 和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為100 pg/ mL）等體積混勻，將Y 公司樣品批次1 處理后的樣品Y 和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為200 pg/ mL）等體積混勻，將Z 公司樣品批次3 處理后的樣品Z 和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為125 pg/mL）等體積混勻，按2.2 項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3 次。結(jié)果見表4。

表4 不同企業(yè)新冠疫苗加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（%）Tab.4 Results of the recovery test for COVID - 19 vaccines developed by different companies（%）

2.4 樣品含量測(cè)定

取X，Y，Z公司的10批、10批、5批樣品，分別按2.1項(xiàng)下方法處理，按2.2 項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果平均含量分別為302.96 pg/ mL、1 010.80 pg/ mL、42.92 μg/ mL。詳見圖1。

A.X公司 B.Y公司 C.Z公司圖1 新冠重組疫苗RBD蛋白含量測(cè)定結(jié)果A.Company X B.Company Y C.Company ZFig.1 Determination results of RBD protein content of COVID - 19 recombinant vaccine

3 討論

在SARS，MERS，COVID-19 中，S 蛋白在受體結(jié)合和膜融合方面起著至關(guān)重要的作用。S 蛋白含有RBD，可特異性識(shí)別ACE2 作為其受體［8，10-11］。S 蛋白的RBD是進(jìn)入病毒宿主細(xì)胞受體對(duì)接所必需的，也就是“鎖芯”部位［4，6-7］。全長(zhǎng)S 蛋白及其抗原片段包括S1亞基、NTD、RBD 和S2亞基，可作為亞單位疫苗研制的重要靶點(diǎn)［10］。目前，基于RBD 的亞單位疫苗已有很多報(bào)道［4］。國(guó)內(nèi)上市的重組新冠疫苗（5 型腺病毒載體）也是基于新冠病毒S蛋白開發(fā)［8］。

本研究中建立了測(cè)定新冠疫苗RBD 抗原含量的方法，所用抗體為重組RBD 單克隆抗體，制備較簡(jiǎn)單，且采用的抗體為HRP 標(biāo)記的SARS - CoV - 2（2019 -nCoV）Spike RBD，可直接顯色，無需再加入酶標(biāo)二抗。用HRP 標(biāo)記的一抗可簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，從而提高檢驗(yàn)效率。本方法可作為新冠疫苗體外效力評(píng)價(jià)的手段。

新冠滅活疫苗中有新冠病毒的全蛋白，國(guó)內(nèi)上市的新冠重組亞單位疫苗基于RBD 蛋白為免疫靶點(diǎn)。故選擇S 蛋白的RBD 作為新冠滅活疫苗目的抗原的檢測(cè)對(duì)象。新冠重組亞單位疫苗采用體內(nèi)效力檢測(cè)法的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)操作周期長(zhǎng)，個(gè)體差異對(duì)結(jié)果影響較大，且需遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理準(zhǔn)則。故采用簡(jiǎn)便、有效的目的抗原檢驗(yàn)作為輔助，有助于提高檢驗(yàn)效率［12-15］，全方位評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。該方法可用于重組亞單位疫苗目的抗原的檢測(cè)。

疫苗目的抗原是效力的決定性指標(biāo)之一，且佐劑與疫苗同等重要，故目的抗原的測(cè)定不能作為疫苗效力的唯一決定性因素。如Z 公司目的抗原含量很高，主要是因?yàn)閆 公司為重組蛋白疫苗，全病毒蛋白的免疫原性會(huì)強(qiáng)于部分蛋白亞基的免疫原性。本研究中建立的方法得到的RBD 抗原含量和Z 公司的藥品說明書基本一致。

該方法可實(shí)現(xiàn)用一致的靶點(diǎn)和方法檢測(cè)新冠滅活疫苗和重組亞單位疫苗的目的抗原。通過查詢國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站，已上市新冠疫苗主要包括滅活疫苗、亞單位疫苗、腺病毒載體疫苗等。國(guó)內(nèi)上市的新冠腺病毒載體疫苗是以新冠病毒S 蛋白為免疫對(duì)象，而S 蛋白包括RBD 蛋白。因此，該方法理論上可用于新冠腺病毒載體疫苗目的抗原的體外檢測(cè)。后期將采用新建的ELISA 法進(jìn)行新冠腺病毒載體疫苗目的抗原體外檢測(cè)，以實(shí)現(xiàn)更多新冠疫苗品種在檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)靶點(diǎn)上的統(tǒng)一，進(jìn)一步提高檢驗(yàn)效率。

綜上所述，所建立的新冠病毒疫苗多種技術(shù)路線適用于目的抗原檢測(cè)，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合相關(guān)要求，能顯著提高檢測(cè)效率。