基于信息熵賦權(quán)法的L（934）正交試驗(yàn)優(yōu)選治痤方水提工藝*

過其玲，韓曉珂

（安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000）

治痤方由酒黃芩、丹參、夏枯草等12 味中藥材組方，具有清瀉肺熱、化濕通腑功效，臨床用于治療熱毒性濕疹、痤瘡等癥，療效確切，安全性高［1］。該制劑為傳統(tǒng)院內(nèi)制劑，申報(bào)之初由于條件和技術(shù)的限制，并未對(duì)其提取工藝進(jìn)行深入研究。正交試驗(yàn)廣泛用于制劑生產(chǎn)工藝的優(yōu)化［2-4］，但其評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重分配多為主觀判斷，具有較大局限性。信息熵是系統(tǒng)有序化程度的度量；系統(tǒng)有序化程度越高，信息熵越小，評(píng)價(jià)作用越大，權(quán)重系數(shù)越大［5-6］。擬對(duì)該制劑的提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步研究，減少主觀因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究中以黃芩苷、丹酚酸B 的含量及浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用信息熵賦權(quán)法結(jié)合L9（34）正交試驗(yàn)考察提取次數(shù)、加水量及提取時(shí)間對(duì)治痤方有效成分的影響，優(yōu)選最佳水提工藝，為治痤方標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和質(zhì)量研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 - 2489 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；AL-204型電子天平（精度為萬分之一），XP-205型電子天平（精度為十萬分之一），均購自瑞士Mettler Toledo 公司；GZX-9140 MBE 型干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；KQ - 500DB 型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；UPS-11-10T型純水機(jī)（成都優(yōu)普凈化科技有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715 - 201821，含量為95.4%），丹酚酸B 對(duì)照品（批號(hào)為111562 - 201716，含量為94.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定［7-11］

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈- 0.1%磷酸溶液（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm（0 ～19 min 時(shí)黃芩苷），286 nm（19～30 min 時(shí)丹酚酸B）［7-11］；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

取黃芩苷、丹酚酸B對(duì)照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制得質(zhì)量濃度為0.392 2，0.337 0 mg/mL的對(duì)照品貯備液；精密量取各對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，得質(zhì)量濃度為78.44，67.40 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。精密量取正交試驗(yàn)5 樣品貯備液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。按治痤方工藝制備缺酒黃芩、丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下3 種溶液各10 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液和混合對(duì)照品溶液色譜圖中各成分分離良好，且陰性對(duì)照無干擾，表明方法專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖1。

1.黃芩苷 2.丹酚酸BA.混合對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C-D.陰性對(duì)照品溶液（分別缺丹參、酒黃芩）圖1 高效液相色譜圖1.Baicalin 2.Salvianolic acid BA.Mixed reference solution B.Test solution C - D.Negative reference solution（lacking Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma and wine - processed Scutellariae Radix，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.1.2項(xiàng)下各對(duì)照品貯備液0.4，0.8，1.6，2.4，3.2，4.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得黃芩苷質(zhì)量濃度為15.688，31.376，62.752，94.128，125.504，156.880 μg/mL，丹酚酸B 質(zhì)量濃度 為13.480，26.690，53.920，80.880，107.840，134.800 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以待測(cè)成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y黃=39 565X黃-80 256（R2=1.000 0，n=6），Y丹=9 001.4X丹-34 708（R2=0.999 6，n=6）。結(jié)果表明，黃芩苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別在15.688～156.880 μg/mL、13.480～134.800 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限與定量限確定：精密量取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比（S/N）為3 倍和10 倍時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果黃芩苷和丹酚酸B的檢測(cè)限分別為7.844，0.121 μg/ mL，定量限分別為25.101，0.404 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷和丹酚酸B 峰面積的RSD分別為0.44%和0.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷和丹酚酸B 峰面積的RSD分別為0.87%和1.22%（n= 6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取正交試驗(yàn)5樣品貯備液1 mL，依法制備供試品溶液6 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果黃芩苷和丹酚酸B含量的RSD分別為0.76%和0.73%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取正交試驗(yàn)5 樣品貯備液0.5 mL，共6 份，分別置25 mL 容量瓶中，依次加入黃芩苷對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.392 2 mg/mL）2.5 mL 和丹酚酸B 對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.337 0 mg/ mL）3.1 mL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果黃芩苷和丹酚酸B 的平均加樣回收率分別為99.38% 和101.57%，RSD分別為1.40%和1.33%（n=6）。

2.2 浸膏得率測(cè)定

精密量取各樣品貯備液25 mL，置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h，干燥器中冷卻0.5 h，立即精密稱定其質(zhì)量。浸膏得率（%）=浸膏量×（貯備液總量/ 取樣量）/ 生藥投入量×100%［12-13］。

2.3 L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選水提工藝

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果：按L9（34）正交試驗(yàn)表試驗(yàn)，以提取次數(shù)（A）、加水量（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素［14］，結(jié)合信息熵理論對(duì)黃芩苷、丹酚酸B含量及浸膏得率進(jìn)行矩陣處理，得各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重指數(shù)，并計(jì)算綜合評(píng)分［15-16］。因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of the L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

信息熵賦值與方差分析：參考文獻(xiàn)［17］，將黃芩苷、丹酚酸B 含量及浸膏得率建立原始矩陣（X）；根據(jù)公式Pij=Xij/∑Xij（式中，i為評(píng)價(jià)指標(biāo)，j為第j次試驗(yàn)），將原始矩陣（X）轉(zhuǎn)化為概率矩陣（P）；根據(jù)公式Hi=（式中，n為試驗(yàn)次數(shù)）計(jì)算各指標(biāo)的信息熵（Hi），結(jié)果分別為0.975 1，0.980 2，0.981 0；再根據(jù)公式（式中，m為指標(biāo)個(gè)數(shù)）計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)（Wi），結(jié)果分別為0.390 9，0.310 8，0.298 3。由公式綜合評(píng)分= Xi黃/Xmax黃×0.390 9 +Xi丹/Xmax丹× 0.310 8 +Xi得率/Xmax得率×0.298 3計(jì)算綜合評(píng)分。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of the ANOVA

結(jié)果分析：信息熵賦權(quán)法確定各指標(biāo)的權(quán)重由大至小為黃芩苷含量> 丹酚酸B 含量> 浸膏得率；各因素對(duì)綜合指標(biāo)的影響由大至小為A > B > C，即提取次數(shù)> 加水量> 提取時(shí)間；因素A 對(duì)綜合評(píng)分的影響顯著（P<0.05），表明提取次數(shù)對(duì)治痤方的提取效果有顯著影響，因素B 和因素C 的影響不顯著。綜合分析各因素的3 個(gè)水平，得到最佳提取條件為A3B3C2，即加10 倍量水，提取3次，每次1.5 h。

驗(yàn)證試驗(yàn)：按處方稱取3 份藥材，按優(yōu)選工藝平行試驗(yàn)3 次，分別計(jì)算黃芩苷和丹酚酸B 的含量、浸膏得率及綜合評(píng)分。結(jié)果見表4，表明該提取工藝穩(wěn)定、可靠。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the verification test

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，痤瘡雖發(fā)病于體表，但病因病機(jī)與五臟六腑關(guān)系密切，多為肺經(jīng)風(fēng)熱及脾胃濕熱［18］。方中，枇杷葉、酒黃芩宣肺氣、清肺熱，共為君藥。臣藥丹參清熱涼血、消癰排膿，助君藥清血熱之毒；金銀花疏散上焦熱毒，梔子清三焦?jié)駸嶂?，兩者共清郁熱；桑白皮利肺氣，合枇杷葉一宣一降。佐藥丹皮、赤芍涼血，夏枯草清熱散結(jié)，薏苡仁、大黃健脾清濕熱，杜絕肺脾濕熱之本。甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。全方合用，共奏清泄熱毒、化濕通腑之功。一項(xiàng)痤瘡中醫(yī)藥用藥規(guī)律統(tǒng)計(jì)研究表明，清熱藥和活血化瘀藥頻數(shù)最多，以黃芩和丹參為首［19］，與本方用藥特點(diǎn)一致。

黃芩具有抗菌、抗炎、影響皮脂腺的作用，治療痤瘡優(yōu)勢(shì)明顯［20］。黃芩苷為其含量最高的指標(biāo)性成分［21］，具有很強(qiáng)的抗炎活性［22］，能顯著降低兔耳痤瘡的炎性因子水平［23］。丹參具有祛瘀止痛、涼血消癰功效［24］，其主要活性成分為水溶性成分丹酚酸類及脂溶性成分丹參酮類，抗氧化、抗菌消炎作用顯著［25］。治痤方成分復(fù)雜多樣，評(píng)價(jià)其質(zhì)量不能僅限于單一成分的研究，故本研究中通過多指標(biāo)綜合評(píng)分篩選最佳提取工藝。根據(jù)本方主要藥味的活性成分及其藥理作用，結(jié)合制劑生產(chǎn)工藝，選擇黃芩苷和丹酚酸B為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

參考2020年版《中國藥典（一部）》中關(guān)于黃芩苷和丹酚酸B含量測(cè)定的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在丹酚酸B色譜條件下，通過調(diào)整流動(dòng)相的比例可較好地分離上述2 種成分，出峰時(shí)間合適，且峰形較好。為盡可能地減小積分誤差，本研究中選擇可變紫外波長(zhǎng)檢測(cè)器，以便設(shè)定目標(biāo)成分的最大吸收波長(zhǎng)，最終確定文中色譜條件。

近年來，信息熵賦權(quán)法在醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，利用其對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行客觀賦權(quán)，有效避免了人為因素對(duì)結(jié)果的影響。但該方法對(duì)各指標(biāo)的賦權(quán)結(jié)果靈活性較差，無法反映指標(biāo)的重要程度，可能會(huì)造成主要成分權(quán)重系數(shù)較低或非主要成分權(quán)重系數(shù)較高，在實(shí)際使用過程中應(yīng)根據(jù)情況確定是否聯(lián)用其他賦權(quán)法。

綜上所述，采用信息熵賦權(quán)法結(jié)合L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選的治痤方水提工藝為加10 倍量水，提取3 次，每次1.5 h。該水提工藝穩(wěn)定可行、重復(fù)性好，可為治痤方的提取工藝和質(zhì)量研究提供參考。