高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定人血漿中加巴噴丁和普瑞巴林濃度*

李銀洛，唐才林，盛長城，陳 宇，龍興震，白 雪△

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002； 2.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002）

帶狀皰疹后神經(jīng)痛（PHN）是帶狀皰疹的常見并發(fā)癥，疼痛劇烈，常用藥物非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥的療效均不理想。加巴噴丁和普瑞巴林是治療PHN 的一線藥物，但對50%的患者治療無效或療效欠佳［1-2］。據(jù)報道，加巴噴丁和普瑞巴林的個體間血藥濃度差異大［3-4］，其血藥濃度與臨床療效、不良反應(yīng)存在相關(guān)性［5］。部分國家要求對服用加巴噴丁和普瑞巴林的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測［6］，但我國尚未見相關(guān)報道。在PHN 的臨床藥物治療中，常用治療方案為當(dāng)加巴噴丁治療無效時換用普瑞巴林或普瑞巴林治療無效時換用加巴噴丁，并非同時使用。有研究報道，兩藥聯(lián)用可提高治療有效率，減少不良反應(yīng)和用藥劑量［7-9］。加巴噴丁和普瑞巴林的血藥濃度監(jiān)測可為評估PHN 患者的給藥劑量、血藥濃度與療效和不良反應(yīng)的相關(guān)性提供參考，提高PHN 藥物治療的有效性和安全性。目前，加巴噴丁和普瑞巴林的血漿藥物濃度測定方法有高效液相色譜法［10-11］、液相色譜- 熒光法［12-13］和液相色譜-質(zhì)譜法［14-15］等但兩藥均無紫外吸收，需進(jìn)行柱前衍生化，導(dǎo)致血漿樣品前處理復(fù)雜，檢測時間長，同時測定兩藥血藥濃度的方法尚未見報道。為此，本研究中建立了同時測定血漿中加巴噴丁和普瑞巴林濃度的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法，以期為提高臨床治療PHN 的有效率及個體化藥物治療提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB SCIEX 3500 型高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB Sciex公司），操作軟件工作站為Analyst 1.6.3；AL204 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo，精度為萬分之一）；TGL - 16WC 型高速臺式冷凍離心機(jī)（長沙湘銳離心機(jī)有限公司）；XH - B 型渦旋混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）。

1.2 試藥

加巴噴丁對照品（批號為100655-201903，含量為99.8%），普瑞巴林對照品（批號為101106-202003，含量為99.4%），茶堿對照品（批號為100121-201805，含量為99.9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（HPLC 級），甲醇（LC 級），均購于美國Tedia 公司；甲酸（LC級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；空白血漿取自志愿者；純凈水（華潤怡寶飲料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

預(yù)柱：Phenomenex Security GuardTMULTRA 柱；色譜柱：Phenomenex Luna?Omega C18柱（50 mm × 2.1 mm，1.6 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；離子極性及檢測模式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；噴霧電壓（IS）：5 500 V；霧化溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）：30.0 psi（氮?dú)猓慌鲎矚猓–AD）：7 psi；霧化氣（GS1）：50.0 psi；輔助氣（GS2）：50.0 psi；入口電壓（EP）：10 V。其余參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜條件部分參數(shù)設(shè)置Tab.2 Partial parameter settings for mass spectrometry conditions

2.2 溶液制備

系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：取加巴噴丁和普瑞巴林對照品各適量，精密稱定，置不同容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容，分別配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的對照品貯備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。取上述對照品貯備液各適量，混勻，用50%甲醇溶液逐級稀釋，得質(zhì)量濃度分別為1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00，64.00，96.00，128.00 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

系列混合質(zhì)控工作液：取上述對照品貯備液各適量，混勻，用50%甲醇溶液逐級稀釋，得質(zhì)量濃度分別為2.00，64.00，96.00 μg/mL 的系列混合質(zhì)控工作液。同時，配制質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL 的混合定量下限工作液。

內(nèi)標(biāo)工作液：取茶堿對照品適量，精密稱定，用50%甲醇溶液溶解，超聲處理，定容，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/ mL 的內(nèi)標(biāo)貯備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。用50%甲醇溶液作為稀釋溶液，配制質(zhì)量濃度為20.00 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控血漿樣品：取空白血漿樣品90 μL，置1.5 mL 離心管中，加入10 μL 系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（或系列混合質(zhì)控工作液）和內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋，混勻，加入290 μL 有機(jī)溶劑甲醇沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，低溫高速離心（4 ℃，12 000 r/ min）10 min，取上清液，即得。

2.3 血漿樣品前處理

取血漿樣品100 μL，置1.5 mL 離心管中，加10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋，混勻，加290 μL 甲醇沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，低溫高速離心（4 ℃，12 000 r/min）10 min，取上清液適量，注入液相色譜儀自動進(jìn)樣器模塊（溫度設(shè)為10 ℃）中，進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取不同來源的志愿者空白血漿90 μL，分別加入10 μL系列混合質(zhì)控工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，按2.3 項下方法處理，即得；取空白血漿，按2.3 項下方法處理，即得；取空白血漿90 μL，分別加入加巴噴丁和普瑞巴林對照品溶液（質(zhì)量濃度為6.40 μg/ mL）10 μL，混勻，按2.3 項下方法處理，即得。結(jié)果顯示，加巴噴丁和普瑞巴林的出峰時間分別為2.51 min 和2.50 min，在其對應(yīng)離子通道下，血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測化合物的色譜峰。色譜圖見圖1。

1.加巴噴丁 2.普瑞巴林A.空白血漿 B.空白血漿+ 加巴噴丁、普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)對照品溶液 C.空白血漿+ 加巴噴丁對照品溶液（質(zhì)量濃度為6.40 μg / mL）D.空白血漿+ 普瑞巴林對照品溶液（質(zhì)量濃度為6.40 μg / mL）圖1 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖1.Gabapentin 2.PregabalinA.Blank plasma B.Blank plasma + gabapentin，pregabalin and internal standard reference solution C.Blank plasma + gabapentin reference solution（mass concentration：6.40 μg / mL）D.Blank plasma + pregabalin reference solution（mass concentration：6.40 μg / mL）Fig.1 HPLC chromatograms

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和定量下限（LLOQ）確定：取血漿樣品90 μL，置1.5 mL 離心管中，分別加入10 μL 系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋，混勻，加290 μL 有機(jī)溶劑甲醇沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，低溫高速離心（4 ℃，12 000 r/ min）10 min，取上清液，即得加巴噴丁和普瑞巴林質(zhì)量濃度分別為100.00，200.00，400.00，800.00，1 600.00，3 200.00，6 400.00，9 600.00，12 800.00 ng/ mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品。取適量，按2.1項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，以加巴噴丁和普瑞巴林的質(zhì)量濃度（X，ng/ mL）為橫坐標(biāo)、待測物的峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）比值（Y）為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。得回歸方程分別為Y加=0.002 1X加- 0.051 9（r= 0.999 2，n= 9）和Y普=0.000 7X普-0.01 4（r=0.999 6，n=9）。結(jié)果表明，加巴噴丁和普瑞西林的質(zhì)量濃度在100.00～12 800.00 ng/ mL范圍內(nèi)與待測物和內(nèi)標(biāo)峰面積比值線性關(guān)系良好。2 種待測物的LLOQ為100.00 ng/mL。

精密度與準(zhǔn)確度試驗：定量吸取90 μL 空白血漿，分別加入內(nèi)標(biāo)和LLOQ、低、中、高4 種質(zhì)量濃度（100.00，200.00，6 400.00，9 600.00 ng/mL）的系列混合質(zhì)控工作液各10 μL，按2.3項下方法操作，即得加巴噴丁和普瑞巴林的混合質(zhì)控血漿樣品。每個質(zhì)量濃度平行制備6份樣品，連續(xù)制備3 d并測定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，加巴噴丁和普瑞巴林的日內(nèi)、日間精密度試驗的LLOQ 樣品均值在標(biāo)示濃度± 20%范圍內(nèi)，RSD均小于20%（n= 6）；低、中、高3 種質(zhì)量濃度樣品均值在標(biāo)示濃度± 15%范圍內(nèi)，RSD均小于15%（n=6）。詳見表3。

表3 血漿中加巴噴丁和普瑞巴林的精密度與準(zhǔn)確度試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of precision and accuracy tests of gabapentin and pregabalin in plasma（n = 6）

提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)：配制血漿樣品，2 種待測物低、中、高質(zhì)量濃度依次為200.00，6 400.00，9 600.00 ng/mL，各平行6 份，按2.3 項下方法操作，進(jìn)樣檢測加巴噴丁、普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)的峰面積（A）。取200 μL 空白血漿樣品，加600 μL 有機(jī)溶劑甲醇沉淀蛋白后，取上清液380 μL，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的系列混合質(zhì)控工作液和內(nèi)標(biāo)工作液各10 μL，混勻，置低溫高速離心機(jī)中離心10 min，取上清液，檢測加巴噴丁、普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)的峰面積（B）。定量吸取90 μL 甲醇，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的系列混合質(zhì)控工作液和內(nèi)標(biāo)工作液各10 μL，混勻，加300 μL甲醇，置低溫高速離心機(jī)中離心10 min，取上清液，檢測加巴噴丁、普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)的峰面積（C）。計算提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)，提取回收率（%）=A/B× 100%，基質(zhì)效應(yīng)（%）=B/C×100%。結(jié)果，血漿中加巴噴丁和普瑞巴林的低、中、高質(zhì)量濃度的提取回收率分別為93.89% ～101.55% 和94.38%～101.93%，基質(zhì)效應(yīng)分別為88.76%～100.95% 和91.87%～102.08%，均符合要求。內(nèi)標(biāo)的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的平均RSD分別為9.56%和5.77%，均小于15%，符合要求。詳見表4。

表4 血漿中加巴噴丁與普瑞巴林的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（n=6）Tab.4 Extraction recovery rate and matrix effect results of gabapentin and pregabalin in plasma（n = 6）

穩(wěn)定性試驗：不同保存條件下，低、中、高質(zhì)量濃度加巴噴丁和普瑞巴林血漿和儲備樣品的穩(wěn)定性，各平行6 份，分別置常溫下8 h，常溫24 h，進(jìn)樣室24 h，4 ℃冰箱48 h，-80 ℃冰箱24 h 反復(fù)凍融3 次，-80 ℃冰箱40 d。結(jié)果的RSD均小于15%，表明加巴噴丁和普瑞巴林樣品均穩(wěn)定。

2.5 人體藥代動力學(xué)研究方案與應(yīng)用

該研究方案已獲貴州省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)［批件號為倫審字（科研）〔2019〕75 號］，患者簽署知情同意書。納入服用加巴噴丁或普瑞巴林的PHN 患者各20 例，采用滴定給藥方式，加巴噴丁和普瑞巴林最大給藥劑量分別為1.50 g/d 和0.30 g/d?？诜影蛧姸”憩F(xiàn)出飽和吸收，即一種非線性（零級）過程，使其藥代動力學(xué)更難預(yù)測，血藥濃度不隨劑量增加而成比例增加；普瑞巴林的吸收是線性（一級）過程，血漿濃度隨劑量的增加而增加。在藥物給藥劑量穩(wěn)定后，持續(xù)服藥48 h，于次日清晨采集患者空腹靜脈血，并按上述方法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。加巴噴丁的血藥濃度為4 083.62～12 287.04 ng /（mL·g），經(jīng) 劑 量 校 正 后 濃 度 為2 268.68～13 652.27 ng/（mL·g）；普瑞巴林的血藥物濃度為2 307.04～6 588.49 ng/（mL·g），經(jīng)劑量校正后濃度為11 987.27～36 518.73 ng/（mL·g）。可見，患者體內(nèi)兩藥的血藥濃度差異較大。因此，有必要對這2 種藥物進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，并在后續(xù)研究中探討血藥濃度和臨床療效間的對應(yīng)關(guān)系，從而為患者的藥物治療劑量制訂及個體化用藥提供參考。

表5 患者血漿中加巴噴丁與普瑞巴林的藥物濃度Tab.5 Concentration of gabapentin and pregabalin in patient's plasma

3 討論

方法建立階段，分別嘗試了不同比例的等度洗脫和梯度洗脫來優(yōu)化待測物和內(nèi)標(biāo)的峰形、保留時間，最終選擇上述方法中的梯度洗脫程序。后續(xù)考察了水相中不同濃度的甲酸體積分?jǐn)?shù)（0.05%，0.10%，0.15%），5.00 mmol/ L 醋酸銨（0.10%甲酸），50.00 mmol/ L 磷酸二氫鈉（pH=2.5），有機(jī)相分別采用甲醇和乙腈進(jìn)樣測試，較多出現(xiàn)峰形分叉、肩峰或拖尾現(xiàn)象，最終采用0.10%甲酸水溶液和乙腈，可得到較好的峰形和響應(yīng)。在血漿樣品前處理階段，分別嘗試了甲醇和乙腈作為沉淀劑的一步蛋白沉淀法，該方法操作簡便，進(jìn)樣后2 種沉淀劑的峰形和響應(yīng)相差不大，最后選擇價格便宜、毒性較小的甲醇作為沉淀劑。

國內(nèi)目前的加巴噴丁和普瑞巴林治療PHN 研究大部分為臨床療效的觀察?；颊咴诜幒蟪４嬖谥委煙o效的情況，且由于采用逐步遞增的給藥劑量方式，使達(dá)到給藥劑量后藥物無效更換藥物時患者需忍受更多疼痛。相同給藥劑量下，加巴噴丁和普瑞巴林的血藥濃度存在顯著的個體差異，故血藥濃度比給藥劑量能更直觀地反映藥物的體內(nèi)效應(yīng)。本研究中為后續(xù)加巴噴丁和普瑞巴林的血藥濃度監(jiān)測奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，以期通過對患者的血藥濃度監(jiān)測，為止痛效果不理想PHN患者的下一步治療策略提供參考，減少患者的痛苦。同時，該方法學(xué)的建立也為下一步臨床探索加巴噴丁和普瑞巴林聯(lián)合個性化治療難治性PHN 提供了治療藥物監(jiān)測的方法學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究中建立了同時測定PHN 患者血漿中加巴噴丁和普瑞巴林濃度的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，血漿樣本前處理簡單，檢測速度快，穩(wěn)定性好，血漿消耗量少，可為臨床提供大量樣本測定。