真空衰減法測(cè)定勞拉西泮注射液的包裝密封性*

高梓真，毛文星，周 琪，金 鑫，王佳瑜，許向陽(yáng)△

（1.江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司藥物研究院·江蘇省中樞神經(jīng)藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221000； 2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質(zhì)量監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401121）

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VeriPac455 - M5 型真空衰減檢漏儀（美國(guó)PTI 公司）；FCO210型流量計(jì)（英國(guó)Furness公司）；HVA 110型高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；ESCO AC2 - 4S1 型生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Memmert INB500型恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmert公司）；BX51-32型顯微鏡（日本Olympus 公司）；MFY - HS 型智能密封儀（濟(jì)南三泉中石實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試藥

中硼硅玻璃管制注射劑瓶（批號(hào)為220092001），抗生素瓶用鋁塑組合蓋（批號(hào)為S2009001），注射液用鹵化丁基橡膠塞（溴化，批號(hào)為S200811501），均購(gòu)自山東力諾特種玻璃股份有限公司；銅綠假單胞菌［中國(guó)食品藥品檢定研究院，編號(hào)為CMCC（B）10104，代數(shù)為3］；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)為20200903），綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基（批號(hào)為20201012），均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；勞拉西泮注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格為每支1 mL∶2 mg，批號(hào)分別為SLZ220901，SLZ220902，SLZ220903）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

陽(yáng)性樣品：參照ASTM F2338 - 09，采用激光打孔法制備名義孔徑為3，5，10 μm的陽(yáng)性樣品，并通過(guò)流量計(jì)校準(zhǔn)孔徑大小，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。向空陽(yáng)性瓶中分別加入1 mL 勞拉西泮注射液，軋蓋，密封，即得真空衰減法陽(yáng)性樣品。在無(wú)菌環(huán)境下，向空陽(yáng)性瓶中加入1 mL無(wú)菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，軋蓋，密封，即得微生物挑戰(zhàn)法陽(yáng)性樣品。

A - C.陽(yáng)性樣品（名義孔徑分別為3，5，10 μm） D - E.漏孔照片圖1 不同孔徑激光打孔陽(yáng)性樣品A - C.Positive samples（with nominal pore sizes of 3，5，and 10 μm，respectively） D - E.Photos of laser perforation leakageFig.1 Positive samples with different pore sizes by laser drilling

表1 不同孔徑陽(yáng)性樣品校驗(yàn)結(jié)果（μm）Tab.1 Results of positive samples with different pore sizes（μm）

陰性對(duì)照樣品：選用流量計(jì)模擬孔徑進(jìn)行樣品線性研究，流量計(jì)流量與漏孔孔徑對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表2。以泄露量（X，cc/min）為橫坐標(biāo)、差壓平均值（Y，Pa）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=474.72X+17.82，結(jié)果表明線性良好（R2=0.999 6，n=6）。取生產(chǎn)線上生產(chǎn)的完好產(chǎn)品，經(jīng)流量計(jì)檢測(cè)，取泄漏量為0 cc/min 的樣品，即得真空衰減法陰性對(duì)照樣品。在無(wú)菌環(huán)境下，向藥品包裝中加入1 mL 無(wú)菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，軋蓋，密封，經(jīng)流量計(jì)檢測(cè)，取泄漏量為0 cc/min 的樣品，即得微生物挑戰(zhàn)法陰性對(duì)照樣品。

表2 流量計(jì)流量與漏孔孔徑對(duì)照表（cc/min）Tab.2 Correspondence between the flow rate of the flow meter and the diameter of the leakage hole（cc / min）

2.2 真空衰減法參數(shù)選擇

對(duì)測(cè)試壓力（真空度）、平衡時(shí)間（保壓時(shí)間）、測(cè)試時(shí)間、泄壓時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 勞拉西泮注射液真空衰減法檢測(cè)參數(shù)Tab.3 Detection parameters of Lorazepam Injection by the vacuum decay method

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

泄漏閾值（P/ F 值）確定：以絕壓值和差壓值為依據(jù)，以勞拉西泮注射液為陰性樣品進(jìn)行測(cè)試，共測(cè)試3 d，每天測(cè)試30 支，總共不少于90 次。結(jié)果陰性對(duì)照樣品的平均絕壓值為433.8 mbar，平均差壓值為14.0 Pa，標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ）分別為0.5 和0.6。按“平均值+ 6σ”進(jìn)行計(jì)算，絕 壓P/ F 閾 值 為436.8 mbar，差 壓P/ F 閾值 為17.6 Pa。詳見(jiàn)表4。后續(xù)檢測(cè)樣品時(shí)，若絕壓檢測(cè)值大于絕壓P/F 閾值或差壓檢測(cè)值大于差壓P/F 閾值時(shí)，則判定為“泄漏”；反之，則判定為“不泄漏”（大漏樣品通過(guò)絕壓P/F閾值來(lái)判斷）。

表4 陰性樣品壓力檢測(cè)結(jié)果（n=30）Tab.4 Results of the pressure test of negative samples（n = 30）

準(zhǔn)確度試驗(yàn)：將5支陰性對(duì)照樣品和不同孔徑的陽(yáng)性樣品各4 支隨機(jī)混合，分3 個(gè)時(shí)間段（T1，T2，T3）進(jìn)行檢測(cè)，記錄泄露情況。陰性對(duì)照樣品的檢測(cè)結(jié)果為不泄漏（-）時(shí)為準(zhǔn)確，陽(yáng)性樣品為泄漏（+）時(shí)為準(zhǔn)確。結(jié)果陰性對(duì)照樣品的檢測(cè)結(jié)果均為不泄漏，名義孔徑為3，5，10 μm 的陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果均為泄漏，表明方法準(zhǔn)確度為100.00%。詳見(jiàn)表5。

表5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of the accuracy verification test

重復(fù)性試驗(yàn)：將5支陰性對(duì)照樣品和不同孔徑的陽(yáng)性樣品各4 支隨機(jī)混合，分3 個(gè)時(shí)間段（T1，T2，T3）進(jìn)行檢測(cè)，記錄差壓值和絕壓值。結(jié)果重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于10%，表明方法重復(fù)性良好，能滿足樣品的密封完整性檢測(cè)。詳見(jiàn)表6。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of the repeatability test

中間精密度試驗(yàn)：將5支陰性對(duì)照樣品和不同孔徑的陽(yáng)性樣品各4支隨機(jī)混合，由不同試驗(yàn)人員連續(xù)檢測(cè)2 d（D1，D2），記錄差壓值和絕壓值。結(jié)果中間精密度試驗(yàn)的RSD均小于10%，表明方法中間精密度良好，能滿足樣品的密封完整性檢測(cè)。詳見(jiàn)表7。

表7 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.Results of the intermediate precision test

檢測(cè)限確定：由準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果可知，本研究中建立的方法檢測(cè)限為3 μm。

大漏樣品測(cè)定：以裝有1 mL 勞拉西泮注射液但不軋蓋、密封的中硼硅玻璃管制注射劑瓶作為大漏樣品（孔徑為9 mm），對(duì)大漏樣品進(jìn)行檢測(cè)，記錄泄露情況，泄漏記作“+”，未泄漏記作“-”。共測(cè)試5支大漏樣品，結(jié)果均泄漏，檢出率為100.00%，表明方法的檢測(cè)范圍較寬，即不小于3 μm。詳見(jiàn)表8。

表8 大漏樣品測(cè)定結(jié)果Tab.8 Detection results of large leakage samples

耐用性試驗(yàn)：對(duì)表3 確定的檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行微調(diào)，測(cè)試陽(yáng)性樣品和陰性對(duì)照樣品，記錄泄漏情況，泄漏記作“+”，未泄漏記作“-”。通過(guò)對(duì)測(cè)試壓力（真空度）、平衡時(shí)間（保壓時(shí)間）、測(cè)試時(shí)間進(jìn)行微調(diào)，陰性對(duì)照樣品和不同孔徑陽(yáng)性樣品檢出率均為100.00%，表明方法耐用性良好。詳見(jiàn)表9。

表9 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.9 Results of the durability test

2.4 真空衰減法與微生物挑戰(zhàn)法比較

菌懸浮液制備：藥品包裝系統(tǒng)內(nèi)外均為有氧環(huán)境，應(yīng)選擇需氧菌作為微生物挑戰(zhàn)法測(cè)試的目標(biāo)菌株［12-13］。銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性需氧桿菌，菌長(zhǎng)為1.5～3.0 μm、寬為0.5～0.8 μm，體積和尺寸均較小，易從漏孔侵入，故選擇銅綠假單胞菌作為目標(biāo)菌株［14-15］。取銅綠假單胞菌ATCC 27853 適量，接種于10 mL無(wú)菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，35 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，取少量菌液，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，采用菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，菌懸液濃度應(yīng)不低于105cfu/mL［16］。

微生物侵入試驗(yàn)：將陽(yáng)性樣品（名義孔徑分別為3，5，10 μm）和陰性對(duì)照樣品完全浸泡在銅綠假單胞菌菌懸液中，置智能密封儀的壓力倉(cāng)內(nèi)，于負(fù)壓壓力-60 kPa、負(fù)壓時(shí)間5 min、正壓壓力+80 kPa、正壓時(shí)間10 min 的條件下進(jìn)行微生物侵入試驗(yàn)。侵菌試驗(yàn)結(jié)束后，將陰性對(duì)照樣品和陽(yáng)性樣品置35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，逐日觀察并記錄。結(jié)果當(dāng)陽(yáng)性樣品名義孔徑分別為3，5，10 μm 時(shí)，微生物侵入率分別為70.00%，90.00%，100.00%；陰性對(duì)照樣品微生物侵入率為0。詳見(jiàn)表10。

表10 微生物挑戰(zhàn)法檢測(cè)結(jié)果Tab.10 Results of the microbiological challenge method

檢出率比較：真空衰減法和微生物挑戰(zhàn)法對(duì)勞拉西泮注射液包裝密封性檢出結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，真空衰減法靈敏度較微生物挑戰(zhàn)法更高，更有利于確保勞拉西泮注射液的包裝密封性。

圖2 真空衰減法與微生物挑戰(zhàn)法檢出率比較Fig.2 Comparison of detection rates between the vacuum decay method and the microbial challenge method

2.5 加速試驗(yàn)

采用勞拉西泮注射液（規(guī)格為每支1 mL∶2 mg，批號(hào)分別為SLZ220901，SLZ220902，SLZ220903）模擬市售包裝，進(jìn)行3 個(gè)月的加速試驗(yàn)，溫度為（40 ± 2）℃，相對(duì)濕度為（75±5）%。采用本研究中建立的真空衰減法檢測(cè)勞拉西泮注射液的包裝密封性，泄漏記作“+”，未泄漏記作“ -”。結(jié)果3 批樣品均未泄漏，表明市售勞拉西泮注射液（規(guī)格為每支1 mL∶2 mg）具有良好的密封完整性。詳見(jiàn)表11。

表11 加速試驗(yàn)結(jié)果Tab.11 Results of the accelerated test

3 討論

本研究中參照USP 1207 和ASTM F2338 - 09 建立了測(cè)定勞拉西泮注射液包裝密封性的真空衰減法的檢測(cè)參數(shù)，即真空度5 mbar、保壓時(shí)間4.0 s（Cycle 1），真空度1.4 mbar、保壓時(shí)間3.0 s、測(cè)試時(shí)間16.0 s、泄壓時(shí)間4.0 s（Cycle 2）。采用該方法對(duì)陰性對(duì)照樣品進(jìn)行多次檢測(cè)，確認(rèn)泄漏閾值為絕壓P/F閾值436.8 mbar、差壓P/F閾值17.6 Pa。經(jīng)測(cè)試，當(dāng)陽(yáng)性樣品名義孔徑為3 μm及以上時(shí)，真空衰減法檢出率均為100.0%。采用銅綠假單胞菌ATCC 27853 進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)，經(jīng)測(cè)試，當(dāng)陽(yáng)性樣品名義孔徑為3，5，10 μm 時(shí)，侵入率分別為70.00%，90.00%，100.00%。本研究中針對(duì)勞拉西泮注射液建立的真空衰減法靈敏度為3 μm，較微生物挑戰(zhàn)法的靈敏度更高，該方法可在不破壞產(chǎn)品及其包裝的基礎(chǔ)上有效保障勞拉西泮注射液的密封完整性，確保勞拉西泮注射液的質(zhì)量符合要求，保障其在有效期內(nèi)安全、可控，并為其他類似包裝的藥品檢測(cè)提供參考。