松針多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化、酶活性抑制特征

張家旭 王信 葉倩女 董學鳳 郭玉兒 彭騰騰 尹盼盼 李海燕 石曉峰

摘要： 為優(yōu)化松針多酚的提取工藝，并考察其體外抗氧化作用以及對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶活性的抑制作用，本研究利用超聲輔助提取法，在提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比等要素對松針多酚提取單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化松針多酚提取工藝；并利用優(yōu)化工藝條件，測定了6種松科植物松針的多酚提取量。進一步利用不同多酚含量的松針提取液，分析松針多酚對1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS+）、羥基自由基（·OH）的清除能力及其對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶活性的抑制能力。結(jié)果表明，松針多酚的最佳提取工藝為提取溫度60 ℃、提取時間28 min、乙醇體積分數(shù)60%、料液比1 g∶25 ml；在此條件下，6種松科植物松針多酚提取量為19.97～53.41 mg/g。6種松科植物松針多酚對DPPH自由基清除的IC50值范圍為22.76～159.90 μg/ml，對ABTS+自由基清除的IC50值范圍為0.092～0.184 mg/ml，對·OH自由基清除的IC50值范圍為2.176～8.134 mg/ml，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制IC50值范圍為6.421～18.120 μg/ml，對α-淀粉酶活性的抑制IC50值范圍為0.399～10.570 mg/ml，對酪氨酸酶活性的抑制IC50值范圍為0.121～3.725 mg/ml?？傊舍樉哂休^高的多酚含量，明顯的抗氧化活性，對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶活性有較強的抑制作用，在天然抗氧化劑、降糖藥的研發(fā)中有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 松針；多酚；提取工藝；抗氧化；酶活性抑制

中圖分類號： TS201.4?? 文獻標識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2023）07-1593-13

Optimization of extraction process of polyphenols from pine needles and its antioxidant and enzyme activity inhibitory characteristics

ZHANG Jia-xu1，2， WANG Xin1，2， YE Qian-nü1，2， DONG Xue-feng1，2， GUO Yu-er2，3， PENG Teng-teng1，2， YIN Pan-pan1，2， LI Hai-yan1，2， SHI Xiao-feng1，2，3

（1.College of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730030， China;2.Gansu Provincial Academic Institute for Medical Research， Lanzhou 730050， China; 3. Lanzhou University of Technology， Lanzhou 730050， China）

Abstract： ?In order to optimize the extraction process of pine needle polyphenols， and to investigate its antioxidant effect in vitro and its inhibitory effect on the activities of α-glucosidase， α-amylase and tyrosinase， based on the single factor test of extraction temperature， extraction time， ethanol volume fraction and liquid-to-material ratio on the content of polyphenols in pine needle extract， the extraction process of pine needle polyphenols based on ultrasonic-assisted extraction was optimized by response surface method. The extraction of polyphenols from pine needles of six pine plants was determined by using the optimized process conditions. The scavenging ability of pine needle polyphenols on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH）， 2，2 ′-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid radical （ABTS+） and hydroxyl radical （·OH） and their inhibitory ability on the activities of α-glucosidase， α-amylase and tyrosinase were further analyzed by using pine needle extracts with different polyphenol contents.? The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： extraction temperature 60 ℃， extraction time 28 min， ethanol volume fraction 60%， liquid-solid ratio 1∶25 （g∶ml）. Under these conditions， the extraction amount of polyphenols from pine needles of six pine plants ranged from 19.97 mg/g to 53.41 mg/g. The IC50 values of DPPH free radical， ABTS+ free radical， ·OH free radical were 22.76-159.90 μg/ml， 0.092-0.184 mg/ml， 2.176-8.134 mg/ml， respectively， and the IC50 values of α-glucosidase， α-amylase and tyrosinase were 6.421-18.120 μg/ml， 0.399-10.570 mg/ml and 0.121-3.725 mg/ml， respectively. In summary， pine needles have high polyphenol content， obvious antioxidant activity， strong inhibitory effects on the activities of α-glucosidase， α-amylase and tyrosinase， and have broad application prospects in the development of natural antioxidants and hypoglycemic drugs.

Key words： pine needles;polyphenols;extraction process;antioxidant;enzyme activity inhibition

多酚是植物體內(nèi)的次生代謝物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種藥理作用[1-3]。目前植物多酚的提取方法主要有超聲輔助提取法、微波輔助提取法、溶劑浸提法等，而超聲輔助提取法具有方便快捷的優(yōu)點，是目前應(yīng)用最為廣泛的植物多酚提取方法[4-5]。

松針是松科（Pinaceae）植物的針葉。松針富含的黃酮類、木脂素類、揮發(fā)油類化合物，具有祛風、止痛等藥理作用[6-8]；富含的維生素、礦物質(zhì)元素、氨基酸等物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值[9-10]。中國的松樹資源非常豐富，目前松針的年產(chǎn)量約2.1×108 t[11]。但目前松針大多以飼料形式應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)，造成了大量的浪費。目前針對不同松科植物松針的活性成分含量差異及其清除DPPH自由基的能力[12]、松針提取物的體外抗氧化活性差異[13]有一些研究。但松針多酚的提取工藝及其降糖、抑制酪氨酸酶活性研究較少，因此本研究以雪松、白皮松、落葉松、油松、樟子松、華山松等6 種松科植物松針為研究對象，采用超聲輔助法提取松針多酚，通過單因素試驗分析了提取溫度、提取時間、乙醇濃度、液料比對松針多酚含量的影響，然后采用響應(yīng)面法優(yōu)化松針多酚的提取工藝，并對松針多酚的抗氧化活性和對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶活性的抑制作用進行了討論，以期為松針資源的綜合利用及產(chǎn)品開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 光吸收酶標儀（Spectra Max 190，美谷分子儀器上海有限公司產(chǎn)品）；超聲波清洗儀（SK 3100，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品）；電熱恒溫水浴鍋（HH.S21-6，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品）；高速多功能粉碎機（CXP-100，上海晟喜制藥機械有限公司產(chǎn)品）

1.1.2 材料及溶液配制 雪松、白皮松、落葉松、油松、樟子松、華山松等6 種松科植物松針分別采自甘肅省蘭州市與天水市，采集后漂洗干凈，室內(nèi)常溫陰干后粉碎，過30目篩，置于干燥器中保存?zhèn)溆?；沒食子酸購自上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）購自Sigma公司；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS+）購自上海麥克林生化科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）購自北京邁瑞達科技有限公司，α-淀粉酶、酪氨酸酶、左旋多巴（L-DOPA）、曲酸、阿卡波糖、磷酸鹽緩沖液干粉（PBS）購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、福林酚試劑購自上海展云化工有限公司；NaCO3·7H2O、水楊酸、30% H2O2、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、抗壞血酸、可溶性淀粉、Na2SO3、NaOH、苯酚、C4H4Na2O6·4H2O，均為分析純。

溶液配制方法如下：0.2 mmol/L的DPPH溶液：精密稱取0.003 9 g DPPH，用無水乙醇定容至50 ml；7.4 mmol/L的ABTS+溶液：精密稱取0.040 6 g ABTS+，用純化水定容至10 ml；2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液：精密稱取0.007 0 g過硫酸鉀，用純化水定容至10 ml；9.0 mmol/L的FeSO4溶液：精密稱取0.068 0 g FeSO4，用純化水定容至50 ml；9.0 mmol/L的水楊酸溶液：精密稱取0.062 0 g 水楊酸，用無水乙醇定容至50 ml；9.0 mmol/L的H2O2溶液：精密吸取46 μl 30%的H2O2溶液，用純化水定容至50 ml；0.2 U/ml的α-葡萄糖苷酶溶液：精密稱取0.200 mg 50 U/mg的α-葡萄糖苷酶，用純化水定容至50 ml；10mmol/L的PNPG溶液：精密稱取0.105 6 g PNPG，用純化水定容至50 ml；0.1 mol/L的PBS 緩沖液：用純化水將1袋磷酸鹽緩沖液干粉（0.02 mol PO3-4）溶解并定容至200 ml；8 U/ml的α-淀粉酶溶液：稱取0.025 g 1 600 U/g的淀粉酶，用純化水定容至50 ml；1%的可溶性淀粉溶液：稱取1.00 g淀粉，用純化水定容至100 ml；100 U/ml的酪氨酸酶溶液：精密稱取4.032 2 mg 1 240 U/mg的酪氨酸酶，用純化水定容至50 ml； 0.5mmol/L的L-DOPA溶液：精密稱取0.004 9 g L-DOPA，用純化水定容至50 ml；以上所有溶液均用棕色容量瓶配制，避光保存。ABTS+工作液的配制：將7.4 mmol/L的ABTS+溶液與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液1∶1混合，室溫避光靜置12 h，再用無水乙醇稀釋上述混合溶液，使其734 nm波長處吸光度為0.70±0.02。DNS溶液的配制：稱取0.315 g（3，5）-二羥基水楊酸，加少量純化水溶解，再稱取9.10 g酒石酸鉀鈉，加15 ml純化水溶解后，加入1.05 g NaOH，完全溶解后，將二者混勻，再稱取0.25 g苯酚，0.25 g亞硫酸鈉，加少量蒸餾水完全溶解，定容至50 ml棕色容量瓶中。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制 采用Folin-ciocalteu法測定松針多酚含量，以沒食子酸為對照品，稱取10.0 mg沒食子酸，置于10 ml容量瓶中，用純化水將其為質(zhì)量濃度1.0 mg/ml的儲備液，再將儲備液依次稀釋為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60 μg/ml的對照品溶液，取不同質(zhì)量濃度對照品溶液與純化水各0.5 ml置于10 ml比色管中，加入1.0 ml福林酚試劑，充分振蕩搖勻后靜置5 min，加入2.0 ml 10% Na2CO3溶液，加水定容至10 ml，30 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，在波長765 nm處測定其吸光度，得到回歸方程Y=0.006 6x+0.049 9，其中x為溶液沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/ml），Y為溶液吸光度，線性相關(guān)系數(shù)為0.997 7，表明當沒食子酸濃度在10～60 μg/ml時，標準曲線方程線性良好，適用于落葉松松針多酚提取率的測定。

1.2.2 松針中多酚含量的測定 稱取6種松科植物松針粉末各1.00 g，采用超聲輔助法提取多酚，得到松針多酚提取液V ml，取1 ml提取液置于10 ml容量瓶中，加純化水稀釋至10 ml，再取0.5 ml稀釋后的溶液置于10 ml比色管中，加入1.0 ml福林酚試劑，充分振蕩搖勻后靜置5 min，加入2.0 ml 10%Na2CO3溶液，加純化水定容至10 ml，30 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，在波長765 nm處測定其吸光度，再根據(jù)標準曲線及測定的吸光度，得到多酚質(zhì)量濃度。進而利用下式，計算松針樣品提取的多酚含量：

多酚含量（mg/g）=C×V×nm×100%（1）

式1中，C為樣品中多酚質(zhì)量濃度（μg/ml），V為提取液體積（ml），n等于稀釋倍數(shù)（n=10），m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3 松針提取工藝的優(yōu)化 首先以天水落葉松松針樣品為例，考察溫度、時間、乙醇體積分數(shù)、液料比4個因素對松針多酚提取率的影響：（1）準確稱量1.0 g松針粉末置于50 ml錐形瓶內(nèi)，加入25 ml 40%的乙醇，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下超聲提取40 min；（2）準確稱量1.0 g松針粉末置于50 ml錐形瓶內(nèi)，加入25 ml 40%的乙醇，在40 ℃條件下分別超聲提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min；（3）準確稱量1.0 g松針粉末置于50 ml錐形瓶內(nèi)，加入25 ml不同體積分數(shù)（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇溶液，在40 ℃條件下分別超聲提取40 min；（4）準確稱量1.0 g松針粉末置于50 ml錐形瓶內(nèi)，加入15 ml、20 ml、25 ml、30 ml、35 ml的40%乙醇溶液，在40 ℃條件下分別超聲提取40 min；經(jīng)上述處理后得到的提取液按方法1.2.2中介紹的方法測定多酚含量。每處理3個重復(fù)。

以上述各單因素試驗最優(yōu)的3個水平開展響應(yīng)面優(yōu)化試驗：運用Design-Expert 13軟件進行4因素（提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、料液比）3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，測定各組合條件下的多酚含量。各處理3個重復(fù)。 進而進行松針多酚提取工藝的優(yōu)化設(shè)計。

1.2.4 松針多酚抗氧化與酶抑制能力的測定 利用6種松科植物松針粉末，依據(jù)上述優(yōu)化工藝，采用超聲輔助法得到多酚提取液，測得多酚含量，進一步用60%乙醇稀釋得到不同質(zhì)量濃度的松針多酚溶液。同樣以60%乙醇稀釋抗壞血酸得到相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸溶液。進而進行松針多酚抗氧化與酶活性抑制能力的測定。

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力測定 參照文獻[14]的方法，在96孔板中分別加入50 μl不同質(zhì)量濃度（10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml）的松針多酚溶液及抗壞血酸溶液，然后再加入50 μl的0.2 mmol/L的DPPH溶液，搖勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，517nm處測得吸光度A1，用無水乙醇溶液代替DPPH溶液，測得松針多酚與乙醇混合溶液的吸光度A2，用無水乙醇溶液代替樣品溶液，測得乙醇與DPPH混合溶液的吸光度A0，按公式（2）計算自由基清除率：

自由基清除率=1-A1-A2A0×100%（2）

1.2.4.2 ABTS+自由基清除能力測定 參照文獻[15]的方法，在96孔板中分別加入50 μl不同質(zhì)量濃度（0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.20 mg/ml、0.30 mg/ml、0.40 mg/ml、0.50 mg/ml）的松針多酚溶液及抗壞血酸溶液，加入200 μl的ABTS+工作液，振蕩搖勻，25 ℃條件下避光充分反應(yīng) 5 min，734 nm下測得吸光度A1;以200 μl純化水代替ABTS+溶液，測得松針多酚與水溶液的吸光度A2；以50 μl純化水代替樣品溶液，測得水和ABTS+溶液的吸光度A0。按公式（2）計算ABTS+自由基清除率。

1.2.4.3 ·OH自由基清除能力測定 參照文獻[16]的方法，在96孔板中分別加入50 μl不同質(zhì)量濃度（1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、6 mg/ml、8 mg/ml）的松針多酚溶液以及與樣品相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸溶液，50 μl 9.0 mmol/L的FeSO4溶液和50 μl 9.0 mmol/L的水楊酸溶液，最后再加入50 μl 9.0 mmol/L的H2O2溶液，37 ℃水浴加熱30 min，510 nm下測得吸光度A1；取50 μl純化水代替水楊酸溶液，測得上述混合溶液的吸光度A2；以50 μl純化水代替多酚溶液，測得混合溶液的吸光度A0。按公式（2）計算·OH自由基清除率。

1.2.4.4 α-葡萄糖苷酶活性抑制率測定 參照文獻[17]、[18]的方法，在96孔板中分別加入10 μl不同質(zhì)量濃度（2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml、40.0 μg/ml、80.0 μg/ml）的樣品溶液以及與樣品相同質(zhì)量濃度的阿卡波糖溶液，在上述溶液中分別加入20 μl 0.2 U/ml的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃下反應(yīng)10 min，加入30 μl 10 mmol/L 的PNPG溶液，37 ℃下反應(yīng)30 min，加入80 μl 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，405 nm下測吸光度，記為A1；用0.1 mol/L PBS 緩沖液代替α-葡萄糖苷酶，測得混合溶液的吸光度A2；用PBS 緩沖液代替樣液作為對照，測得混合溶液的吸光度A3；用PBS緩沖液代替樣品和酶溶液作為空白，測得混合溶液的吸光度A4。按公式（3）計算酶活性抑制率：

抑制率=1-A1-A2A3-A4×100%（3）

1.2.4.5 α-淀粉酶活性抑制率測定 參照文獻[19]、[20]的方法，在96孔板中加入20 μl不同質(zhì)量濃度（0.10 mg/ml、0.25 mg/ml、0.50 mg/ml、1.00 mg/ml、2.00 mg/ml、4.00 mg/ml，樟子松質(zhì)量濃度為2 mg/ml、4 mg/ml、6 mg/ml、8 mg/ml、10 mg/ml、12 mg/ml）的樣品溶液以及與樣品相同質(zhì)量濃度的阿卡波糖溶液，然后分別加入20 μl 8 U/ml的α-淀粉酶溶液，37 ℃下反應(yīng)10 min后，加入40 μl 1%的可溶性淀粉溶液，37 ℃下繼續(xù)反應(yīng)10 min，最后加入20 μl DNS溶液，100 ℃下反應(yīng)10 min后，在540 nm下測得吸光度A1；用0.1 mol/L的 PBS 緩沖液代替α-淀粉酶，測得上述混合溶液的吸光度A2；用PBS 緩沖液代替樣液作為對照，測得混合溶液的吸光度A3；用PBS緩沖液代替樣品和酶溶液作為空白，測得混合溶液的吸光度A4。按公式（3）計算酶活性抑制率。

1.2.4.6 酪氨酸酶活性抑制率測定 參照文獻[21]、[22]的方法，向96孔板中依次加入50 μl不同質(zhì)量濃度（0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.25 mg/ml、0.50 mg/ml、0.75 mg/ml、1.00 mg/ml，樟子松質(zhì)量濃度為0.25 mg/ml、0.50 mg/ml、1.00 mg/ml、2.00 mg/ml、3.00 mg/ml、4.00 mg/ml）的樣品溶液以及與樣品相同質(zhì)量濃度的曲酸溶液，然后分別加入50 μl 100 U/ml酪氨酸酶溶液，在37 ℃水浴中孵育10 min，接著加入50 μl 0.5 mmol/L的L-DOPA溶液，在37 ℃水浴中孵育10 min后，475 nm波長下測得吸光度A1；以50 μl PBS替代酪氨酸酶溶液，測得混合溶液的吸光度A2，以PBS替代樣品溶液，測得混合溶液的吸光度A3；以PBS替代樣品溶液和酪氨酸酶溶液，測得混合溶液的吸光度A4。按公式（3）計算酪氨酸酶活性抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)不同多酚質(zhì)量濃度下得到的清除率或抑制率，采用SPSS 26軟件，計算半清除或半抑制質(zhì)量濃度（IC50）。

采用SPSS 26 軟件及單因素方差分析法，進行處理間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素提取條件對松針多酚提取含量的影響

2.1.1 提取溫度對松針多酚提取含量的影響 松針多酚的提取含量隨提取溫度的變化如圖1所示。在30～60 ℃，隨著溫度升高，多酚提取含量呈增加趨勢，溫度60 ℃時，多酚提取含量達到最大值（48.95 mg/g）。這說明較高的溫度有利于細胞中多酚類物質(zhì)溶解。但當溫度過高時會使松針中的多酚結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致提取的多酚含量下降。

2.1.2 提取時間對松針多酚提取含量的影響 松針多酚提取含量隨著提取時間的變化如圖 2 所示。從圖中可以看出，提取時間為30 min時，提取的多酚含量達到最大（51.32 mg/g）。當提取時間過長時，提取的多酚含量逐漸降低，原因可能是松針多酚中大量的酚羥基在長時間的提取中，發(fā)生氧化、水解或者縮合等反應(yīng)，同時提取時間的延長也會造成雜質(zhì)溶出增多，使得多酚提取含量降低。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對松針多酚提取含量的影響 松針多酚在不同體積分數(shù)乙醇中的溶出效果如圖 3 所示。當乙醇體積分數(shù)低于60%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，提取的多酚含量逐漸增大；在乙醇體積分數(shù)為60%時，提取的多酚含量達到最大（50.58 mg/g）。此后，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，提取的多酚含量迅速減少。這說明當乙醇體積分數(shù)較低時，溶劑極性較大，松針中含有的多酚不易溶于強極性溶劑，導(dǎo)致松針多酚溶解較少；當乙醇體積分數(shù)過高時，由于多酚類化合物的結(jié)構(gòu)中含有大量的極性基團，溶劑極性降低同樣會導(dǎo)致多酚的溶解性降低，松針中多酚也不易溶出。

2.1.4 料液比對松針多酚提取含量的影響 松針多酚提取含量隨著提取料液比的變化如圖 4 所示。當料液比低于1∶25 （g∶ml）時，隨著料液比的增大，提取的多酚含量逐漸增大，在料液比為1∶25 （g∶ml）時，提取的多酚含量達到最大（48.64 mg/g）。當料液比高于1∶25 （g∶ml）時，隨著料液比的增大，提取的多酚含量迅速減少。這說明，適宜的料液比有利于松針中的多酚溶出。料液比低時，松針與乙醇接觸不充分，而當料液比過高時，松針中的其他物質(zhì)也會溶出，這些物質(zhì)可能會影響765 nm的吸光度，從而導(dǎo)致多酚提取含量的降低。

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化松針多酚提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)上述單因素試驗的結(jié)果，選取提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、料液比4個因素中多酚提取含量較高的3個水平（表1），運用Design-Expert 13軟件進行4因素3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計。結(jié)果如表2。

進一步利用Design-Expert 13 軟件對表2中數(shù)據(jù)進行分析，構(gòu)建多酚提取含量和提取條件的回歸模型，結(jié)果如下：

Y=53.360+0.280A-0.890B+0.880C+0.510D+0.290AB+0.037AC-0.120AD-0.015BC-0.960BD+0.240CD-4.430A2-3.590B2-3.180C2-3.320D2（4）

式中，Y為多酚提取含量，A為提取溫度，B為提取時間，C為乙醇體積分數(shù)，D為料液比。

各因素對多酚提取含量的影響程度可由上式各系數(shù)絕對值反映。上述擬合關(guān)系的方差分析及顯著性檢驗見表3。

由表3可知，模型F值為33.56，P值<0.000 1，說明模型極顯著；失擬項P值大于0.05，說明該項不顯著；決定系數(shù)（R2）=0.971 1，說明該模型能夠很好地擬合落葉松松針多酚提取含量。除提取溫度以外，提取時間、乙醇體積分數(shù)、料液比 3 個因素對落葉松松針多酚提取含量均有顯著影響；提取時間與料液比之間的交互作用（BD）對提取液多酚含量有顯著影響，而提取溫度與提取時間的交互項（AB）、提取溫度與乙醇體積分數(shù)的交互項（AC）、提取溫度與料液比的交互項（AD）、提取時間與乙醇體積分數(shù)的交互項（BC）、乙醇體積分數(shù)與料液比的交互項（CD）之間對提取液多酚含量無顯著性影響；二次項A2、B2、C2、D2對多酚提取含量的影響均達到極顯著水平。從表3中F值大小可知，影響松針多酚提取含量最主要的因素為提取時間，其次是乙醇體積分數(shù)、料液比，影響最小的是提取溫度。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 各因素交互作用對落葉松松針多酚提取含量影響的響應(yīng)面圖如圖5所示。

由圖 5可知，響應(yīng)面均為凸面，且開口朝下，等高線近似圓形，其中心位于考察區(qū)域內(nèi)，說明各因素的水平設(shè)計數(shù)據(jù)合理。不同因素對落葉松松針多酚提取含量的影響反映在響應(yīng)面曲面的陡峭程度上，響應(yīng)面曲面弧度變化越陡峭，說明該因素對提取含量的影響越明顯。

2.2.3 響應(yīng)面驗證試驗 根據(jù)公式（4）可以得到松針多酚最佳提取工藝條件為提取溫度60.26 ℃，提取時間28.64 min，乙醇體積分數(shù)61.42%，料液比1∶25.51（g∶ml），提取液多酚含量擬合值為53.52 mg/g。考慮到實際操作的簡便性，將提取工藝參數(shù)優(yōu)化為提取溫度60 ℃、提取時間28 min、乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶25 （g∶ml）。按優(yōu)化的工藝條件進行松針多酚提取，多酚提取含量為（53.41±0.21） mg/g，與響應(yīng)面模型的擬合值基本一致。因此，本研究得到的松針多酚提取工藝參數(shù)是合理的，可用于松針多酚的提取。

2.2.4 6種松科植物的松針多酚提取含量 按照上述優(yōu)化的提取工藝對6種松科植物松針進行多酚提取和含量測定，結(jié)果見表4。6種松針多酚提取含量為（19.97±0.09）～（53.41±0.21） mg/g，其中天水落葉松松針多酚提取含量最高，為（53.41±0.21） mg/g，天水樟子松松針多酚提取含量最低，為（19.97±0.09） mg/g；不同松科植物、不同地區(qū)松針多酚提取含量差異顯著，可見松針多酚含量隨品種、地區(qū)而變化。

2.3 6種松科植物松針多酚生物活性測定

2.3.1 松針多酚對DPPH自由基的清除能力 6種松科植物松針多酚與抗壞血酸對DPPH自由基的清除率見圖 6。由圖可知，在質(zhì)量濃度為10～120 μg/ml，隨著松針多酚質(zhì)量濃度的增大，其對DPPH自由基的清除能力也逐漸升高。由表 5可知，對DPPH自由基清除效果最強的為蘭州白皮松松針多酚，IC50值為22.76 μg/ml，最弱的為蘭州樟子松松針多酚，IC50值為159.9 μg/ml；其中雪松、白皮松、油松、華山松松針多酚對DPPH自由基的清除能力較強，落葉松、樟子松稍弱；6種松科植物之間差異性較大；蘭州和天水2地的雪松和油松松針多酚對DPPH自由基的清除能力差異性較小，其余4種松科植物的松針多酚對DPPH自由基的清除能力差異較大。

2.3.2 松針多酚對ABTS+自由基的清除能力 6種松科植物松針多酚與抗壞血酸對ABTS+自由基的清除率見圖 7。由圖 7可知，在0.05～0.50 mg/ml范圍內(nèi)，隨著松針多酚質(zhì)量濃度的增大，其清除ABTS+自由基的能力也逐漸升高。由表 5可知，對ABTS+自由基清除效果最強的為天水油松松針多酚，IC50值為0.092 mg/ml，最弱的為蘭州樟子松松針多酚，IC50值為0.184 mg/ml；其中雪松和油松松針多酚對ABTS+自由基的清除能力較強，白皮松、樟子松松針多酚的清除能力最差；6種松科植物松針多酚對ABTS+自由基的清除能力差異較大；蘭州和天水2個地區(qū)落葉松、華山松松針多酚對ABTS+自由基的清除能力有顯著差異。

2.3.3 松針多酚對羥基自由基（·OH）的清除能力 6種松科植物松針多酚與抗壞血酸對·OH的清除率見圖 8。由圖 8可知，在1.0～8.0 mg/ml范圍內(nèi)，隨著松針多酚質(zhì)量濃度的增大，其清除·OH的能力也逐漸升高。由表 5可知，對·OH清除效果最強的為天水雪松松針多酚，IC50值為2.176 mg/ml，最弱的為蘭州樟子松松針多酚，IC50值為8.134 mg/ml；其中雪松、華山松松針對·OH的清除能力較強，白皮松、樟子松、油松稍弱；6種松科植物的松針多酚對·OH的清除能力差異較大；蘭州、天水兩個地區(qū)樟子松松針多酚的·OH清除能力差異較大，其余5種松針多酚的清除能力無顯著差異。

2.3.4 松針多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力 6種松科植物松針多酚與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率見圖 9。由圖 9可知，在2.5～80.0 μg/ml范圍內(nèi)，隨著多酚質(zhì)量濃度的增大，松針多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力也逐漸升高。由表 5可知，6種松科植物松針多酚中對α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最強的為天水落葉松松針多酚，IC50值為6.421 μg/ml，最弱的為蘭州樟子松松針多酚，IC50值為18.120 μg/ml；落葉松、雪松、油松、華山松松針多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力較強，白皮松、樟子松稍弱；蘭州、天水兩個地區(qū)落葉松、雪松、油松、華山松松針多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力無顯著性差異，而2地區(qū)樟子松和白皮松松針多酚的抑制能力差異較大。

2.3.5 松針多酚對α-淀粉酶活性的抑制能力 6種松科植物松針多酚與阿卡波糖對α-淀粉酶活性的抑制率見圖 10。由圖10可知，在0.1～4.0 mg/ml（樟子松松針多酚為2～8 mg/ml）范圍內(nèi)，隨著松針多酚質(zhì)量濃度的增大，松針多酚對α-淀粉酶活性的抑制能力也逐漸升高。由表 5可知，6種松科植物松針多酚對α-淀粉酶活性抑制能力最強的為蘭州雪松松針多酚，IC50值為0.399 mg/ml，最弱的為蘭州樟子松松針多酚，IC50值為10.570 mg/ml；6種松科植物中，樟子松松針多酚的抑制能力稍弱，其余5種松科植物松針多酚的抑制能力較強，且相互之間差異較小；蘭州、天水兩個地區(qū)的落葉松、雪松、白皮松、油松、華山松松針多酚對α-淀粉酶活性的抑制能力差異較小，而蘭州、天水兩地區(qū)的樟子松松針多酚對α-淀粉酶活性的抑制能力存在顯著差異。

2.3.6 松針多酚對酪氨酸酶活性的抑制能力 6種松科植物松針多酚與曲酸對酪氨酸酶活性的抑制率見圖 11。由圖 11可知，在0.05～1.00 mg/ml（樟子松松針多酚為0.25～4.00 mg/ml）范圍內(nèi)，隨著松針多酚質(zhì)量濃度的增大，松針多酚對酪氨酸酶活性的抑制能力也逐漸升高。由表5可知，6種松科植物松針多酚中對酪氨酸酶活性抑制能力最強的為蘭州雪松松針多酚，IC50值為0.121 mg/ml，最弱的為蘭州樟子松松針多酚，IC50值為3.725 mg/ml；落葉松、雪松、白皮松、油松、華山松松針多酚對酪氨酸酶活性的抑制能力都較強，天水、蘭州兩地的樟子松松針多酚抑制能力稍弱；6種松科植物中，樟子松松針多酚對酪氨酸酶活性的抑制能力顯著偏低，其余5種松科植物松針多酚的抑制能力沒有顯著差異；蘭州與天水兩地的落葉松、雪松、白皮松、油松、華山松松針多酚對酪氨酸酶活性的抑制能力無顯著性差異，而兩地區(qū)樟子松松針多酚的抑制能力存在顯著差異。

3 討論與結(jié)論

影響松針多酚提取效率的因素除本試驗分析的4個因素外，還包括溶劑種類、超聲功率、提取次數(shù)等。不同溶劑的極性不同，能溶解的多酚類型和效率也不同；超聲功率的增大，可以使物料的空化氣泡運動加速，加快有效物質(zhì)的溶出，但過大的功率也會破壞多酚類化合物的結(jié)構(gòu)，而提取次數(shù)的增加在一定程度上能增加溶質(zhì)的溶出，但另一方面也造成了溶劑的消耗；張桂芳等[23]的研究結(jié)果表明，不同樣品干燥方法與不同溶劑提取對紅松松針多酚提取量亦有影響，熱風干燥松針的提取物活性最佳，其次為冷凍干燥、晾曬干燥，而乙醇提取的提取物生物活性優(yōu)于水提?。蛔髡咭喾治隽瞬煌崛∪軇Χ喾犹崛『康挠绊?，結(jié)果表明乙醇作為溶劑提取的多酚含量顯著高于丙酮與乙酸乙酯，而甲醇的提取效果與乙醇沒有顯著性差異，考慮到安全因素，本研究采用乙醇作為提取溶劑。

本試驗以6種松科植物松針為對象，采用超聲輔助乙醇提取法，考察溫度、時間、乙醇體積分數(shù)、液料比4個因素對松針多酚提取含量的影響，通過單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面分析，確定了松針多酚的最佳提取條件為提取溫度60 ℃、提取時間28 min、乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶25 （mg∶ml），在此條件下6種松科植物松針多酚提取含量為（19.97±0.09）～（53.41±0.21） mg/g；結(jié)果顯示，6種松科植物松針中，除樟子松外，其他松針多酚提取量均較高，且提取的松針多酚都具有較高的抗氧化活性與酶活性抑制能力。6種松科植物松針多酚的抗氧化活性差異較大，而酶活性抑制能力差異較小。α-葡萄糖苷酶活性抑制劑對于降低餐后血糖，降低機體心血管并發(fā)癥具有顯著作用；α-淀粉酶活性抑制劑可以降低人體內(nèi)血糖指數(shù)，抑制人體對葡萄糖的吸收，從而有效控制餐后血糖，調(diào)節(jié)血脂，而酪氨酸酶是調(diào)控機體合成黑色素的限速酶，與果蔬的氧化，人體內(nèi)黑色素腫瘤以及色素障礙性疾病有顯著關(guān)系，而酪氨酸酶活性抑制劑可以治療如皮膚色素沉積、老年斑、雀斑等多種癥狀，具有明顯的美白作用。目前常用的α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶活性抑制劑，如阿卡波糖，具有導(dǎo)致胃腸道功能紊亂、腸脹氣、腹瀉等副作用；酪氨酸酶活性抑制劑，如曲酸，具有致癌和引發(fā)皮炎等副作用，因此從天然植物中尋找抗氧化、降糖藥物以及酪氨酸酶活性抑制劑具有巨大市場潛力。作為一種資源豐富的天然產(chǎn)物，松針獲取簡易，成本亦低，并且松針的藥用歷史悠久，體內(nèi)外試驗結(jié)果表明其有顯著的藥理作用，且安全性較高。目前以松針為原料開發(fā)的產(chǎn)品主要有面膜、糖果、酸奶、飲料、酒等日護品、食品及化妝品。本研究結(jié)果為利用松針資源進行天然抗氧化劑、降糖藥物以及酪氨酸酶活性抑制劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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（責任編輯：石春林）