不同品種綿羊肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)miRNA的篩選與功能預(yù)測(cè)

孟科 趙薇 郭晨浩 聶偉 陶毛孩 袁曉春 孫昊然 馮登偵

摘要： 為明確不同品種綿羊（Ovis aries）肌肉組織miRNA的表達(dá)情況，篩選影響綿羊肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)鍵miRNA，以灘羊、杜泊羊和小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，測(cè)定背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量并對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq），篩選綿羊脂肪沉積相關(guān)的差異表達(dá)miRNA。結(jié)果表明，灘羊肌內(nèi)脂肪含量顯著高于杜泊羊，極顯著高于小尾寒羊；杜泊羊肌內(nèi)脂肪含量顯著高于小尾寒羊。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量良好。3個(gè)品種綿羊共鑒定到134個(gè)已知miRNA和153個(gè)預(yù)測(cè)miRNA，這些 miRNA的長(zhǎng)度主要介于21～23 nt，且首位堿基對(duì)U堿基具有明顯偏好性。以P ≤0.05和|log2FC|>1（FC為差異倍數(shù)）為篩選條件，3個(gè)比較組共獲得42個(gè)差異表達(dá)miRNA；杜泊羊與灘羊比較組中篩選出22個(gè)差異表達(dá)miRNA；小尾寒羊與杜泊羊比較組中篩選出21個(gè)差異表達(dá) miRNA；小尾寒羊與灘羊比較組中篩選出12個(gè)差異表達(dá)miRNA。篩選出的42個(gè)miRNA靶向到326個(gè)靶基因，顯著富集到減數(shù)分裂I、肌肽-寡糖1，2-α-甘露糖苷酶活性和甘露寡糖甘露糖苷酶活性等303個(gè)基因本體（GO）條目，以及富集到α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、多巴胺能突觸、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑及N-聚糖生物合成等320個(gè)京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）代謝通路。根據(jù)GO和KEGG的功能描述進(jìn)一步篩選出23個(gè)miRNA及其靶向的119個(gè)靶基因可能參與脂肪沉積。進(jìn)一步構(gòu)建miRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終篩選到oar-miR-133、oar-miR-485-5p、novel_6、novel_85和novel_103等綿羊肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)鍵miRNA。隨機(jī)選擇的8個(gè)差異表達(dá)miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。本研究為深入開(kāi)展綿羊肌內(nèi)脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)理、高品質(zhì)綿羊品種的選育提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 綿羊；肌內(nèi)脂肪沉積；轉(zhuǎn)錄組；miRNA

中圖分類號(hào)： ?S826?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?? 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）07-1554-13

Screening and functional prediction of miRNA related to intramuscular fat deposition in different sheep breeds

MENG Ke1，2， ZHAO Wei1， GUO Chen-hao1， NIE Wei1， TAO Mao-hai1， YUAN Xiao-chun1， SUN Hao-ran1，F(xiàn)ENG Deng-zhen1

（1.School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China;2.Animal Husbandry and Fishery Technology Extension and Service Center， Shapotou District， Zhongwei City， Zhongwei 755000， China）

Abstract： In order to clarify the expression of miRNAs in muscle tissues of different breeds of sheep （Ovis aries） and screen the key miRNAs affecting intramuscular fat deposition in sheep， Tan sheep， Dorper sheep and Small Tail Han sheep were used as experimental materials. The intramuscular fat content of longissimus dorsi muscle was measured and transcriptome sequencing （RNA-Seq） was performed to screen the differentially expressed miRNAs related to fat deposition in sheep. The results showed that the intramuscular fat content of Tan sheep was significantly higher than that of Dorper sheep， and extremely significantly higher than that of Small Tail Han sheep， and the intramuscular fat content of Dorper sheep was significantly higher than that of Small Tail Han sheep. The quality of transcriptome sequencing was good. A total of 134 known miRNAs and 153 predicted miRNAs were identified in three breeds of sheep. The length of these miRNAs mainly ranged from 21 nt to 23 nt， and the first base had obvious preference for U base. With P≤0.05 and |log2FC|>1 （FC was the fold change）as the screening conditions， a total of 42 differentially expressed miRNAs were obtained from the three comparison groups. Twenty-two differentially expressed miRNAs were screened in the comparison group of Dorper sheep and Tan sheep， 21 differentially expressed miRNAs were screened in the comparison group of Small Tail Han sheep and Dorper sheep， and 12 differentially expressed miRNAs were screened in the comparison group of Small Tail Han sheep and Tan sheep. The screened 42 miRNAs targeted to 326 target genes， which were significantly enriched into 303 gene ontology（GO） entries such as meiosis I， mannosyl-oligosaccharide 1，2-α-mannosidase activity and mannosyl-oligosaccharide mannosidase activity， and 320 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） metabolic pathways such as α-linolenic acid metabolism， linoleic acid metabolism， dopaminergic synapses， insulin signaling pathway and N-glycan biosynthesis. According to the functional description of GO and KEGG， 23 miRNAs and 119 target genes might be involved in fat deposition. The miRNA targeted regulatory network was further constructed， and finally the key miRNAs for fat deposition in sheep such as oar-miR-133， oar-miR-485-5p， novel_6， novel_85 and novel_103 were screened. The qRT-PCR results of the eight randomly selected differentially expressed miRNAs were consistent with transcriptome sequencing results， indicating that the transcriptome sequencing results were reliable. This study provides a theoretical basis for further research on the molecular regulation mechanism of intramuscular fat deposition in sheep and the breeding of high-quality sheep breeds.

Key words： sheep;intramuscular fat deposition;transcriptome;miRNA

隨著生活質(zhì)量的提升，人們對(duì)羊肉的需求不僅僅滿足于數(shù)量，羊肉的品質(zhì)更加成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。羊肉的品質(zhì)主要由肉質(zhì)性狀決定，而肌內(nèi)脂肪（IMF）含量是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。IMF含量的高低影響到羊肉的風(fēng)味、嫩度、適口性及多汁性[1-2]。肌內(nèi)脂肪的形成以及含量受到遺傳、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)等多種因素的共同影響[3]。已有研究結(jié)果表明肌內(nèi)脂肪含量具有較高的遺傳力；在相同的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件下，遺傳背景成為影響羊肉肌內(nèi)脂肪的重要因素[4]。探究不同品種綿羊IMF含量差異及其分子調(diào)控機(jī)制對(duì)綿羊肉質(zhì)性狀改善具有重要意義。

MicroRNA（miRNA） 作為一類不編碼的小分子RNA，主要通過(guò)與mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合來(lái)抑制靶基因的表達(dá)而發(fā)揮作用[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究報(bào)道m(xù)iRNA在動(dòng)物脂肪的形成過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。邵靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-3p通過(guò)靶向調(diào)控KCTD15基因的表達(dá)從而影響延邊黃牛前體脂肪細(xì)胞分化；Ma等[7]研究結(jié)果表明， miR-26b-5p通過(guò)靶向調(diào)控FGF21基因促進(jìn)脂肪生成，參與調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-376a靶向調(diào)控KLF15基因，參與秦川牛的脂肪細(xì)胞增殖分化過(guò)程；Deng等[9]發(fā)現(xiàn)miR-27a 通過(guò)特異性結(jié)合視黃醇X受體α（RXRα） 抑制綿羊前脂肪細(xì)胞的分化。隨著測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)探究影響IMF沉積的研究也越來(lái)越多。Cheng等[10]通過(guò)RNA-Seq技術(shù)比較了不同肌內(nèi)脂肪含量豬背最長(zhǎng)肌的miRNA表達(dá)情況，篩選到18個(gè)差異miRNA可能參與調(diào)控脂肪酸合成和脂質(zhì)代謝；喻世剛等[11]通過(guò)比較高和低肌內(nèi)脂肪含量雞胸中miRNA的表達(dá)差異，篩選到5個(gè)miRNA參與到脂肪生成過(guò)程；Huang等[12]通過(guò)比較中國(guó)沼澤水牛肌肉和脂肪組織之間的差異miRNA，篩選到8個(gè)miRNA在水牛肌內(nèi)脂肪沉積過(guò)程中發(fā)揮重要作用。上述研究結(jié)果表明，應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)探究IMF沉積相關(guān)miRNA表達(dá)譜的研究較為成熟且已取得一定成果。但目前有關(guān)不同品種綿羊肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)miRNA的研究較少。本研究基于杜泊羊、灘羊和小尾寒羊3個(gè)品種綿羊的肌內(nèi)脂肪含量差異，通過(guò)RNA-Seq技術(shù)鑒定并篩選綿羊 IMF 沉積過(guò)程中差異表達(dá)的miRNA，探索miRNA調(diào)節(jié)綿羊肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)制。旨在為探究分子水平調(diào)控綿羊肉質(zhì)性狀提供參考，為高品質(zhì)綿羊品種的選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從寧夏宇泊科技有限公司石嘴山威震肉羊繁育場(chǎng)選擇飼養(yǎng)條件一致的8月齡健康綿羊品種杜泊羊、灘羊和小尾寒羊各8只（公母各4只）為試驗(yàn)材料。對(duì)綿羊進(jìn)行屠宰后，取第3肋骨到第12肋骨之間的背最長(zhǎng)肌組織作為樣品，放置于液氮中冷藏備用。

1.2 綿羊肌內(nèi)脂肪含量的測(cè)定

采用索氏脂肪抽提法對(duì)試驗(yàn)綿羊的肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行測(cè)定。具體測(cè)定方法是：（1）取適量冷藏樣品，剔除肉樣筋膜后，絞為肉糜，65 ℃烘干，測(cè)定100 g樣品中水分含量記為A；（2）取測(cè)試樣稱質(zhì)量記為W（g），用濾紙包好；（3）在102 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，記為W1（g）；（4） 將濾紙包好的樣品放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi)，倒入2/3體積的乙醚后接上冷凝裝置，在55 ℃恒溫水浴中抽提6～8 h。抽提結(jié)束后，在102 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，記為W2（g）。每品種3個(gè)重復(fù)。肌內(nèi)脂肪含量（IMFC）計(jì)算公式為：

IMFC=（W1-W2）/[（100-A）×W]。

1.3 總RNA提取與質(zhì)量控制

選擇上述3個(gè)綿羊品種母羊各3只，采用Trizol法提取樣品背最長(zhǎng)肌組織的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop分光光度計(jì)（Therom公司產(chǎn)品，美國(guó)）和Agilent 2100 生物分析儀（Agilent公司產(chǎn)品，美國(guó)）檢測(cè)RNA樣品的濃度、純度以及完整性。

1.4 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序

RNA樣品檢測(cè)合格后，使用小RNA樣品制備試劑盒（Small RNA Sample Pre Kit）進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。構(gòu)建方法為：首先利用小RNA的3′和 5′端的特殊結(jié)構(gòu)，以總RNA為起始樣品在小RNA兩端加上接頭，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和PAGE膠電泳對(duì)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行分離，切膠回收后得到cDNA文庫(kù)。對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后在Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 miRNA鑒定與表達(dá)分析

獲得原始序列后經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制得到有效序列，對(duì)有效序列進(jìn)行小RNA的種類和長(zhǎng)度篩選。使用Bowtie_0.12.9軟件將篩選得到的長(zhǎng)度為18～35 nt的小RNA對(duì)比到綿羊基因組（Oar_rambouillet_v1.0）參考序列上。將對(duì)比到參考序列的數(shù)據(jù)與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，注釋分析已知的miRNA；在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)未比對(duì)到的數(shù)據(jù)，通過(guò)miREvo_v1.1軟件預(yù)測(cè)新的miRNA，并利用mirdeep2_0_0_5軟件進(jìn)行分析。對(duì)鑒定到的miRNA利用Stringtie v1.3.3軟件進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算，采用TPM（transcript per million）值作歸一化處理。利用DESeq_1.2.10軟件分析樣本間miRNA的表達(dá)差異，以P≤0.05且|log2 FC|≥1（FC為差異位數(shù)）作為標(biāo)準(zhǔn)篩選表達(dá)差異miRNA。

1.6 差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能注釋和富集分析

使用miRanda-3.3a和RNAhybrid v2.0軟件預(yù)測(cè)表達(dá)差異miRNA的靶基因，取交集作為預(yù)測(cè)結(jié)果。miRanda-3.3a軟件參數(shù)設(shè)置為：-sc 140 -en -10 -scale 4-strict -out；RNAhybrid v2.0軟件參數(shù)設(shè)置為：-e 10 -p 0.05。以P≤0.05為顯著閾值，分別對(duì)表達(dá)差異miRNA的靶基因進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋及京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析。

1.7 候選miRNA與其靶基因的互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用Cytoscape 3.9.1軟件對(duì)篩選到的靶基因繪制互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 測(cè)序結(jié)果可靠性分析

為驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，測(cè)定不同綿羊品種8個(gè)差異表達(dá)miRNA的相對(duì)表達(dá)量，與RNA-seq測(cè)序表達(dá)量進(jìn)行一致性比較。利用Primer Premier 6.0軟件并采用頸環(huán)法設(shè)計(jì)miRNA引物，以U6作為內(nèi)參基因（表1）。熒光染料為TB Green Premix Ex Taq TMⅡ（TaKaBa，大連），所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：2×TB Green Premix Ex Taq II 10.0 μl，正向引物0.8 μl，反向引物0.8 μl，cDNA模板2.0 μl，RNase-free雙蒸水6.4 μl。qPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，39個(gè)循環(huán)；95 ℃延伸5 s，60 ℃維持1 min。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

以2-△△Ct方法進(jìn)行miRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，利用SPSS 26.0軟件對(duì)3個(gè)品種綿羊的肌內(nèi)脂肪含量和miRNA的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果圖片由GraphPad Prism V8.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊肌內(nèi)脂肪含量差異分析

3個(gè)綿羊品種肌內(nèi)脂肪含量如表2所示。灘羊肌內(nèi)脂肪含量最高，達(dá)5.42%，而小尾寒羊肌內(nèi)脂肪含量最低，2.10%。灘羊肌內(nèi)脂肪含量顯著高于杜泊羊，且極顯著高于小尾寒羊；杜泊羊肌內(nèi)脂肪含量顯著高于小尾寒羊。

2.2 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

本研究建立3個(gè)品種綿羊的9個(gè)背最長(zhǎng)肌組織樣品文庫(kù)，通過(guò)llumina平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序后，獲得原始序列共108 813 537條，質(zhì)控后獲得有效序列共107 166 390條。每個(gè)樣本的Q20在99%以上，Q30在96%以上，錯(cuò)誤率均為0.01%，堿基組成穩(wěn)定均衡（表3）。上述結(jié)果表明測(cè)序質(zhì)量良好，可用于進(jìn)一步分析。

2.3 miRNA的注釋與鑒定

在18～35 nt范圍內(nèi)，篩選各樣品中的有效序列[13]。篩選到的有效序列長(zhǎng)度在22 nt的序列所占比例最高，灘羊和小尾寒羊22 nt的read所占比例高于杜泊羊（圖1）。每個(gè)樣本至少有87%以上的小RNA序列比對(duì)到了綿羊基因參考序列上（表4）。在3種綿羊肌肉組織中共鑒定到134個(gè)已知miRNA和153個(gè)預(yù)測(cè)miRNA。對(duì)鑒定到的miRNA進(jìn)行首位堿基偏好性分析發(fā)現(xiàn)，已知miRNA和預(yù)測(cè)miRNA的首位堿基均對(duì)U堿基具有明顯偏好性（圖2）。

2.4 差異表達(dá)miRNA的篩選與分析

對(duì)3個(gè)綿羊品種miRNA 的表達(dá)量進(jìn)行兩兩比較分析。 杜泊羊與灘羊比較組中篩選出差異表達(dá)miRNA 22個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)13個(gè)，下調(diào)表達(dá)9個(gè)；小尾寒羊與杜泊羊比較組中篩選出21個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)表達(dá)13個(gè)，下調(diào)表達(dá)8個(gè)；小尾寒羊與灘羊比較組中篩選出12個(gè)差異表達(dá) miRNA，其中上調(diào)表達(dá)9個(gè)，下調(diào)表達(dá)3個(gè)（圖3）。3個(gè)比較組中沒(méi)有共表達(dá)的差異表達(dá)miRNA，小尾寒羊與灘羊比較組與杜泊羊與灘羊比較組，小尾寒羊與杜泊羊比較組之間均有4個(gè)共表達(dá)的差異表達(dá)miRNA，杜泊羊與灘羊比較組與小尾寒羊與杜泊羊比較組之間有5個(gè)共表達(dá)的差異表達(dá)miRNA。3個(gè)比較組中共篩選出42個(gè)差異表達(dá)miRNA（圖4）。篩選出的miRNA包括23個(gè)已知miRNA和19個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA。篩選出的已知miRNA的差異表達(dá)信息如表5所示。

2.5 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

篩選出的42個(gè)差異表達(dá) miRNA預(yù)測(cè)到326個(gè)靶基因，形成411個(gè)靶向關(guān)系對(duì)。其中，novel_85、oar-miR-133和oar-miR-485-5p預(yù)測(cè)到的靶基因數(shù)量較多。novel_85預(yù)測(cè)到99個(gè)靶基因，包括糖原合酶基因（GYS1）、組蛋白脫乙酰酶3基因（HDAC3）、胰島素樣生長(zhǎng)因子II基因（IGF2）等；oar-miR-133預(yù)測(cè)到55個(gè)靶基因，包括肌球蛋白 IA基因（MYO1A）、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶1基因（ODC1）、磷脂酶 A2基因（PLA2）等；oar-miR-485-5p預(yù)測(cè)到29個(gè)靶基因，包括甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因（MPI）、羥酰基谷胱甘肽水解酶基因（HAGH）、跨膜絲氨酸蛋白酶2基因（TMPRSS2）等。對(duì)每組預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行功能分析。 GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，杜泊羊與灘羊比較組顯著富集到111個(gè)GO條目，其中生物學(xué)過(guò)程51個(gè)，細(xì)胞組分24個(gè)，分子功能36個(gè)；小尾寒羊與杜泊羊比較組顯著富集到97個(gè)GO條目，其中生物學(xué)過(guò)程51個(gè)，細(xì)胞組分11個(gè)，分子功能35個(gè)；小尾寒羊與灘羊比較組顯著富集到95個(gè)GO條目，其中生物學(xué)過(guò)程41個(gè)，細(xì)胞組分6個(gè)，分子功能48個(gè)。根據(jù)P值大小每組前20的GO條目如圖5所示，顯著富集在減數(shù)分裂、減數(shù)分裂前期、清道夫受體活性、貨物受體活性、肌肽-寡糖1，2-α-甘露糖苷酶活性和甘露寡糖甘露糖苷酶活性等GO條目。KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，杜泊羊與灘羊比較組富集到106個(gè)通路，7個(gè)通路顯著富集；小尾寒羊與杜泊羊比較組富集到168個(gè)通路，4個(gè)通路顯著富集；小尾寒羊與灘羊比較組富集到46個(gè)通路，5個(gè)通路顯著富集。根據(jù)P值大小每組前20個(gè)信號(hào)富集通路如圖6所示，顯著富集的通路主要有α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、多巴胺能突觸、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑、N-聚糖的生物合成和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代謝通路。根據(jù)GO和KEGG的功能描述篩選出23個(gè)差異表達(dá)miRNA及其靶向的119個(gè)基因可能參與脂肪沉積。

2.6 miRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

篩選出的119個(gè)可能參與脂肪沉積的靶基因與23個(gè)差異表達(dá)miRNA構(gòu)成129個(gè)靶向關(guān)系對(duì)，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如圖7所示。通過(guò)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，oar-miR-133、oar-miR-485-5p、novel_6、novel_85和novel_103靶向到較多的靶基因且構(gòu)成了完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，故推測(cè)其可能是調(diào)控綿羊脂肪沉積的關(guān)鍵miRNA。

2.7 miRNA表達(dá)驗(yàn)證

利用qRT-PCR得到3個(gè)綿羊品種8個(gè)差異表達(dá)miRNA（oar-miRNA-99a、oar-miR-26a、oar-miR-374b、oar-miR-19b、novel_9、novel_202、 novel_82、novel_62）的相對(duì)表達(dá)量與RNA-seq測(cè)序得到的這8個(gè)miRNA表達(dá)趨勢(shì)基本保持一致（圖8），說(shuō)明測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠。

3 討論

3.1 3個(gè)品種綿羊肌內(nèi)脂肪含量差異

肉質(zhì)性狀是綿羊關(guān)鍵的經(jīng)濟(jì)性狀，也是育種者關(guān)注的重要問(wèn)題。IMF含量的高低影響羊肉的食用價(jià)值。灘羊作為中國(guó)特有的裘皮綿羊品種，其肉質(zhì)細(xì)嫩、無(wú)膻味；杜泊羊原產(chǎn)自南非國(guó)家，產(chǎn)肉性能高，是育肥生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)品種；而小尾寒羊具有繁殖率高的特點(diǎn)，是一產(chǎn)多羔的代表性品種[14]。3個(gè)品種中，灘羊的肌內(nèi)脂肪含量最高，而小尾寒羊最低。灘羊和杜泊羊作為優(yōu)質(zhì)的肉羊品種，肌內(nèi)脂肪含量均高于小尾寒羊。

3.2 3個(gè)品種綿羊背最長(zhǎng)肌miRNA的鑒定及特征

微小核糖核酸（miRNA）是由20～24個(gè)核苷酸堿基組成的非編碼內(nèi)源性小分子RNA[15]。本研究從3個(gè)品種綿羊背最長(zhǎng)肌中共鑒定到134個(gè)已知miRNA和153個(gè)預(yù)測(cè)miRNA，其長(zhǎng)度主要分布在21～23 nt，且長(zhǎng)度為22 nt的miRNA占比最高，符合miRNA的長(zhǎng)度分布特征。對(duì)鑒定到的miRNA進(jìn)行首位堿基偏向性分析，發(fā)現(xiàn)首位堿基偏向于U堿基。這與Liu等[16]在綿羊骨骼肌中鑒定到miRNA的首堿基偏向性和付雪峰等[17]在藏絨山羊皮膚組織中鑒定出的miRNA的首位堿基偏向性一致。miRNA的首位堿基對(duì)U堿基的偏好性可能與miRNA的形成以及其對(duì)靶基因的沉默機(jī)制有關(guān)[18]。

3.3 綿羊肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)miRNA的篩選

本研究在杜泊羊、灘羊和小尾寒羊的背最長(zhǎng)肌中篩選獲得42個(gè)差異表達(dá)miRNA，包括23個(gè)已知的miRNA和19個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA。進(jìn)一步通過(guò)表達(dá)量差異篩選出23個(gè)可能與綿羊背最長(zhǎng)肌脂肪沉積相關(guān)的miRNA。篩選出的這些已知miRNA已有部分被證實(shí)參與調(diào)節(jié)脂肪沉積和脂質(zhì)代謝。例如，miR-433-3p對(duì)支鏈酮酸脫氫酶β（BCKDHB）有負(fù)調(diào)控作用，影響綿羊前體脂肪細(xì)胞分化從而參與調(diào)節(jié)綿羊的脂肪代謝[19]; miR-27a 通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因RXRα的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)綿羊前脂肪細(xì)胞增殖并抑制綿羊前脂肪細(xì)胞分化，在調(diào)節(jié)綿羊肌肉脂肪和皮下脂肪組織之間的差異脂肪積累中起重要作用[9]；miR-143是與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的miRNA之一，通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)奶牛脂肪細(xì)胞分化和甘油三酯合成[20]。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-26a 和miR-143在成年肉牛肌內(nèi)脂肪中的表達(dá)量顯著高于皮下脂肪; 汪海洋等[22]研究發(fā)現(xiàn)miR-143在西門塔爾牛肌內(nèi)脂肪組織中表達(dá)量高于皮下脂肪。本研究中，miR-26a作為杜泊羊與灘羊比較組和小尾寒羊與灘羊比較組中篩選出共有的差異表達(dá)miRNA，在灘羊肌肉組織中表達(dá)量顯著高于杜泊羊和小尾寒羊，且杜泊羊的表達(dá)量略高于小尾寒羊；同樣，miR-143在杜泊羊與灘羊比較組中被篩選出來(lái)，該miRNA在灘羊肌肉組織中表達(dá)量高于杜泊羊。在3個(gè)品種綿羊肌內(nèi)脂肪含量分析中，灘羊IMF含量最高而小尾寒羊最低，上述2個(gè)miRNA表達(dá)量的研究結(jié)果也符合該特征。同樣，let-7b是小尾寒羊與杜泊羊比較組和小尾寒羊與灘羊比較組中篩選出共有的差異表達(dá)miRNA，且與miR-26a在3個(gè)品種綿羊肌肉組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致，即高肌內(nèi)脂肪含量的組織中l(wèi)et-7b表達(dá)量亦高。這個(gè)結(jié)果與喻世剛等[11]發(fā)現(xiàn)的雞胸肌內(nèi)脂肪含量與let-7b表達(dá)量的關(guān)系一致。上述結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明本研究篩選出的miRNA作為與綿羊肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)的候選miRNA的可靠性。但這些miRNA對(duì)綿羊肌肉脂肪含量的影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.4 差異miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

篩選出的42個(gè)差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)到326個(gè)靶基因，形成411個(gè)靶向關(guān)系對(duì)。值得注意的是novel_85預(yù)測(cè)到99個(gè)靶基因，為差異表達(dá)miRNA中靶向到最多候選基因的miRNA。這些候選的靶向基因可以參與脂肪沉積。GYS1基因與糖原代謝相關(guān)，其突變影響到肌糖原的沉積[23]；HDAC3蛋白的復(fù)合物使過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ2（Peroxisome proliferator-activated receptor γ2）基因（PPARG2）轉(zhuǎn)錄失活，從而參與到脂肪生成過(guò)程[24]；IGF2基因的突變?cè)斐韶i肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量存在差異，可以參與到脂肪組織中脂肪酸的形成。上述研究結(jié)果表明，novel_85可能是參與綿羊脂肪沉積及脂肪代謝的關(guān)鍵miRNA。另外也有一些差異表達(dá)miRNA靶向的基因與脂肪沉積和脂肪代謝相關(guān)的研究。如oar-miR-133和oar-miR-485-5p同時(shí)靶向的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因（P1GSTP1）可以參與到脂質(zhì)代謝過(guò)程[25]；novel_103靶向的丙酮酸脫氫酶激酶4基因（PDK4），在中國(guó)草原紅牛的研究中發(fā)現(xiàn)該基因的多態(tài)性與其肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)[26]；oar-miR-433-3p靶向的色氨酸3基因（SESN3）參與調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞脂肪生成[27]。為了進(jìn)一步了解篩選出的差異miRNA的功能，對(duì)其預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行功能分析。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，富集顯著的條目包括糖原代謝過(guò)程、油酸酯水合酶活性、三羧酸循環(huán)過(guò)程、低密度脂蛋白顆粒受體結(jié)合等與糖代謝及脂質(zhì)代謝相關(guān)的條目。KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，可以富集到α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、多巴胺能突觸、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及脂肪的消化和吸收通路。已有研究結(jié)果表明，α-亞麻酸會(huì)影響奶牛乳腺中的脂肪酸代謝[28]，亞油酸可以增加呼吸鏈解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）和肉堿-棕櫚油轉(zhuǎn)移酶1 （CPT1）的表達(dá)，促進(jìn)脂肪降解[29]，并且不同共軛亞油酸對(duì)小鼠的脂肪沉積具有顯著差異 [30]。上述研究結(jié)果表明，篩選出差異表達(dá)miRNA的靶基因可能參與脂肪沉積。根據(jù)GO和KEGG的功能描述篩選出可能參與綿羊脂肪沉積的119個(gè)靶基因，并對(duì)靶向關(guān)系進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。研究認(rèn)為，oar-miR-133、oar-miR-485-5p、novel_6、novel_85和novel_103可能是參與綿羊肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)鍵miRNA。但miRNA 對(duì)靶基因和 IMF 沉積的影響和調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)行進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

杜泊羊，灘羊和小尾寒羊這3個(gè)品種綿羊IMF含量存在差異，灘羊肌內(nèi)脂肪含量最高而小尾寒羊最低。篩選出23個(gè)已知的和19個(gè)未知的差異表達(dá)miRNA可能參與綿羊肌內(nèi)脂肪沉積，oar-miR-133、oar-miR-485-5p、novel_6、novel_85和novel_103可能是綿羊肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)鍵調(diào)控miRNA。

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（責(zé)任編輯：石春林）