不明原因散發(fā)性全面發(fā)育遲緩兒童遺傳因素預(yù)測(cè)表的制訂及臨床應(yīng)用*

張峰，周笑涵，黃金容，羅瓊，龔強(qiáng)

（1.贛州市婦幼保健院 兒童神經(jīng)康復(fù)科，江西 贛州 341000；2.長(zhǎng)沙金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

全面發(fā)育遲緩（global developmental delay, GDD）指年齡＜ 5 歲，存在≥ 2 個(gè)能區(qū)沒有達(dá)到預(yù)期發(fā)育標(biāo)志，且無法接受系統(tǒng)性智力功能評(píng)估的兒童[1]。GDD 的病因診斷流程較為復(fù)雜，多數(shù)與遺傳因素有關(guān)。盡管多數(shù)研究指出，在沒有明確病因診斷線索時(shí)，拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV）檢測(cè)可以作為GDD 的一線病因?qū)W診斷方法[2-3]，但GDD 兒童臨床癥狀復(fù)雜多樣且有遺傳異質(zhì)性，臨床醫(yī)師在分析其遺傳病因時(shí)多依靠臨床經(jīng)驗(yàn)，主觀性較強(qiáng)，目前尚無簡(jiǎn)單易行的方法對(duì)其遺傳學(xué)病因的概率進(jìn)行快速判斷，沒有統(tǒng)一的量化標(biāo)準(zhǔn)[4]。本研究旨在通過分析GDD 患兒的遺傳學(xué)臨床特征，制訂不明原因GDD 患兒遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)表，以量化分值的方式幫助臨床醫(yī)師，尤其是非神經(jīng)遺傳專科醫(yī)師，快速篩選出需要進(jìn)一步進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)的患兒，縮短病因?qū)W診斷流程，避免重復(fù)檢查或漏診。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2019 年6 月—2022 年6 月在贛州市婦幼保健院兒童神經(jīng)康復(fù)科就診的散發(fā)性不明原因GDD患兒396 例。依據(jù)基因測(cè)序結(jié)果將檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的患兒歸為陽(yáng)性組（130 例），檢測(cè)結(jié)果陰性的患兒歸為陰性組（266 例）。陽(yáng)性組男性84 例，女性46 例；中位數(shù)月齡18（8，50）個(gè)月。陰性組男性191 例，女性75 例；中位數(shù)月齡22（9，49）個(gè)月。兩組患兒性別、月齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬簽署同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合GDD 診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；②依據(jù)《兒童智力障礙或全面發(fā)育遲緩病因診斷策略專家共識(shí)》[1]常規(guī)非遺傳學(xué)檢查仍無法明確病因?qū)W診斷的GDD 患兒；③依據(jù)《兒童智力障礙或全面發(fā)育遲緩病因診斷策略專家共識(shí)》[1]中診斷程序進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①依據(jù)上述專家共識(shí)，經(jīng)家族史、體格檢查、臨床非遺傳學(xué)輔助檢查即可明確病因?qū)W診斷的患兒；②孕期及圍生期病史不明，或兒童遺傳背景不清晰的患兒；③患兒正在接受基因治療或其他因素導(dǎo)致遺傳物質(zhì)改變的因素；④既往已經(jīng)在產(chǎn)前診斷篩查或常規(guī)核型分析中明確診斷的患兒。

1.3 方法

1.3.1 不明原因GDD 患兒遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)表的編制方法 查閱不明原因發(fā)育遲緩病因?qū)W研究相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，結(jié)合臨床專家意見初步將25 項(xiàng)GDD 患兒可能存在的臨床特征作為相關(guān)因素納入量表?xiàng)l目池[8]。依據(jù)經(jīng)典測(cè)量理論（classical test theory,CTT）區(qū)分度分析法及逐步回歸法進(jìn)行量表?xiàng)l目篩選[9]。將患兒的基因檢測(cè)結(jié)果作為因變量，再將收集的25 項(xiàng)臨床特征作為自變量，先對(duì)比各項(xiàng)條目在陽(yáng)性組和陰性組間的差異，結(jié)合文獻(xiàn)分析及專家經(jīng)驗(yàn)，確定本量表的入選條目。將其中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的條目納入Logistic 回歸模型，進(jìn)一步分析各條目預(yù)測(cè)陽(yáng)性基因結(jié)果的能力，據(jù)此對(duì)各項(xiàng)條目進(jìn)行賦分，制作不明原因GDD 患兒遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)表。遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)表用于對(duì)所有入選患兒進(jìn)行復(fù)測(cè)，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線分析本量表預(yù)測(cè)患兒基因診斷的能力，并計(jì)算最佳截?cái)嘀礫10]，同時(shí)得出對(duì)應(yīng)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值，評(píng)估本量表應(yīng)用于臨床GDD 診斷流程的實(shí)用價(jià)值。

1.3.2 基因測(cè)序方法 采集患者及其父母外周血各3 mL 置于抗凝管。使用血液基因組柱式中量提取試劑盒（中國(guó)康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）提取基因組DNA，用Qubit 2.0 型熒光計(jì)、0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA 樣本進(jìn)行質(zhì)檢。使用xGen?Exome Research Panel v1.0 捕獲探針（美國(guó)IDT 公司，）與基因組DNA 文庫(kù)序列進(jìn)行液體雜交，將目標(biāo)區(qū)域DNA 片段進(jìn)行富集，構(gòu)建全外顯子文庫(kù)。二代測(cè)序在NovaSeq 6000 測(cè)序儀（美國(guó)Illumina 公司）上進(jìn)行高通量測(cè)序，目標(biāo)序列測(cè)序覆蓋度≥ 99%。CNV-seq 分析使用患者2 mL 外周血標(biāo)本，經(jīng)基因組片段化、末端補(bǔ)平修復(fù)、3'-端腺苷化和加多聚A 接頭后，經(jīng)4～6 輪連接介導(dǎo)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，建立全基因組文庫(kù)。高通量測(cè)序在NovaSeq 6000 測(cè)序儀上完成，使用BWA 軟件包，將測(cè)序序列與Ensemble參考基因組GRCh37/hg19 進(jìn)行比對(duì)。變異致病性使用美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)臨床實(shí)踐指南分級(jí)[11]，最后由臨床醫(yī)師確認(rèn)報(bào)告結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用Fisher 確切概率法；影響因素的分析用多因素逐步Logistic 回歸模型；繪制ROC 曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒臨床特征分析及量表?xiàng)l目篩選

陽(yáng)性組與陰性組患兒父親高齡生育、MRI 提示結(jié)構(gòu)畸形、癲癇、毛發(fā)異常、頭圍異常、顱骨外觀異常、皮膚異常、眼外觀異?；蚧巍⒈橇和庥^異?；蚧?、耳廓畸形或耳位異常、下頜畸形、牙齒異常、出生低張力、非智力因素合并癥比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患兒母親高齡生育、父母不良生活史、不明原因流產(chǎn)史、輔助生殖、早產(chǎn)、孕期及圍生期異常史、孤獨(dú)癥譜系障礙、口腔或腭弓畸形、生殖器外觀異常、肢體畸形、器官畸形比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)文獻(xiàn)檢索提示肢體畸形、器官畸形高度提示遺傳性病因[12]，結(jié)合專家經(jīng)驗(yàn)，仍將其保留。最終將父母不良生活史、不明原因流產(chǎn)史、輔助生殖、早產(chǎn)、孕期及圍生期異常史、孤獨(dú)癥譜系障礙6 項(xiàng)條目從量表中剔除。將剩余的19 個(gè)項(xiàng)目確定為最終量表?xiàng)l目。見表1。

2.2 量表?xiàng)l目整理

以基因檢測(cè)結(jié)果為因變量（陽(yáng)性組= 1，陰性組=2），以假設(shè)檢驗(yàn)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（以P＜0.20）的指標(biāo)即父親高齡生育、父母不良生活史、不明原因流產(chǎn)史、MRI 提示腦結(jié)構(gòu)畸形、毛發(fā)異常、頭圍異常（頭圍無異常= 0，頭圍偏小= 1，頭圍偏大= 2）、顱骨外觀異常、皮膚異常、眼外觀異?；蚧?、鼻梁外觀異常或畸形、耳廓畸形或耳位異常、下頜畸形、口腔或腭弓畸形、生殖器外觀異常、出生低張力、非智力因素合并癥、器官畸形為自變量（除頭圍外各自變量無異常賦值為0，有異常賦值為1），進(jìn)行多因素逐步Logistics 回歸分析（引入水準(zhǔn)是0.05，剔除水準(zhǔn)是0.10），結(jié)果顯示：鼻梁外觀異?；蚧蝃=5.272（95% CI：1.007，27.607）]、耳廓畸形或耳位異常[=6.987（95% CI：1.555，31.383] 及非智力因素合并癥[=3.826（95% CI：1.884，7.771] 均為GDD 患兒遺傳學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)因素（P＜0.05）。見表2。

表2 不明原因GDD患兒遺傳風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因素的多因素逐步Logistic回歸分析參數(shù)

依據(jù)以上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及專家經(jīng)驗(yàn)，筆者將最終保留的條目合并整理為5 大類條目（雙親因素、異常面容、器官畸形、非智力因素合并癥、異常頭顱MRI 改變）作為最終量表?xiàng)l目。依據(jù)GDD 基因測(cè)序指南[13]，將陽(yáng)性家族史、既往產(chǎn)前診斷遺傳學(xué)篩查陽(yáng)性、具有典型的面容及臨床癥狀作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素。依據(jù)Logistics 回歸分析，將鼻梁及鼻翼畸形（包括鼻梁扁平）、耳廓畸形或耳位異常、非智力因素合并癥3 項(xiàng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目賦值2 分，鑒于鼻梁畸形與耳廓畸形的高權(quán)重值，將單獨(dú)列出，各賦值2 分。文獻(xiàn)報(bào)道，不明原因GDD兒童神經(jīng)發(fā)育障礙或腦結(jié)構(gòu)畸形MRI 改變高度提示遺傳性病因，因此賦值2 分[14-15]。除鼻梁與耳廓畸形的其他外觀異常，每項(xiàng)賦值1 分，最高2 分。不明原因GDD 患兒遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)表的最終版本見表3。

表3 不明原因GDD患兒遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)表

2.3 不明原因GDD患兒遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)表最佳截?cái)嘀?/h3>

對(duì)396 例PDD 患兒信息使用本量表進(jìn)行復(fù)測(cè)，以基因檢測(cè)結(jié)果為因變量（陰性組= 2，陽(yáng)性組= 1），以患兒量表分?jǐn)?shù)為自變量，繪制ROC 曲線，分析本量表預(yù)測(cè)患兒基因診斷的效能，并計(jì)算最佳截?cái)嘀?，結(jié)果顯示曲線下面積（area under curve, AUC）為0.707（95% CI：0.649，0.765）。見圖1。

圖1 遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)表預(yù)測(cè)PDD患兒的ROC曲線

計(jì)算約登指數(shù)后得出最佳截?cái)嘀禐?.5 分，但由于量表實(shí)際賦值均為整數(shù)，可認(rèn)為最佳截?cái)嘀禐? 分，其所對(duì)應(yīng)的敏感性為60.8%（95% CI：0.518，0.691），特異性為75.6%（95% CI：0.699，0.805）。其他最佳截?cái)嘀祵?duì)應(yīng)的各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)值見表4。

表4 不同最佳截?cái)嘀导傲勘矸謹(jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)值

3 討論

GDD 為暫時(shí)性診斷，在年齡＞ 5 歲時(shí)，如達(dá)到智力低下診斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該修正診斷。一些輕度發(fā)育遲緩的兒童通過適當(dāng)?shù)闹С中源胧? 歲前可能進(jìn)步至正常功能范圍而不再符合智力障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]。對(duì)GDD 兒童進(jìn)行準(zhǔn)確的病因?qū)W診斷是臨床進(jìn)行有效康復(fù)治療的前提，能最大限度地減輕患兒功能障礙程度，改善預(yù)后[6,17]。由于GDD 兒童病因的多樣性，診斷流程較為復(fù)雜，臨床醫(yī)師在診斷過程中常常在時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本的選擇中難以抉擇[6]。文獻(xiàn)報(bào)道，GDD 兒童遺傳因素病因占30%～50%[18]。在決定是否需要進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)時(shí)，家長(zhǎng)通常希望醫(yī)師能針對(duì)孩子檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率給出準(zhǔn)確的估值。本研究通過簡(jiǎn)單的量表評(píng)分就能直觀地提供量化數(shù)據(jù)，同時(shí)整合了遺傳病因GDD 患兒的臨床特征，以方便臨床醫(yī)師辨識(shí)，并明確各項(xiàng)特征的權(quán)重，為臨床醫(yī)師對(duì)患兒是否需要進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)提供決策參考，從而縮短GDD 兒童的診斷時(shí)間，也能幫助家長(zhǎng)理解患兒病情，提高診療依從性。

當(dāng)患兒得分為1 分時(shí)，此時(shí)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.330，即患兒只有33%的概率基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；當(dāng)患兒得分為3 分時(shí)，患兒為真陽(yáng)性的可能性為54.8%；而當(dāng)患兒得分為9 分和＞ 14 分時(shí)，患兒為真陽(yáng)性的概率分別達(dá)到75%和100%。

有研究報(bào)道，通過CMA 和WES 對(duì)GDD 兒童進(jìn)行病因?qū)W診斷的陽(yáng)性率為60.7%，ID 合并運(yùn)動(dòng)障礙的陽(yáng)性診斷率可達(dá)100%[19]，目前多個(gè)GDD 診療指南的病因診斷流程均推薦CMA 作為一線檢測(cè)手段[1，15，20]，如仍無法明確診斷再選擇二代測(cè)序的相關(guān)檢測(cè)方法。但各項(xiàng)指南均推薦在臨床特征具有特異指向性的情況下，如陽(yáng)性家族史、既往產(chǎn)前診斷遺傳學(xué)篩查陽(yáng)性、具有典型的面容及臨床癥狀，應(yīng)針對(duì)其進(jìn)行特異性遺傳學(xué)檢測(cè)。因本量表的制訂主要是為了解決無臨床線索GDD 患兒的遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，故此將以上因素視為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推薦直接對(duì)其進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的遺傳學(xué)檢測(cè)，而并未進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)測(cè)序評(píng)分。

本研究在進(jìn)行各項(xiàng)臨床特征統(tǒng)計(jì)時(shí)，多因素逐步Logistic 回歸分析提示只有鼻梁及鼻翼畸形（包括鼻梁扁平）、耳廓畸形或耳位異常、非智力因素合并癥3 項(xiàng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然鼻梁畸形與耳廓畸形同屬器官畸形，鑒于其高權(quán)重值，將其單獨(dú)列出。母親高齡生育在初始統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但回顧樣本數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，高齡母親與高齡父親的伴隨關(guān)系呈高度一致性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。因此，本研究將父母高齡均作為危險(xiǎn)因素納入統(tǒng)計(jì)范疇。不明原因流產(chǎn)史雖然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但只發(fā)生在陰性組，屬于陰性指標(biāo)，因此并未納入預(yù)測(cè)指標(biāo)。父母不良生活史、輔助生殖、早產(chǎn)、孕期及圍生期異常史的影響因素眾多，難以用單一遺傳因素進(jìn)行解釋。依據(jù)現(xiàn)有研究證據(jù)，孤獨(dú)癥譜系障礙的病因系多基因病的可能性大，且與環(huán)境因素有關(guān)。加之以上因素在兩組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此將以上因素排除，不作為遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素的預(yù)測(cè)指標(biāo)。最終，本研究選定了5 項(xiàng)指標(biāo)作為GDD 遺傳風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的最終量表?xiàng)l目，分別是雙親因素、異常面容、器官畸形、非智力因素合并癥及異常頭顱MRI 改變。

目前涉及GDD 的已知遺傳綜合征有300 多種，盡管遺傳學(xué)測(cè)序技術(shù)有了明顯的提升，但仍有多種疾病涉及多基因及其他環(huán)境因素而無法明確具體病因[22]。de VRIES 等[23]試圖通過量表篩查的方法來幫助臨床醫(yī)師識(shí)別脆性X 綜合征，該量表將家族史、皮膚、耳朵、面容、關(guān)節(jié)、睪丸及人格癥狀7 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，得分越高脆性X 綜合征的可能性越大。該篩查量表的使用使得脆性X 的識(shí)別更為簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確率也更高[23]。本研究涉及的量表涵蓋了該量表的內(nèi)容，依據(jù)其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)評(píng)分，除外家族史獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具備所有脆性X 綜合征特征的患者得分在8 分，提示具有95%的遺傳學(xué)病因風(fēng)險(xiǎn)，兩者均具有預(yù)測(cè)其遺傳學(xué)病因風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值，結(jié)論一致。de VRIES 等[24]在后期又制作了一份亞端粒重排患者檢視表，該量表將智能落后家族史、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、生后發(fā)育遲緩、頭圍、矮身材、面部畸形及其他臟器畸形作為評(píng)分指標(biāo)，評(píng)分最佳截?cái)嘀禐? 分；該量表同樣可以提高疾病的臨床識(shí)別率及準(zhǔn)確率。在除外獨(dú)立危險(xiǎn)因素族史的情況下，依據(jù)該量表評(píng)分指標(biāo)進(jìn)行不明原因全面發(fā)育落后遺傳風(fēng)險(xiǎn)量表評(píng)分，亞端粒重排患者得分為10 分，提示具有97.7%的遺傳學(xué)病因風(fēng)險(xiǎn)，兩者結(jié)論一致。但與本研究量表相似，de VRIES 等[23-24]設(shè)計(jì)的2 個(gè)量表也存在隨分值增加特異性升高，但敏感性下降的問題。

作為一項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)提示作用的量表，本量表仍然存在許多不足[25]。由于本研究涉及的樣本是在排查非遺傳性病因后仍無法明確病因的GDD 兒童樣本。因此，本研究提供的遺傳因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)量表并不能作為獨(dú)立遺傳學(xué)檢測(cè)參考依據(jù)，無法替代醫(yī)師的臨床判斷。盡管國(guó)內(nèi)學(xué)者認(rèn)為遺傳性因素占多數(shù)，但對(duì)于遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)均基于臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，尚無量化指標(biāo)[26-27]。在臨床上仍然無法通過快速量表化篩查出病因?qū)W結(jié)論[28]，本研究對(duì)GDD 兒童病因?qū)W篩查提供了一種新思路，具有一定創(chuàng)新性。

盡管本研究提供的量表AUC 為0.707，但在進(jìn)行最佳截?cái)嘀涤?jì)算時(shí)，無論取哪一個(gè)分值作為預(yù)測(cè)閾值，均不能同時(shí)取得較為滿意的敏感性和特異性。本研究通過約登指數(shù)計(jì)算得出GDD 遺傳風(fēng)險(xiǎn)檢查表的最佳截?cái)嘀禐椤?3 分，其敏感性為60.8%，特異性為75.6%，這將會(huì)漏診約39.2%的真陽(yáng)性患兒，并誤診24.4%的真陰性患兒。而將閾值設(shè)為≥ 1 分時(shí)，雖然敏感性達(dá)97.7%，幾乎不會(huì)漏診，但同時(shí)量表也會(huì)將絕大多數(shù)（96.6%）真陰性的患兒預(yù)測(cè)為假陽(yáng)性，使量表基本失去了篩選的作用，故仍有待進(jìn)一步完善及修正。