一種過氧化氫清除劑對銅脅迫下黃瓜種子萌發(fā)的影響

李鑫 羅安才

摘要 二甲基硫脲（Dimethylthiourea， DMTU）是一種H2O2清除劑，為了探究DMTU對銅脅迫下黃瓜種子萌發(fā)的影響，以黃瓜種子“津瑞100”為材料，采用紙上發(fā)芽法，測定了0.5 mmol/L DMTU浸種處理對90 mg/L CuSO4脅迫下黃瓜種子萌發(fā)及相關(guān)生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：在90 mg/L CuSO4脅迫下，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和胚根長均受到抑制；經(jīng)過0.5 mmol/L DMTU浸種后，黃瓜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著提高，促進(jìn)了胚根生長；降低了種子H2O2含量和抗氧化酶（POD、APX）的活性，減輕了銅脅迫下對黃瓜種子萌發(fā)的影響。

關(guān)鍵詞 黃瓜；銅脅迫；DMTU；抗氧化酶

中圖分類號：S682.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：2095–3305（2023）09–0046-03

近年來，隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，大量含重金屬的工業(yè)污水通過灌溉進(jìn)入農(nóng)田土壤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國受重金屬污染的耕地面積已經(jīng)達(dá)到總耕地面積的1/5，并且呈上升趨勢。重金屬會導(dǎo)致植物的生長發(fā)育、生理生化等代謝過程受到很大影響，并且植物體內(nèi)的重金屬會隨著食物鏈?zhǔn)澄锞W(wǎng)的傳遞進(jìn)入人體，極大地危害人類健康。

銅屬于植物的微量元素之一，低濃度的Cu2+參與植物的電子轉(zhuǎn)移和光合作用，但是過量的Cu2+對植物會產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致種子發(fā)芽失敗[1]。國內(nèi)外有許多使用重金屬脅迫種子的研究，大都分析了重金屬對種子萌發(fā)和生理特性的影響。李桂玲等[2]研究發(fā)現(xiàn)，隨著重金屬濃度的升高，重金屬溶液對種子萌發(fā)呈先促進(jìn)后抑制的影響。郝曉華

等[3]研究表明，隨著銅濃度的增加，藜麥種子的SOD酶、可溶性蛋白、過氧化氫酶等的含量升高。

過氧化氫（H2O2）是植物體生長發(fā)育過程中產(chǎn)生的活性氧。近年來，通過大量的研究，過氧化氫（H2O2）作為信號分子廣泛參與了植物的各種生理過程，如植物的生長發(fā)育、衰老、防御反應(yīng)、超敏反應(yīng)和植物抗逆性等。但H2O2對植物具有雙重作用，低濃度下作為信號分子參與生物生理反應(yīng)，超過一定含量會對植物產(chǎn)生毒害作用[4]。在高濃度銅的脅迫下，植物體內(nèi)的H2O2含量會有一定的增加，而二甲基硫脲（DMTU）作為一種過氧化氫消除劑，可以調(diào)控植物體內(nèi)的過氧化氫水平，降低植物體內(nèi)的H2O2含量，從而對H2O2的毒害起到一定的緩解效

果[5]。劉建新等[6]研究表明，外源H2O2能增加在堿脅迫燕麥幼苗的SOD、CAT、APX等抗氧化酶的含量，而在添加H2O2清除劑DMTU后，完全逆轉(zhuǎn)了外源H2O2對堿脅迫下燕麥幼苗的緩解作用。Zacchini等[7]研究發(fā)現(xiàn)，DMTU可清除由外源亞精胺引起玉米根系產(chǎn)生的H2O2 。

有許多針對銅脅迫對黃瓜種子萌發(fā)和生理指標(biāo)影響的研究，但關(guān)于DMTU對銅脅迫下黃瓜種子萌發(fā)和生理指標(biāo)影響研究卻鮮有報(bào)道[8]。研究了DMTU對銅脅迫下黃瓜種子萌發(fā)的影響，為減輕銅脅迫對黃瓜種子的影響提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜種子為天津市宏豐蔬菜研究有限公司的“津瑞100”。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 CuSO4濃度的篩選 挑選飽滿均一、健康的黃瓜種子，160顆/袋。1%KMnO4溶液消毒10 min后，用蒸餾水沖洗4～5次，并用濾紙吸干種子表面水分。在蒸餾水中浸種24 h，將黃瓜種子整齊擺放在鋪3層濾紙的培養(yǎng)皿（9 cm×9 cm）中，50粒/皿，每個(gè)培養(yǎng)皿加入10 mL CuSO4溶液，CuSO4濃度分別是0（蒸餾水）、30、60、90、120 mg/L，每個(gè)處理重復(fù)3次。將種子放在（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在此期間，每天定時(shí)記錄種子的發(fā)芽顆數(shù)。種子萌發(fā)的標(biāo)志即胚根突破種皮。

1.2.2 DMTU浸種處理 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選用90 mg/L CuSO4溶液對黃瓜種子進(jìn)行銅脅迫。選取飽滿大小均一、健康的黃瓜種子，1%KMnO4溶液消毒10 min后，用蒸餾水沖洗4～5次，用濾紙吸干種子表面水分。分別用蒸餾水、濃度為0.5 mmol/L的DMTU溶液浸泡黃瓜種子24 h，并將黃瓜種子整齊擺放在鋪3層濾紙的培養(yǎng)皿（9 cm×9 cm）中，50粒/皿，每個(gè)培養(yǎng)皿加入10 mL CuSO4溶液，且以蒸餾水處理作為對照。試驗(yàn)一共設(shè)置3種處理，每種處理3組重復(fù)，在種子萌發(fā)的12、18、30、36、48 h測定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽勢、發(fā)芽率和胚根長測定 培養(yǎng)12 h后每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，以開始記錄發(fā)芽數(shù)為第1天，于第2天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢，第5天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。在第5天（發(fā)芽終期）使用直尺測定每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽種子的胚根長。

發(fā)芽勢（%）=第二天發(fā)芽種子數(shù)目/供檢種子數(shù)目×100%

發(fā)芽率（%）=所有正常發(fā)芽種子數(shù)目（第5天）/供檢種子數(shù)目×100%

1.3.2 黃瓜種子鮮重干重測定 在第5天測定黃瓜種子的鮮重和干重。先稱量種子的鮮重，再將種子放入烘干箱烘12 h，再稱量烘干種子的重量。

1.3.3 H2O2含量測定 在12、18、30、36、48 h測定黃瓜種子的H2O2含量，參照前人方法測定H2O2含量。

1.3.4 抗氧化酶（POD、APX）活性測定

在12、18、30、36、48 h測定黃瓜種子的抗氧化酶活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性；參照相關(guān)學(xué)者的方法測定APX活性。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 16.0進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 CuSO4脅迫對黃瓜種子萌發(fā)的影響

黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率隨著CuSO4溶液濃度的升高，先升高后降低。在CuSO4溶液濃度為30、60 mg/L時(shí)，對黃瓜種子萌發(fā)起促進(jìn)作用；與CK組相比，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率升高，差異不顯著，但胚根長顯著增加（表1）。在CuSO4溶液濃度為90、120 mg/L時(shí)，與CK組和低濃度的CuSO4溶液脅迫時(shí)相比，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長均顯著下降。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中選擇90 mg/L的CuSO4溶液對黃瓜種子進(jìn)行脅迫。

2.2 CuSO4脅迫對黃瓜種子鮮重和干重的影響

隨著CuSO4濃度的升高，黃瓜種子的鮮重先增加后減少，在CuSO4濃度為90 mg/L時(shí)，黃瓜種子的鮮重顯著降低（表2）。而黃瓜種子的干重變化極小，說明銅脅迫不影響黃瓜種子的干重。隨著CuSO4濃度升高，黃瓜種子的含水量先升高后降低。

2.3 DMTU對黃瓜種子萌發(fā)的影響

與CK組相比，在90 mg/L CuSO4溶液脅迫下，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長顯著降低；經(jīng)0.5 mmol/L DMTU浸種處理后，90 mg/L CuSO4溶液脅迫下黃瓜種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率顯著上升，胚根長增加，發(fā)芽勢升高7.34%、發(fā)芽率升高4.67%、胚根長增加0.61 cm（表3）。說明0.5 mmol/L DMTU浸種處理能夠顯著升高銅脅迫下黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率，增加胚根長。

2.4 DMTU對CuSO4脅迫下黃瓜種子H2O2含量的影響

在整個(gè)過程中，CK組的H2O2含量為先升高后降低的趨勢。90 mg/L CuSO4溶液脅迫下黃瓜種子H2O2含量呈先上升后降低的趨勢，在30 h達(dá)到最大值；與CK組相比，其POD活性顯著增強(qiáng)。經(jīng)0.5 mmol/L DMTU浸種處理后，90 mg/L CuSO4溶液脅迫下黃瓜種子的POD活性顯著降低，在12、18、30 h分別降低了5.43%、6.25%、6.56%（圖1）。表明

0.5 mmol/L DMTU浸種處理可以顯著降低銅脅迫下黃瓜種子內(nèi)的H2O2含量。

2.5 DMTU對CuSO4脅迫下黃瓜種子過氧化物酶（POD）活性的影響

CK組的POD活性在整個(gè)過程中先升高后降低，在36 h達(dá)到最高值（圖2）。與CK組相比，90 mg/L CuSO4溶液脅

迫下黃瓜種子POD活性顯著增強(qiáng)，隨時(shí)間的增加，POD活性先增強(qiáng)后降低，在12～36 h增強(qiáng)，48 h降低。經(jīng)0.5 mmol/L DMTU浸種處理后，90 mg/L CuSO4溶液脅迫下黃瓜種子的POD活性顯著降低，在12、18 h分別降低9.2%、12.43%。表明經(jīng)0.5 mmol/L DMTU處理后，銅脅迫下黃瓜種子內(nèi)POD活性顯著降低。

2.6 DMTU對CuSO4脅迫下黃瓜種子抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的影響

CK組的APX活性在整個(gè)過程中處于先上升后下降的狀態(tài)，上升緩慢。與CK組相比，90 mg/L CuSO4溶液脅迫下黃瓜種子APX活性顯著增強(qiáng)，隨著銅脅迫時(shí)間的增加，APX活性呈先增強(qiáng)后降低的趨勢，在36 h達(dá)到最高值。經(jīng)0.5 mmol/L DMTU浸種處理后，90 mg/L CuSO4溶液脅迫下黃瓜種子APX活性顯著降低，在12、18、30 h分別降低29.10%、23.36%、30.43%；與CK組相比，APX活性更高，但差異不顯著（圖3）。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

種子是植物十分重要的繁殖器官，是一切植物的根源。種子萌發(fā)過程影響著后續(xù)幼苗的生長。銅離子對細(xì)胞中的酶起毒害作用，影響植物體內(nèi)的正常生理生化反應(yīng)[9]。在低濃度銅離子作用下，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均升高，促進(jìn)了黃瓜種子的萌發(fā)；在高濃度銅離子脅迫下，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均下降，黃瓜種子的萌發(fā)受到抑制。銅脅迫對黃瓜種子萌發(fā)的影響還表現(xiàn)在胚根長上，低濃度銅離子可以促進(jìn)黃瓜種子胚根長的伸長；高濃度銅離子脅迫下，抑制黃瓜種子胚根長的伸長。這一結(jié)果與銅脅迫對黃瓜種子萌發(fā)的影響研究結(jié)果一致。經(jīng)DMTU處理后，銅脅迫下黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均有升高，胚根長伸長，DMTU減輕了銅離子對黃瓜種子萌發(fā)的影響。

在正常情況下，植物中過氧化氫的產(chǎn)生和去除處于平衡狀態(tài)。在銅脅迫下，植物中過氧化氫的含量處于不平衡狀態(tài)，過氧化氫過度積累，破壞了植物正常的生理和生化反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，與CK組相比，在銅脅迫能夠顯著升高黃瓜種子體內(nèi)過氧化氫含量。這一結(jié)果與銅離子脅迫對苦草生長特性及生理指標(biāo)的影響研究結(jié)果一致[10]。經(jīng)0.5 mmol/L DMTU處理后，黃瓜種子內(nèi)過氧化氫含量明顯降低。

在植物體內(nèi)過氧化氫含量過量，植物體內(nèi)正常的生理生化反應(yīng)被破壞。此時(shí)，植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)就會發(fā)揮作用，POD、APX等抗氧化酶活性增強(qiáng)以清除多余的過氧化氫。此試驗(yàn)結(jié)果表明，與CK組相比，在銅脅迫下黃瓜種子內(nèi)POD、APX的活性顯著增強(qiáng)。這一結(jié)果與銅離子脅迫黃瓜種子萌發(fā)的應(yīng)該研究結(jié)果一致。經(jīng)0.5 mmol/L DMTU處理后，銅脅迫下黃瓜種子體內(nèi)POD、APX活性顯著降低。

3.2 結(jié)論

經(jīng)0.5 mmol/L DMTU處理后，90 mmol/L CuSO4脅迫下黃瓜種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率升高，胚根長增加；過氧化氫含量、POD、APX活性均降低。

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Effects of A Hydrogen Peroxide Scavenger on Seed Germination of Cucumber under Copper Stress

Li Xin et al（Collage of Life Sciences， Chongqing Normal University， Chongqing 401331）

Abstract Dimethylthiourea （DMTU） is an H2O2 scavenger. In order to investigate the effect of DMTU on cucumber seed germination under copper stress， the cucumber seed “Jinrui 100” was used as the material. The paper germination method was used to determine the effect of soaking with 0.5 mmol/L DMTU on cucumber seed germination and related physiological indicators under 90 mg/L CuSO4 stress. The results showed that under the stress of 90 mg/L CuSO4， the germination potential， germination rate， and radicle length of cucumber seeds were inhibited; After soaking with 0.5 mmol/L DMTU， the germination rate and germination potential of cucumber seeds were significantly increased， promoting the growth of embryonic roots; Reducing the content of H2O2 in seeds and the activity of antioxidant enzymes （POD， APX） alleviated the impact of copper stress on cucumber seed germination.

Key word Ucumber; The stress of copper; DMTU; Antioxidant enzyme