三株球孢白僵菌對小菜蛾室內(nèi)毒力測定

王硯妮 李敏 段先莉 龍同 李文靜 趙錦芳

［收稿日期］20211112

［基金項目］農(nóng)業(yè)部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室開放基金項目（2019ZTSJJ3）；湖北省教育廳重點項目（D20201403）；湖北省自然科學(xué)基金（2019CFB604）；湖北省新世紀(jì)高層次人才工程項目（鄂人社函［2018］666號）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（S202110500049）

［第一作者］王硯妮（1996-），女，湖北宜昌人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向為微生物

［通信作者］趙錦芳（1980-），女，山東威海人，湖北工業(yè)大學(xué)副教授，研究方向為微生物

［文章編號］1003-4684（2023）02-0040-04

［摘要］為發(fā)掘生防潛力，以小菜蛾為供試?yán)ハx，對從湖北省恩施州所采草地貪夜蛾僵蠶體上分離獲得的三株球孢白僵菌Bbyn-1、Bbyn-2和Bbyn-3進行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，當(dāng)孢子懸浮液濃度為1×108個/mL時，接種7 d后菌株Bbyn-1的毒力最高累計死亡率為97.66%；當(dāng)孢子懸浮液濃度為1×108個/mL、接種量150 μL時，接種7 d后菌株Bbyn-1的毒力最高為99.67%；浸蟲法接種7 d后菌株Bbyn-3的毒力最高為96.94%；涂抹法接種7 d后菌株Bbyn-2的毒力最高為93.71%。與球孢白僵菌菌株Bbyn-2和Bbyn-3相比，菌株Bbyn-1有較高的致病力，具有進一步研究和開發(fā)的潛力。

［關(guān)鍵詞］球孢白僵菌； 毒力測定； 小菜蛾

［中圖分類號］S476.12? ［文獻標(biāo)識碼］A

小菜蛾（Plutella xylostella），俗稱“吊絲蟲、兩頭尖”，是一種世界性的重要害蟲，主要危害十字花科蔬菜[1-3]。其為害特點：世代周期短，繁殖力、遷移、抗逆能力和適應(yīng)性強[4-5]。對小菜蛾的防控主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥，但化學(xué)農(nóng)藥使其產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[6]，破壞了田間的生態(tài)平衡，同時也嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。因此開展小菜蛾的生物防治已成為人們探索控制其危害的重要途徑。

球孢白僵菌是一種蟲生真菌，可通過體壁侵染寄生昆蟲，數(shù)量多達(dá)750多種[8]。在自然界中發(fā)現(xiàn)的由白僵菌致病死亡的昆蟲約占20%，如小菜蛾、草地貪夜蛾、西花薊馬、桃蚜、松褐天牛等[9-11]。球孢白僵菌的低毒低殘留、強致病力、高專一性及不易產(chǎn)生抗藥性被廣泛用于害蟲的防治[12]。在我國，已應(yīng)用白僵菌防治40多種害蟲獲得成功，年防治面積在67萬hm2以上[3]。

本研究以分離的3株球孢白僵菌菌株為試材，對小菜蛾進行室內(nèi)毒力測定，比較不同接種方式的殺蟲效果，篩選出高毒力菌株，為今后更好地開展生防試驗提供數(shù)據(jù)參考。

1??? 材料與方法

1.1??? 供試菌株

供試菌株球孢白僵菌株系Bbyn-1、Bbyn-2、Bbyn-3，由自湖北省恩施州所采草地貪夜蛾僵蠶體上分離篩選獲得，保藏于湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室。

1.2 ???供試?yán)ハx

昆蟲飼喂實驗在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物農(nóng)藥工程研究中心昆蟲培養(yǎng)室開展，選取鱗翅目小菜蛾的2齡健康無污染幼蟲作為供試蟲源，室內(nèi)飼養(yǎng)條件為（27±2）℃，相對濕度60%～90%。

1.3??? 供試對照試驗藥劑

0.1%的Tween-80無菌水作為空白對照CK1。

化學(xué)農(nóng)藥殺蟲劑陶氏益農(nóng)艾綠士購自臨沂慶豐年農(nóng)資有限公司。原藥用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween-80水溶液稀釋1000倍，作為溶劑對照CK2。

1.4??? 供試培養(yǎng)基與人工飼料

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯加水煮沸過濾至1000 mL，分別加入20 g的葡萄糖和20 g的瓊脂。

人工飼料的配方參照楊亞軍[13]的方法：小麥粉280 g、大豆粉90 g、酵母粉35 g、瓊脂25 g、復(fù)合維生素B 0.2 g、膽固醇12 g、山梨酸2 g、抗壞血酸12 g、對羥基苯甲酸甲酯5 g、甲醛4 mL、青霉素0.2 g、無菌水1500 mL。

1.5??? 孢子懸浮液制備

將3株球孢白僵菌菌株接種于PDA上培養(yǎng)至產(chǎn)孢，真菌孢子用0.1%的Tween-80無菌水配制為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104個/mL的懸浮液，作為供試菌液。

1.6??? 接種方式

1.6.1??? 不同濃度的飼料浸潤法在24孔養(yǎng)蟲孔板的每孔中加入配制好的孢子懸浮液100 μL，輕輕搖動使其在飼料表面形成均勻的藥膜，自然風(fēng)干后接入整齊健康的小菜蛾2齡幼蟲，每孔接蟲3頭，每個處理72頭蟲，3次重復(fù)。設(shè)置CK1與CK2。

1.6.2??? 不同接種量的飼料浸潤法在養(yǎng)蟲孔板中分別加入濃度為108個/mL的孢子懸浮液50、100、150、200 μL。其余操作同1.6.1。

1.6.3??? 浸蟲法用軟毛筆將供試小菜蛾2齡幼蟲挑入濃度為108個/mL的孢子懸浮液中，浸漬20 s后挑出，幼蟲置于濾紙上吸去多余水分。然后將其接入含有飼料的24孔養(yǎng)蟲孔板中，每孔接蟲3頭，每個處理72頭蟲，3次重復(fù)。設(shè)置CK1與CK2。

1.6.4??? 涂抹法將幼蟲置于濾紙上，用軟毛筆蘸取濃度為108個/mL的孢子懸浮液涂抹小菜蛾2齡幼蟲體表[14]。其余操作同1.6.3。

1.7??? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

將接蟲后的養(yǎng)蟲孔板移入室溫（27±2） ℃，相對濕度60%～90%的觀察室，觀察蟲體癱軟且連續(xù)3次觸碰無反應(yīng)時判定其死亡。逐日統(tǒng)計累計死亡率至用藥后的1周。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行方差分析和差異顯著性分析[15]。

2??? 結(jié)果與分析

2.1??? 不同濃度的飼料浸潤法

從表1可以得出，接種7 d后，小菜蛾2齡幼蟲的累計死亡率與不同的孢子懸浮液濃度之間呈正相關(guān)。3個菌株對小菜蛾2齡幼蟲的致死效果存在明顯差異。其中，菌株Bbyn-1對小菜蛾2齡幼蟲的致死效果最好，其次是菌株Bbyn-2，但在孢子懸浮液濃度為1×105個/mL時，菌株Bbyn-3的致死效果更優(yōu)，這可能與球孢白僵菌分生孢子在消化道的粘附力有關(guān)。

同一列的不同字母表示顯著性差異（P<0.05）（下同）

Bbyn-1、Bbyn-2和Bbyn-3菌株在孢子懸浮液濃度為1×108個/mL時，接種7 d后，小菜蛾的累計死亡率分別為（97.66±0.62）%、（93.43±0.34）%和（94.42±0.77）%。袁盛勇[4]使用孢子濃度為2.3×108個/mL的球孢白僵菌，接種7 d后，小菜蛾的校正死亡率為77.4%。楊帆[8]使用孢子懸浮液濃度為108個/mL的球孢白僵菌，接種5 d后，小菜蛾的校正死亡率為（87.59±8.86）%。由此可見，本研究的3株球孢白僵菌對小菜蛾均有較好的致死效果。

2.2??? 不同接種量的飼料浸潤法

室內(nèi)毒力測定結(jié)果（表2）表明，3株球孢白僵菌菌株在接種7 d后對小菜蛾2齡幼蟲的毒力隨著接種量的增加而提高。比較3株球孢白僵菌不同接種量對小菜蛾2齡幼蟲的累計死亡率，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌菌株Bbyn-1的毒力最強，其接種量為50 μL時，累計死亡率即可達(dá)到（94.48±0.3）%。

2.3??? 3株球孢白僵菌浸蟲法與涂抹法的累計死亡率

在孢子懸浮液濃度不變的情況下，球孢白僵菌菌株對小菜蛾2齡幼蟲的累計死亡率與接種時間呈正相關(guān)。隨著接種時間的延長，累計死亡率逐漸增高。如Agboyi L K[6]所述，影響小菜蛾死亡率的因素之一是接種時間。

浸蟲法中3株球孢白僵菌對小菜蛾的致死趨勢相同，在第2天進入高發(fā)病期，第4天累計死亡率均達(dá)到50%以上，第6 天累計死亡率均達(dá)到80%以上。接種5 d后，菌株Bbyn-3對2齡小菜蛾的致死效果最高；涂抹法中3株球孢白僵菌的毒力由高到低依次為菌株Bbyn-2>菌株Bbyn-1>菌株Bbyn-3。在第4 天時，累計死亡率均未達(dá)到50%，第6 天時只有菌株Bbyn-2達(dá)到了80%以上。因此，菌株Bbyn-2在涂抹法中對2齡小菜蛾的致死率效果更好。

2.4??? 不同接種方式的死亡率

3株球孢白僵菌的不同接種方式對小菜蛾2齡幼蟲均有較高的致死率。但飼料浸潤法與浸蟲法的防治效果要優(yōu)于涂抹法，球孢白僵菌菌株Bbyn-1、Bbyn-2、Bbyn-3在飼料浸潤法接種7 d后的累計死亡率分別達(dá)到98.02%、93.06%、94.87%；浸蟲法接種7 d后的累計死亡率分別為95.34%、94.72%、96.94%；涂抹法接種7 d后的累計死亡率分別為88.69%、93.71%、76.67%。

2.5??? 小菜蛾感染球孢白僵菌后的外部癥狀

3種接種方式處理小菜蛾2齡幼蟲后均有僵蟲出現(xiàn)，說明3株球孢白僵菌對小菜蛾幼蟲有確切的致死效果，且僵蟲均出現(xiàn)在病蟲死亡后的2～3 d。

感染初期，其病蟲外表與健康蟲體并無明顯差異，且蟲體顏色變?yōu)榫G色（A）；隨著感染時間延長，小菜蛾活動反應(yīng)遲緩，無吐絲行為；死亡后蟲體色變黑。此現(xiàn)象與閆喜中[3]所觀察的結(jié)果一致。死亡48 h后，蟲體出現(xiàn)白色菌絲，在節(jié)間褶部位白色菌絲明顯（B）。隨著感染時間的增加，蟲體逐漸被白色菌絲覆蓋，且蟲體開始萎縮，并快速長出分生孢子，遍體如附白粉（C）。該過程與劉忱[16]觀察球孢白僵菌浸染玉米螟的過程一致。

3??? 結(jié)論

本研究以小菜蛾為供試?yán)ハx，對前期從湖北省恩施州所采集的草地貪夜蛾僵蠶體上分離獲得的三株球孢白僵菌Bbyn-1、Bbyn-2和Bbyn-3進行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明：3株球孢白僵菌菌株對小菜蛾2齡幼蟲均有侵染效果，但感染昆蟲的能力各不相同。在不同孢子懸浮液和不同接種量的處理中，對小菜蛾2齡幼蟲毒力最高的是菌株Bbyn-1，且毒力與孢子懸浮液濃度和接種量呈正相關(guān)。這個現(xiàn)象不僅表現(xiàn)在對小菜蛾防治中，在草地貪夜蛾防治中同樣存在[17]；在涂抹法的處理中，菌株Bbyn-2對小菜蛾2齡幼蟲的毒力顯著高于菌株Bbyn-1和Bbyn-3；在浸蟲法的處理中，前期菌株Bbyn-2的毒力較高，后期菌株Bbyn-3的毒力效果最好。球孢白僵菌主要通過昆蟲體壁、氣節(jié)、傷口等外部途徑或消化道、呼吸道等內(nèi)部途徑進入。因此，影響球孢白僵菌殺蟲毒力的因素有很多，包括不同菌株對寄主的粘附力與適應(yīng)性、菌株來源寄主物種不同[18]、次生代謝產(chǎn)物的種類和毒力、溫度、濕度、接種方式等，菌株Bbyn-3的較低性能可能與粘附性和浸染角質(zhì)層的能力有關(guān)。

Lakpo K[6]發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌菌株Bb11在每周施藥兩次時能夠有效將農(nóng)場中小菜蛾的密度降低93%。BATHINA P[19]采用離體葉片法對小菜蛾進行生物測定，在接種15 d后小菜蛾2齡幼蟲死亡率最高為70%～80%。袁盛勇[4]利用球孢白僵菌MZ041016菌株分生孢子不同梯度對小菜蛾的致病性進行測定，在分生孢子濃度為2.3×108孢子/mL時，接種8 d后小菜蛾的校正死亡率為92.4%。雷研圓[14]將孢子懸浮液濃度為107個/mL的球孢白僵菌Bb02采用浸蟲法接種7 d后，校正死亡率為73.79%，涂抹法接種7 d后校正死亡率為68.28%。與同類研究報道相比，本研究的3株球孢白僵菌菌株對2齡小菜蛾均有較強的毒力，其中菌株Bbyn-1和菌株Bbyn-2致病性更高，具有進一步研究和開發(fā)的潛力。

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Virulence of Three Strains of Beauveria bassianaaganist Plutella xylostella

WANG Yanni1，LI Min1，DUAN Xianli1，LONG Tong2，LI Wenjing3，ZHAO Jinfang1

（1 Key Laboratory of Fermentation Engin.Ministry of Education，Hubei Univ. of Tech.，Wuhan 430068，China； 2 Hubei Academy of Agricultural Sciences，Biopesticide Engin.Research Centre，Wuhan 430064，China；3 Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， P. R. China，Wuhan 430064，China）

Abstract：Three strains of? Beauveria bassiana， Bbyn-1， Bbyn-2， and Bbyn-3 isolated from silkworm of Spodoptera frugiperda? （Enshi， Hubei Province） were bioassayed against the second instar larvae of Plutella xylostella. The results showed that the cumulative mortality of Bbyn-1 was 97.66% in the 10? 8 conidia/mL. When the inoculation volume is 150 μL， the cumulative mortality of Bbyn-1 can rise up to 99.67%. After inoculating for 7 days， the cumulative mortality of Bbyn-3 was the highest 96.94% by the immersion method， and the cumulative mortality of Bbyn-2 was 93.71% by the smear method. The results also showed that the three strains of Beauveria bassiana had certain effect to Plutella xylostella. The virulence was higher than Bbyn-2 and Bbyn-3 strain， especially Bbyn-1 strain， which has the potential for further research and development.

Keywords：Beauveria bassiana; virulence; Plutella xylostella

［責(zé)任編校： 張眾］