地膽草提取物對(duì)大鼠急性胸膜炎的作用

林烈員 高建亭 張艷 師鑫潮 劉海隆 何欣

（1. 海南省海口市秀英區(qū)東山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心 海南?？?571100；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院河北保定 071000；3. 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 海南?？?571100）

地膽草（Elephanltopus scaberL.）為菊科地膽草屬草本植物[1]，主要分布于我國(guó)廣東、浙江及福建等地，可全草入藥。具有清熱解毒、消腫利尿等功效，常用于感冒、急性扁桃體炎、結(jié)膜炎、水腫等疾病的治療[2]。炎癥是人和動(dòng)物常見(jiàn)的綜合性病理過(guò)程，是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)致炎因子產(chǎn)生的以防御為主的病理反應(yīng)，可分為急性炎癥和慢性炎癥。其中急性炎癥是指機(jī)體受到致炎因子刺激后短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出的反應(yīng)。胸膜炎是最常見(jiàn)的炎癥性疾病之一，許多危害生命的疾病，如結(jié)核病、肺炎等，都與胸膜炎有關(guān)[3]。角叉菜膠致大鼠胸膜炎模型是一種理想的急性炎癥模型，常用于檢測(cè)藥物的抗炎效果[4]。對(duì)于嚙齒動(dòng)物而言，將角叉菜膠注入胸腔后可激活激酶，促進(jìn)炎癥因子釋放，激活以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞，聚集在炎癥部位。因此，借助此模型，通過(guò)測(cè)定炎性因子水平、MDA 含量等，可以研究藥物的抗炎效果。

本研究采用乙醇回流法對(duì)地膽草活性物質(zhì)進(jìn)行提取，考察不同濃度提取物對(duì)大鼠急性胸膜炎作用效果，初步探討其抗炎機(jī)制，為其研發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)植物 健康昆明種雄性大鼠，購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，體重（250 ±20.0）g，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。將購(gòu)買(mǎi)的大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，期間保持通風(fēng)，試驗(yàn)開(kāi)始前12 h 禁食不禁水。地膽草，2022 年3月采集于海南?？谑袞|山鎮(zhèn)。

1.1.2 藥品與儀器 （1）藥品 地塞米松磷酸鈉注射液（5 mg/mL），山西兆益有限公司; 角叉菜膠，上海麥克林生化科技有限公司；肝素鈉注射液，天津生物化學(xué)制藥有限公司；無(wú)水乙醇，天津市匯杭化工科技有限公司；0.9%生理鹽水注射液，石藥銀湖制藥有限公司；吐溫-80 及其他溶劑，福晨化學(xué)試劑有限公司；大鼠一氧化氮（NO）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海一研生物科技有限公司）；大鼠丙二醛（MDA）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β) ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）。

（2）儀器 提取濃縮罐，北京錦富仁豪科技發(fā)展有限公司；RE-5205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠；TGL-16B 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 地膽草乙醇提取物的制備 使用乙醇回流提取法對(duì)地膽草中的有效成分進(jìn)行提?。悍Q(chēng)取地膽草2 600 g，加95%乙醇回流提取2 次，第一次加15 倍量乙醇提取2 h，第二次加10 倍量乙醇提取1 h；合并初提液，減壓濃縮，回收乙醇，濃縮瓶中有掛壁后取乙醇總提取物適量，其余藥液濃縮至浸膏，加入熱水500 mL，充分?jǐn)嚢瑁瑐溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物模型建立及給藥 將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5 組，對(duì)照組分為陰性對(duì)照組（灌服5%吐溫-80），陽(yáng)性對(duì)照組（灌服0.5 mg/kg 地塞米松）；試驗(yàn)組分別為低劑量組（按生藥量計(jì)為7.5 g/kg）、中劑量組（按生藥量計(jì)為15 g/kg）、高劑量組（按生藥量計(jì)為30 g/kg）。按照1 mL/hg 每日灌胃1次，連續(xù)7 d；末次給藥30 min 后，用10%水合氯醛按照0.4 mL/hg 劑量腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉[5]，仰臥位固定，右側(cè)胸腔部位剃毛，酒精擦拭消毒；按照0.2 mL/hg 劑量[6]在右上肢下第7、第8 肋骨間向右胸膜腔內(nèi)[7]，注入1%無(wú)菌角叉菜膠溶液致炎[8-9]，為避免肺臟受到損傷，該操作應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成[10]。

1.2.3 取樣及測(cè)定 致炎4 h 后麻醉大鼠，眶竇采血并處死；將全血于5 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定炎癥因子NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量。

將大鼠仰臥位固定，酒精擦拭消毒后用手術(shù)剪剪開(kāi)胸腹部皮膚，暴露肌肉層，往胸腔內(nèi)注入2 mL 生理鹽水胸腔洗液（含5 U/mL 肝素）[11-12]，輕輕搖晃，使胸腔內(nèi)液體混合均勻；取胸腔滲出液，于5 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。p＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 地膽草提取物含量

結(jié)果顯示，地膽草乙醇提取物提取率為30.58%，提取物1 g 相當(dāng)于原生藥3.27 g。本研究選擇最高劑量為浸膏原液，將中、低劑量進(jìn)行了相應(yīng)稀釋。

2.2 血清中炎癥因子含量

血清中炎癥因子含量如表1 所示。與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低了血清中NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量（p＜0.05 或p＜0.01）；地膽草乙醇提取物不同劑量組均可不同水平降低血清中炎癥因子的含量。與陰性對(duì)照組相比，高、中、低劑量組均可明顯降低血清中TNF-α含量（p＜0.05 或p＜0.01），高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異；高、中劑量組明顯降低了（p＜0.05 或p＜0.01）血清中NO、MDA 和IL-1β含量，其中高劑量組對(duì)MDA、TNF-α和IL-1β的影響顯著優(yōu)于中劑量組；只有高劑量組顯著降低了血清中PGE2含量。

表1 大鼠血清中炎癥因子含量[（x ± s），n=6]

2.3 胸腔液中炎癥因子含量

胸腔液中炎癥因子含量結(jié)果如表2 所示。與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低了（p＜0.05或p＜0.01）胸腔液中MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β含量；地膽草乙醇提取物的3 個(gè)劑量組均明顯降低了（p＜0.05）胸腔液中TNF-α的含量；中劑量組和高劑量組明顯降低了（p＜0.05 或p＜0.01）胸腔液中MDA、PGE2和IL-1β的含量，且高劑量組對(duì)PGE2的影響顯著高于中劑量組，效果和陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

表2 大鼠胸腔液中炎癥因子含量[（x ± s），n＝6]

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠急性胸膜炎被廣泛應(yīng)用于抗炎藥物的篩選與評(píng)價(jià)，是一種理想的急性滲出性炎癥模型[13]。炎性刺激可引起大量炎性介質(zhì)的分泌，易于檢測(cè)出與炎癥反應(yīng)相關(guān)的因子水平[14-16]，故大鼠胸膜炎炎癥介質(zhì)含量可作為衡量炎癥的重要指標(biāo)。

NO 能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，炎癥發(fā)生時(shí)，刺激物促進(jìn)NO 的合成和釋放，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)行；MDA 可反應(yīng)機(jī)體自由基與脂類(lèi)反應(yīng)的情況；PGE2在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能夠促進(jìn)其他因子作用，使白細(xì)胞聚集在炎性區(qū)域，從而引起組織水腫、充血等炎癥反應(yīng)[17]；TNF-α是一種促炎性因子，可通過(guò)多種生物學(xué)途徑誘發(fā)或激活體內(nèi)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，炎癥介質(zhì)共同作用引起組織損傷和細(xì)胞凋亡[18-19]；IL-1β是參與炎癥反應(yīng)最重要的細(xì)胞因子之一，可以增加PGE2的分泌，參與介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)白細(xì)胞聚集在局部炎癥部位。本試驗(yàn)中，地膽草乙醇提取物能夠降低血清和胸腔液中NO、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量，降低MDA 的含量，表明地膽草乙醇提取物抑制大鼠急性胸膜炎的作用機(jī)制可能與其抗氧化和抑制炎癥因子釋放有關(guān)。

Wan 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度地膽草乙醇提取物能夠作為乙醇誘導(dǎo)的肝損傷保肝藥物，減輕肝臟的損傷情況，且大鼠口服地膽草提取物安全無(wú)毒副作用。為探究地膽草水提物的抗炎效果，溫先敏等[21]建立了角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹模型，并比較各組大鼠給藥后不同時(shí)間右后足趾腫脹度及抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給藥劑量為0.45 g/kg（約相當(dāng)于生藥量38.67 g/kg）時(shí)對(duì)足趾腫脹有抑制作用。為測(cè)試地膽草不同溶劑提取物的半數(shù)致死量（LD50），有關(guān)學(xué)者對(duì)地膽草不同溶劑提取物進(jìn)行了大鼠急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，提取物在5 000 mg/kg（約相當(dāng)于生藥量16.35 g/kg）的劑量下，大鼠未出現(xiàn)死亡情況[22]。按照0.4 g/kg劑量（約相當(dāng)于生藥量8.25 g/kg）給炎癥模型大鼠灌服地膽草提取物，研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，給藥組對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥有明顯的抑制作用[23]。本試驗(yàn)中使用的浸膏質(zhì)地粘稠，且高劑量組使用浸膏原液，為保證灌胃藥液的流動(dòng)狀態(tài)，最終設(shè)置劑量分組為：低劑量組（按生藥量計(jì)為7.5 g/kg）、中劑量組（按生藥量計(jì)為15 g/kg）、高劑量組（按生藥量計(jì)為30 g/kg）。

3.2 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，地膽草乙醇提取物能抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的急性胸膜炎大鼠胸腔液和血清中NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量，抗炎效果為高劑量＞中劑量＞低劑量，初步提示其抗炎機(jī)制可能與其抑制炎癥因子的釋放及抗氧化作用有關(guān)。