miR-155 對支氣管哮喘患兒Th1/Th2細胞失衡的影響及機制研究

陳智 魏靜麗 田蕓

支氣管哮喘是多發(fā)于小兒時期的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1]。該病是由多類細胞及促炎因子共同參與形成的氣道炎癥性疾病[2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國兒童支氣管哮喘患病率正以每10 年增加50%以上的幅度上升，且該病的控制情況十分不理想[3]。目前，支氣管哮喘的發(fā)病機制仍未完全清晰。研究表明，T 淋巴細胞在支氣管哮喘進展中起著重要作用，其中Th1 與Th2 比例失衡是支氣管哮喘發(fā)生的重要因素[4]。研究證實，miR-155 參與咳嗽變異性支氣管哮喘、急性胰腺炎和肺炎等慢性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展[5]，但關(guān)于其在兒童支氣管哮喘中的作用尚不明確?；诖?，本研究就miR-155 對支氣管哮喘患兒Th1/Th2 細胞失衡的影響及致病機制作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018 年7 月至2022 年6 月在深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院就診的40 例支氣管哮喘發(fā)作期患兒為哮喘組，其中男19 例，女21 例；年齡7～12（9.18±1.97）歲；BMI 為（19.24±1.41）kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）支氣管哮喘的診斷符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》[6]相關(guān)診標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡6～14歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并先天性氣道畸形；（2）伴有精神障礙；（3）合并嚴重軀體疾?。唬?）病例資料完整；（5）支氣管異物、致敏物等外物誘發(fā)的反復(fù)喘息。另選同期本院健康體檢的30 名兒童為對照組，其中男15人，女15 人；年齡7～12（9.13±1.80）歲；BMI 為（19.25±1.22）kg/m2。兩組對象在性別、年齡和BMI 等方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過，所有患兒家長知情同意。

1.2 體內(nèi)試驗

1.2.1 兩組對象外周血Th1 和Th2 細胞亞群水平檢測采用流式細胞術(shù)。取支氣管哮喘發(fā)作期患兒入院第2 天清晨及體檢兒童健康體檢時的空腹肘靜脈血5 mL，使用FACSCanto Ⅱ流式細胞檢測儀測定外周血Th1 比例和Th2 比例，計算Th1/Th2。

1.2.2 兩組對象外周血細胞因子水平檢測 采用ELISA 法。 取支氣管哮喘發(fā)作期患兒入院第2 天清晨及體檢兒童健康體檢時的空腹肘靜脈血5 mL，采用ELISA 法檢測外周血IL-4、IL-5、IL-1、IL-17、IFN-γ水平，試劑盒均購自北京市索萊寶科技有限公司。

1.3 體外試驗

1.3.1 外周血CD4+T 細胞分離 參考文獻[7]分離步驟，使用α-CD3 磁珠（批號：130-050-101，德國美天旎生物技術(shù)有限公司）、α-CD28 磁珠（批號：130-093-247，德國美天旎生物技術(shù)有限公司）分別分離哮喘組、對照組外周血CD4+T 細胞，設(shè)為哮喘（細胞）組、對照（細胞）組；另用miR-155 模擬物處理對照組分離獲得的CD4+T 細胞，設(shè)為miR-155 高表達組。3 組CD4+T 細胞均體外培養(yǎng)24 h 后取上清液進行RT-qPCR 和ELISA 檢測。

1.3.2 3 組CD4+T 細胞miR-155、GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein-3，GATA-3）表達水平檢測采用RT-qPCR 法。使用Trizol 提取各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用RT-qPCR 儀檢測miR-155、GATA-3 表達水平，采用2-ΔΔCt法計算miR-155、GATA-3 相對表達量。引物序列由深圳市牛啟生物技術(shù)有限公司合成，GATA-3 上游引物序列為5'-GAGGTGGACGTACTTTTTAACATCG-3'，下游引物序列為5'-GGCATACCTGGCTCCCGT-3'；β-肌動蛋白上游引物序列為5'-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3'，下游引物序列為5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3'；miR-155 上游引物序列為5'- GCGCGTTAATGCTAATT GTGAT-3'，下游引物序列為5'- GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 上游引物序列為5'-CGGGTTTGTTTTGCATTTGT-3'，下游引物序列為5'-AGTCCCAGCAT GAACAGCTT-3'。

1.3.3 3 組CD4+T 細胞IL-4、IL-5 表達水平檢測 采用ELISA 法。使用IL-4 試劑盒（批號：SEKH-0011-96T，北京市索萊寶科技有限公司）、IL-5（批號：SEKH-0012-96T，北京市索萊寶科技有限公司）測定CD4+T 細胞上清液IL-4、IL-5 表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，若滿足方差齊性，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，兩組間比較采用t'檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象外周血Th1 和Th2 細胞亞群水平比較哮喘組外周血Th1 比例、Th1/Th2 均明顯低于對照組，Th2 比例明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組對象外周血Th1和Th2細胞亞群水平比較

2.2 兩組對象外周血細胞因子水平比較 哮喘組外周血IFN-γ 水平明顯低于對照組，IL-4、IL-5、IL-1、IL-17 水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組對象外周血細胞因子水平比較（ng/L）

2.3 3 組CD4+T 細胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表達水平比較 3 組CD4+T 細胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；哮喘（細胞）組、miR-155 高表達組CD4+T 細胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表達水平均明顯高于對照（細胞）組（均P＜0.05），見表3。

表3 3 組CD4+T 細胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表達水平比較

3 討論

支氣管哮喘是一種由多類炎癥細胞、細胞分子介入的慢性炎癥疾病，多發(fā)于童年期和青春期[8]，其患病率呈逐年上升趨勢[9]。若嚴重的支氣管哮喘急性發(fā)作時得不到及時治療，可能導(dǎo)致患兒死亡，對家庭和社會增加沉重的負擔(dān)[10]。因此，積極探索支氣管哮喘的發(fā)病機制對該病的防治具有重要意義。

既往研究顯示，Th1/Th2 細胞失衡是支氣管哮喘發(fā)病的主要機制[11]。在支氣管哮喘致病進程中，Th1/Th2處于持續(xù)變化狀態(tài)，表現(xiàn)為Th1 比例及相關(guān)細胞因子水平降低和Th2 比例及相關(guān)細胞因子水平升高的過程，其中抑制促炎因子水平降低在氣道炎癥持續(xù)存在過程中起著重要作用[12]。本研究也得到類似結(jié)論，哮喘組外周血Th2 比例、IL-4、IL-5、IL-1 和IL-17 水平均明顯高于對照組，Th1 比例、Th1/Th2 和IFN-γ 水平均明顯低于對照組，表明支氣管哮喘患兒存在Th1/Th2細胞失衡的狀況。Th1 釋放的主要抑炎因子有IL-2、IFN-γ 等，它們參與細胞免疫調(diào)控；Th2 釋放的主要促炎因子有IL-4、IL-5 等，它們參與體液免疫調(diào)控。當(dāng)Th1/Th2 動態(tài)平衡被破壞時，釋放的細胞因子種類占比會發(fā)生較大的改變，進而誘發(fā)支氣管哮喘的發(fā)病[13]。據(jù)文獻報道，恢復(fù)Th1/Th2 細胞失衡，同時降低Th17 水平、提高Treg 的免疫抑制功能等，均有助于緩解兒童支氣管哮喘[14]。Th17 能特征性地分泌IL-17，而IL-17 具有很強的促炎作用，與氣道高反應(yīng)性有關(guān)。哮喘小鼠模型的實驗研究發(fā)現(xiàn)，減少Th1 分化和增強Th2 細胞分化后，會顯著提高組織中胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶3 水平，進一步證實Th1/Th2 細胞失衡誘發(fā)哮喘的發(fā)病[15]。因此，活化Th1 并抑制Th2 免疫應(yīng)答，恢復(fù)Th1/Th2 細胞平衡是治療支氣管哮喘的有效方法之一。

miRNA 是一類長約22 個核苷酸序列的非編碼單鏈RNA，其表達失調(diào)與人類疾病密切相關(guān)。研究表明，支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展與miR-155 的高表達密切相關(guān)[16]，但確切機制尚未清楚。本研究結(jié)果顯示，哮喘（細胞）組、miR-155 高表達組CD4+T 細胞miR-155、GATA-3、IL-4 和IL-5 水平均明顯高于對照（細胞）組，提示miR-155 可能通過上調(diào)GATA-3 表達來促進CD4+T 細胞向Th2 分化，進而造成支氣管哮喘患兒Th1/Th2 細胞失衡的生物學(xué)機制。轉(zhuǎn)錄因子GATA-3是一類具有高度選擇性促進Th2 分化功能的因子，可高度選擇性地促進Th2 發(fā)育、誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2 型細胞分子和阻遏Th1 型細胞特異分子。近年來研究表明，miR-155 在異氰酸鹽誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中發(fā)揮重要作用，其高表達可促進炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性[16]。2型固有淋巴細胞（type 2 innate lymphoid cells，ILC2）也屬于淋巴細胞中的一員，能被細胞因子IL-33、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素和IL-25 所激活，進而增強Th2 型細胞特異性轉(zhuǎn)錄分子GATA-3、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體α 水平，促進IL-4、IL-5 等細胞因子釋放。在過敏性氣道炎癥小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-155 缺陷小鼠肺器官中沒有炎癥細胞富集，IL-33 含量明顯減少，ILC2數(shù)量明顯減少；IL-33 能通過促進野生型小鼠ILC2 的相關(guān)受體以及miR-155 表達，使小鼠肺組織GATA-3含量增加并釋放更多的IL-13，這說明miR-155 在IL-33 刺激ILC2 增加以及嗜酸性粒細胞氣道炎癥過程中是必不可少的[17]。近期研究顯示，血清miR-155 異常高表達與支氣管哮喘的發(fā)生存在必要關(guān)聯(lián)[18]。上述研究結(jié)論與本研究基本一致。

綜上所述，miR-155 異常高表達在兒童支氣管哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其機制可能與上調(diào)GATA-3表達進而造成Th1/Th2 細胞失衡有關(guān)。