基于生物信息學(xué)分析LAD1 對乳腺癌的預(yù)后預(yù)測及募集腫瘤相關(guān)巨噬細胞作用的研究

周少丞 毛琦淇 季曉春 滕偉峰 張佳男

根據(jù)WTO 國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的2020 年全球癌癥數(shù)據(jù)報告，乳腺癌的新發(fā)病例數(shù)正迅速增加，已超越肺癌，成為全球首位。此外，乳腺癌的死亡病例數(shù)也位居世界之首，突顯了其對全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)[1]。近年來，在全球范圍內(nèi)已開展了大量關(guān)于乳腺癌發(fā)病潛在機制的研究。針對乳腺癌包括手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等在內(nèi)的綜合診療水平不斷提高。但是，仍有部分患者出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，患者的生存率顯著降低、預(yù)后不良。因此，需要尋找一種新的抗乳腺癌治療策略。腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移本質(zhì)上依賴于細胞骨架蛋白的機械運動。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，LAD1 作為一個細胞骨架相關(guān)蛋白，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起到重要作用。有基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，LAD1 蛋白在基底細胞樣和三陰性乳腺癌中表達，提示LAD1 與乳腺癌的惡性程度相關(guān)，其高表達可提示患者預(yù)后不良[2-3]。且有研究報道提示，LAD1 在喉癌、口腔鱗癌中表達，并在腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用[4]。因此，本文將探究LAD1 作為一個骨架相關(guān)蛋白，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中是否起重要作用。

1 材料和方法

1.1 LAD1在不同腫瘤中的表達差異分析 通過TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫（http://timer.cistrome.org/）[5]，類型選擇“LAD1”，分析LAD1 在不同癌癥組織中的差異表達。

1.2 乳腺組織樣本收集 登陸癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Altas，TCGA）在線數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/），篩選條件：（1）Primary Site: Breast；（2）Program: 人類腫瘤基因組（the cancer genome altas，TCGA）數(shù)據(jù)庫下載；（3）Project: TCGA-BRCA；（4）Disease Type: ductal and lobular neoplasms；（5）Data Category:transcriptome profiling；（6）Data Type: Gene Expression Quantification。

1.3 LAD1 mRNA 表達水平差異分析 利用TCGA 數(shù)據(jù)庫分析LAD1 mRNA 在乳腺癌腫瘤組織樣本和正常乳腺組織樣本中的表達差異。

1.4 LAD1 蛋白表達水平驗證 利用人類蛋白質(zhì)質(zhì)譜查詢網(wǎng)站（www.proteinatlas.org）檢索LAD1 蛋白在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達差異。

1.5 樣本組織中浸潤免疫細胞比例分析 采用CIBERSORT 算法推斷每個樣本組織的22 種免疫細胞的相對比例[6-7]。

1.6 京都基因和基因數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 利用“clusterProfiler”和“ggplot2”軟件包對樣本進行KEGG 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 LAD1 蛋白在乳腺癌組織中高表達 通過TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫分析，LAD1 蛋白在乳腺癌組織中表達明顯高于乳腺正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 LAD1 蛋白在泛癌中的表達水平

2.2 LAD1 mRNA 在乳腺癌組織與正常乳腺組織中表達的比較 通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘，收集得到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣本共1 182 例，其中乳腺癌樣本1 070例，正常乳腺組織樣本112 例。統(tǒng)計數(shù)據(jù)提示，與正常乳腺組織比較，LAD1 mRNA 在乳腺癌組織中高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 LAD1 mRNA 在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達水平（A：乳腺癌組織及正常乳腺組織中LAD1 mRNA 表達水平比較，與正常乳腺組織比較，aP＜0.01；B：乳腺癌組織及正常乳腺組織中LAD1 mRNA 表達水平比較，與正常乳腺組織比較，aP＜0.05）

2.3 LAD1 mRNA 在不同年齡、性別患者中的比較通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析介于65 歲上下患者及女性和男性乳腺癌中LAD1 mRNA 的表達水平差異。統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，相對于年齡＞65 歲患者，LAD1 mRNA 在≤65歲患者中表達更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A。而在女性和男性乳腺癌患者中，LAD1 mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3B。

圖3 LAD1 mRNA 在乳腺癌中的表達水平（A：不同年齡患者LAD1 mRNA 表達水平比較，aP＜0.05；B：不同性別患者LAD1 mRNA表達水平比較）

2.4 免疫組化染色結(jié)果 通過人類蛋白質(zhì)譜查詢網(wǎng)站（www.proteinatlas.org），檢索乳腺癌組織和正常乳腺組織LAD1 蛋白的免疫組化染色結(jié)果，可見乳腺癌病理組織中LAD1 蛋白的表達高于正常乳腺組織，見圖4。

圖4 LAD1 蛋白在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達（A：乳腺癌組織中LAD1 蛋白的表達情況；B：正常乳腺組織中LAD1 蛋白的表達情況）

2.5 LAD1 的表達與乳腺癌中浸潤的免疫細胞之間的相關(guān)性 本研究使用CIBERSORT 算法計算低風(fēng)險和高風(fēng)險隊列之間免疫細胞分數(shù)的比較。結(jié)果顯示，高表達LAD1 基因在乳腺癌免疫微環(huán)境中與M2 型巨噬細胞、樹突細胞細胞靜息、嗜酸性粒細胞的表達呈正相關(guān)，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。高表達LAD1 基因與記憶性B 細胞、初始B 細胞和漿細胞的表達呈負相關(guān)，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5（封三）。

圖5 腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的變化（A：使用CIBERSORT 算法計算低風(fēng)險和高風(fēng)險組之間免疫細胞分數(shù)；B：京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫富集分析低風(fēng)險和高風(fēng)險組之間免疫細胞分數(shù)）

3 討論

惡性腫瘤容易出現(xiàn)細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致其難治性的最主要原因[8]。細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移本質(zhì)上依賴于細胞骨架蛋白的機械運動。LAD1作為一個細胞骨架相關(guān)蛋白，其蛋白分子量約59 kD，在脊椎動物物種中不保守，而且在無脊椎動物中不存在，這表明它的起源較晚[9]。LAD1 蛋白首先是從小鼠皮膚cDNA 文庫中克隆得到，編碼的蛋白除了包含一個精氨酸和6 個絲氨酸-谷氨酸（SEK）三肽結(jié)構(gòu)域外，沒有其他結(jié)構(gòu)域可以識別。

本研究通過TIME 2.0 數(shù)據(jù)庫分析得到LAD1 蛋白在乳腺癌組織中高表達。已有相關(guān)文獻報道，在對EGF 刺激的乳腺細胞系進行研究分析后，發(fā)現(xiàn)LAD1蛋白在EGF 激活的ERK 信號通路中起到了關(guān)鍵的作用。不僅其蛋白表達量有所增加，LAD1 蛋白還經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)性修飾。此外，LAD1 蛋白與其他關(guān)鍵的細胞骨架蛋白，如肌動蛋白actin，協(xié)同工作，共同調(diào)控乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。這一發(fā)現(xiàn)揭示了LAD1 在乳腺癌進展中扮演了至關(guān)重要的角色[10]。相關(guān)研究指出，在某些腫瘤中，Akt 和ERK 存在異常的磷酸化現(xiàn)象[11-12]。LAD1 不僅能與F-actin 形成復(fù)合體，還可以調(diào)節(jié)下游的Akt 和ERK 的磷酸化狀態(tài)。這種調(diào)節(jié)作用進一步影響癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[10]。根據(jù)以上已有的研究，LAD1 蛋白可通過影響重要信號通路等方式影響乳腺癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。

腫瘤微環(huán)境作為腫瘤免疫研究當(dāng)中最為重要環(huán)節(jié)，腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞與免疫細胞相互通，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。趨化因子是一組可溶性，大小約為8～14 kDa 的小分子蛋白，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[13]。它可以通過與細胞表面G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)相關(guān)作用，如刺激各類白細胞的定向和（或）非定向遷移。在腫瘤微環(huán)境中，趨化因子可以由腫瘤細胞、免疫細胞和基質(zhì)細胞分泌，分泌的趨化因子和細胞表面受體結(jié)合可激活多種信號途徑，并募集免疫細胞亞群進入腫瘤微環(huán)境中[14]。有研究提示，乳腺癌細胞株MCF-7 和T47D 產(chǎn)生的CCL5 可以自分泌方式直接或間接通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶9 的表達等途徑促進腫瘤的發(fā)展[15]。本團隊對乳腺癌TCGA 數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，LAD1 與腫瘤微環(huán)境中的M2 型巨噬細胞的表達呈正相關(guān)。M2 型巨噬細胞在誘導(dǎo)血管生成、限制免疫反應(yīng)和組織修復(fù)方面起著關(guān)鍵作用。一旦外周血中的單核細胞被招募到腫瘤部位，腫瘤微環(huán)境下可以迅速將單核細胞分化成TAMs。因此推測，LAD1 是否可以通過調(diào)節(jié)乳腺癌某種趨化因子，募集得到M2 型巨噬細胞，間接影響乳腺癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。

LAD1 蛋白在乳腺癌的發(fā)展中起到了重要的角色。它不僅參與了EGF 激活的ERK 信號通路，還影響了細胞骨架蛋白的動態(tài)調(diào)控和與Akt 和ERK 的磷酸化狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤微環(huán)境中的交互作用對于腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移也具有關(guān)鍵意義。趨化因子在腫瘤微環(huán)境中扮演了重要的角色，能夠影響免疫細胞的活性和遷移。特別地，LAD1 與腫瘤微環(huán)境中的M2 型巨噬細胞呈正相關(guān)，這些細胞在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸中起到了關(guān)鍵作用?？傊琇AD1 蛋白和腫瘤微環(huán)境的相互作用為乳腺癌的治療提供了新的機制和潛在的治療靶點。