DNA甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物在膀胱癌中的研究與應(yīng)用進(jìn)展

劉犇 施雨晨

據(jù)報(bào)道，在全球范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第10 位，死亡率位居第12 位，年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率男、女性分別為3.30/10 萬人年和0.86/10 萬人年[1]。在國內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率約為5.80/10 萬，位居所有惡性腫瘤的第13 位；死亡率約為2.37/10 萬[2]。近年來雖然膀胱癌治療方法在不斷進(jìn)步，但中美兩國膀胱癌發(fā)病率和死亡率并無明顯下降趨勢(shì)[3]。目前，膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)，也是其療效評(píng)估與復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的主要檢查手段[3-4]。這意味著患者需要在初診或隨訪過程中接受多次膀胱鏡檢查。然而，此類有創(chuàng)的侵入性操作具有時(shí)間和操作成本高、過程痛苦等缺點(diǎn)，患者依從性往往欠佳。而其他一些非侵入性檢查，如尿液脫落細(xì)胞學(xué)，CxBladder、BTA、Immnocyt/uCyt+、NMP22 等尿液生物標(biāo)志物或熒光原位雜交檢測(cè)等，也存在著靈敏度或特異度低、影響因素多、檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)，無法得到大范圍的推廣應(yīng)用[5-9]。DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物檢測(cè)作為一種新興的非侵入性檢測(cè)膀胱癌的方法，其臨床應(yīng)用具有較高的實(shí)踐意義，故本文就這類標(biāo)志物在膀胱癌中的研究與應(yīng)用進(jìn)展作一述評(píng)。

1 DNA 甲基化與腫瘤發(fā)生

表觀遺傳學(xué)修飾是在不涉及DNA 序列改變的情況下，基因功能所發(fā)生的變化；它可以調(diào)控包括細(xì)胞分化、胚胎發(fā)生與轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性在內(nèi)的諸多生理及病理過程。目前人類研究最廣泛的表觀遺傳學(xué)修飾是DNA 甲基化，它會(huì)影響DNA 穩(wěn)定性，引起染色體結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[10-11]。

DNA 甲基化是發(fā)生在5'-胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤-3'（CpG）二核苷酸位點(diǎn)的胞嘧啶5'碳原子上的共價(jià)修飾，由DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methylation transferase，DNMT）等一系列酶活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，最終得到5-甲基胞嘧啶。其中DNMT3A 與DNMT3B 催化DNA 的從頭甲基化，TET1、TET2、TET3 催化去甲基化；連續(xù)的細(xì)胞分裂也可導(dǎo)致去甲基化，DNMT1 可使DNA 在此過程中保存甲基化狀態(tài)[12]。CpG 二核苷酸位點(diǎn)在基因組中并非隨機(jī)平均分布，而是傾向于在編碼基因的調(diào)控區(qū)域（如啟動(dòng)子區(qū)）富集成CpG 島；正常組織中的CpG 島通常是去甲基化狀態(tài)，其甲基化一般會(huì)導(dǎo)致下游基因的轉(zhuǎn)錄抑制。腫瘤發(fā)生過程的一個(gè)共同特征是甲基化相關(guān)酶表達(dá)及調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致的全基因組低甲基化、CpG 島高甲基化異常狀態(tài)。這可能導(dǎo)致抑癌基因的失活或致癌基因的激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失常、侵襲和轉(zhuǎn)移激活、代謝重編程、血管生成、免疫逃避等，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[13-14]。

各項(xiàng)研究表明，DNA 甲基化狀態(tài)的總體性改變?cè)诎螂装┑霓D(zhuǎn)化過程中十分常見且其發(fā)生先于腫瘤形成，非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscular invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤性膀胱癌（muscular invasive bladder cancer，MIBC）具有不同的DNA 甲基化模式。Wolff 等[14]研究發(fā)現(xiàn)DNA 低甲基化在低級(jí)別、非侵襲性的尿路上皮腫瘤中更為普遍，IPF1、GALR1、TAL1、PENK 和TJP2 的甲基化水平在MIBC 樣本中明顯高于NMIBC。Robertson 等[15]對(duì)MIBC 的綜合分子特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DNA 低甲基化亞群的患者具有較高的生存率，SOX15、CYP2J2、EPHA1 等12 個(gè)基因的低甲基化與表達(dá)增加顯著相關(guān)，包括LXN、PARP6、NAPRT和SPATC1L 在內(nèi)的158 個(gè)基因發(fā)生了表觀遺傳沉默。Beukers 等[16]發(fā)現(xiàn)PcG 復(fù)合物靶基因中的ONECUT2、SOX21 和OTX1 在老年膀胱癌患者中具有更高的DNA甲基化比例，而PCDH7 在各年齡段膀胱癌患者中均表現(xiàn)出較高的DNA 甲基化比例，且正是這些PcG 復(fù)合物吸引DNMT，使一些細(xì)胞在發(fā)育早期便出現(xiàn)DNA 異常甲基化。NMIBC 的進(jìn)展與細(xì)胞周期阻滯、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等過程的相關(guān)基因甲基化有關(guān)，而MIBC 的低生存率則與CDH1、FHIT、LAMC2、RASSF1A、TIMP3、SFRP1、SOX9、PMF1 和RUNX3 基因的甲基化有關(guān)[17]。由于膀胱腫瘤直接與尿液接觸，腫瘤細(xì)胞中DNA 甲基化狀態(tài)可以通過尿液檢測(cè)得到反饋。以上結(jié)果提示，DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物是膀胱癌的一個(gè)有力標(biāo)志物。

2 DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物用于膀胱癌早期診斷

DNA 甲基化等表觀遺傳學(xué)修飾過程發(fā)生在DNA轉(zhuǎn)錄之前，這給膀胱癌的早期診斷提供了可能。80%～90%的膀胱癌患者以血尿?yàn)槭装l(fā)癥狀[2]，然而僅一部分血尿患者被確診為膀胱癌，這意味著相當(dāng)數(shù)量的血尿患者經(jīng)歷了不必要的膀胱鏡檢查。因此，在早期診斷與血尿患者篩查方面，DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物檢測(cè)舉足輕重。

最近，中國科學(xué)院北京基因組研究所通過計(jì)算尿液樣本中每個(gè)甲基化單倍體模塊的甲基化單倍型負(fù)荷，用LASSO 回歸分析獲得差異最顯著的DNA 甲基化標(biāo)志物，根據(jù)最佳權(quán)重整合支持向量機(jī)算法構(gòu)建的拷貝數(shù)變異模型，開發(fā)了一種集成分類器UCseek。UCseek 在驗(yàn)證集中的靈敏度和特異度分別為92.7%和90.7%，總體準(zhǔn)確度遠(yuǎn)勝于熒光原位雜交檢測(cè)和尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)；它在低級(jí)別尿路上皮癌和Ta/T1期患者中具有很高的準(zhǔn)確度（91.8%和94.3%），超低測(cè)序深度（0.3×～0.5×）下表現(xiàn)保持良好，證明其能早期且高效發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)尿路上皮癌的存在[18-19]。Cheng 等[20]對(duì)尿液cfDNA 進(jìn)行淺深度雙端全基因組測(cè)序后評(píng)估甲基化反褶積、全局低甲基化、拷貝數(shù)變異和cfDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDA 甲基化和拷貝數(shù)聯(lián)合檢測(cè)膀胱癌的靈敏度為93.5%（低級(jí)別非肌層浸潤性疾病為84.2%），特異度為95.8%。Zhang 等[21]通過檢測(cè)尿液樣本，構(gòu)建了一種基于NRN1 單基因甲基化結(jié)合TERT 與FGFR3 雙基因點(diǎn)突變的檢測(cè)模型，在外部驗(yàn)證集中靈敏度為86.4%，特異度為89.5%。Xu 等[22]通過亞硫酸氫鹽特異性qRTPCR 進(jìn)行ONECUT2 CpG 位點(diǎn)的DNA 甲基化分析，結(jié)合基于多重PCR 的二代測(cè)序分析Genetron health 17 基因組合的突變情況，在血尿患者隊(duì)列中驗(yàn)證靈敏度為94.0%，特異度為93.1%，陽性預(yù)測(cè)值為92.2%，陰性預(yù)測(cè)值為94.7%。Guo 等[23]使用甲基化特異性PCR 檢測(cè)了473 例受試者（包括217 例膀胱內(nèi)尿路上皮癌患者）尿液樣本中10 個(gè)基因的甲基化狀態(tài)，經(jīng)過組合與計(jì)算發(fā)現(xiàn)使用VIM、RASSF1A、GDF15 和TMEFF2 的甲基化狀態(tài)組合可以使診斷膀胱癌的靈敏度達(dá)到82%，特異度達(dá)到53%。

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院的黃健/林天歆團(tuán)隊(duì)在DNA 甲基化檢測(cè)技術(shù)utMeMA 的基礎(chǔ)上研發(fā)出了尿液DNA 甲基化診斷膀胱癌產(chǎn)品UriFind，同時(shí)對(duì)本院患者隊(duì)列、癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）隊(duì)列和GEO 隊(duì)列的膀胱癌測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，先鑒定出26 個(gè)膀胱癌顯著差異和特異性的DNA 甲基化位點(diǎn)，然后通過相關(guān)分析和LASSO 回歸確定ONECUT2 與VIM作為檢測(cè)位點(diǎn)[24-25]。UriFind 在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中均可精準(zhǔn)識(shí)別出膀胱癌患者，且其靈敏度和準(zhǔn)確度均超過熒光原位雜交和尿細(xì)胞學(xué)檢查；但需要注意的是，UriFind 在伴有泌尿系統(tǒng)影像學(xué)異常的膀胱癌疑似患者隊(duì)列中的陽性預(yù)測(cè)值較高（92.9%），說明其有利于膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療；而在血尿患者篩查時(shí)，其陰性預(yù)測(cè)值高達(dá)97.6%，說明Urifind 可以為血尿患者避免不必要的膀胱鏡檢查[24-25]。相似的，已通過美國FDA 臨床實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目（laboratory developed test，LDT）認(rèn)證的AssureMDx 結(jié)合了甲基化特異性PCR 和多重SNaPshot，在血尿患者中的總體陰性預(yù)測(cè)值高于99%，可排除無需進(jìn)一步檢查的血尿患者，從而減少首診過程中77%不必要的膀胱鏡檢查[26]。關(guān)于評(píng)估AssureMDx 對(duì)血尿患者膀胱癌檢出能力的臨床試驗(yàn)NCT03122964 已在美國進(jìn)行中。另一通過LDT 認(rèn)證的檢測(cè)方法Bladder CARETM，采用無亞硫酸氫鈉的MSRE-qPCR 法檢測(cè)SOX1、IRAK3 和LINE1 的DNA 甲基化狀態(tài)，由于減少了對(duì)DNA 樣品的損耗而取得了較低的檢測(cè)下限，甚至可檢出濃度僅為0.046%的膀胱癌細(xì)胞DNA，這對(duì)于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)意義重大[27]。

UroMark 由英國倫敦大學(xué)研發(fā)，其研究人員結(jié)合標(biāo)本全基因組甲基化測(cè)序與TCGA 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果，通過隨機(jī)森林模型分析確認(rèn)了150 個(gè)差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR），并使用RainDropBS-Seq 分析檢測(cè)尿液DNA 中的150 個(gè)DMR。在274 例血尿患者組成的驗(yàn)證隊(duì)列中，UroMark 的靈敏度和特異度分別達(dá)到98%和97%，陰性預(yù)測(cè)值為97%[28]。它的效能將在2 項(xiàng)前瞻性、多中心的觀察性研究中得到進(jìn)一步評(píng)估，其中DETECTⅠ（臨床試驗(yàn)NCT02676180）評(píng)估了UroMark 在血尿患者中排除膀胱腫瘤的陰性預(yù)測(cè)能力，DETECT Ⅱ（臨床試驗(yàn)NCT02781428）評(píng)估了UroMark 在新發(fā)或復(fù)發(fā)患者中檢測(cè)膀胱腫瘤的靈敏度，但上述研究結(jié)果仍未發(fā)布。

3 DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物用于膀胱癌復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)

NMIBC 患者存在著較高的復(fù)發(fā)和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，因此需要在治療后接受長期甚至終身的隨訪[2，5]。在此過程中，反復(fù)的膀胱鏡檢查會(huì)給患者帶來痛苦和心理負(fù)擔(dān)。因此，利用DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物補(bǔ)充或代替部分膀胱鏡檢查是十分必要的。

以色列Nuclexi 公司推出的Bladder Epicheck 通過RT-PCR 檢測(cè)基因組中15 個(gè)位點(diǎn)的DNA 甲基化。在歐洲一項(xiàng)多中心、前瞻性臨床試驗(yàn)（NCT02647112）中，Bladder Epicheck 被用于檢測(cè)440 例膀胱癌的患者的NMIBC 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果顯示其可以有效預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)（靈敏度為67%，特異度為88%，陰性預(yù)測(cè)值為94%），且對(duì)高級(jí)別腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)更為靈敏；決策曲線分析顯示其可使患者減少不必要的膀胱鏡檢查和細(xì)胞學(xué)檢查[29]。Kandimalla 等[30]將尿液中OTX1、ONECUT2 與OSR1 的DNA 甲基化與FGFR3 突變狀態(tài)結(jié)合，其監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)性NMIBC 的靈敏度和特異度分別為79%和77%。許多在膀胱癌早期診斷中得到應(yīng)用的檢測(cè)方法亦可用于膀胱癌術(shù)后監(jiān)測(cè)。在42 例患者組成的隨訪隊(duì)列中，UCseek 監(jiān)測(cè)小病灶復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確度為90.91%，明顯高于膀胱鏡檢查的59.09%，這說明其能有效監(jiān)測(cè)術(shù)后殘留和復(fù)發(fā)，有利于膀胱癌的疾病管理[18]。國內(nèi)正在進(jìn)行的一項(xiàng)多中心、前瞻性臨床試驗(yàn)（ChiCTR2200063932）將通過分析入組膀胱癌患者術(shù)后隨訪階段的數(shù)據(jù)來明確UCseek 對(duì)膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)及預(yù)測(cè)效能。Bladder CARETM在90 例經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切除術(shù)后隨訪的患者隊(duì)列中取得了86%的靈敏度和89%的特異度，成功預(yù)測(cè)了80%的患者腫瘤復(fù)發(fā)，優(yōu)于細(xì)胞學(xué)檢查的35%和膀胱鏡檢查的15%[31]。Deng 等[32]在分析TCGA 數(shù)據(jù)與大型病例對(duì)照研究的基礎(chǔ)上，選擇DMRTA2 甲基化作為單靶點(diǎn)標(biāo)志物，在驗(yàn)證集中檢出膀胱癌的總體靈敏度為82.9%，特異度為92.5%，對(duì)膀胱癌復(fù)發(fā)的檢出率為80.0%。

綜上所述，在NMIBC 治療后的隨訪中，DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物檢測(cè)在發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)病灶方面具有接近膀胱鏡檢查的靈敏度和較高的陰性預(yù)測(cè)值，期待這些檢測(cè)方法的聯(lián)合應(yīng)用能減少甚至替代部分膀胱鏡檢查。但針對(duì)不同危險(xiǎn)分層的NMIBC 的不同隨訪方案，現(xiàn)有研究未作進(jìn)一步細(xì)化；且目前仍無有效的DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物被用于MIBC 術(shù)后的隨訪與復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。

4 DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物用于膀胱癌危險(xiǎn)分層

指南推薦對(duì)于低危NMIBC、高危NMIBC 與MIBC患者采取不同的治療方式，不同危險(xiǎn)程度膀胱癌的隨訪措施也有所不同[2，5]。已有研究表明，NMIBC 與MIBC 具有差異化的DNA 甲基化特征，膀胱癌組織中不同的DNA 甲基化改變也與膀胱癌的譜系和惡性程度密切相關(guān)[33-34]。因此，通過DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物檢測(cè)早期明確膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)對(duì)患者的治療及隨訪具有指導(dǎo)意義。

武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科王行環(huán)團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)且定位了17 個(gè)膀胱癌相關(guān)DMR，并在此基礎(chǔ)上建立了一種針對(duì)特異性DNA 甲基化特征的靶向測(cè)序分析方法，將DNA 甲基化單倍體型分為T1DMR（來自腫瘤祖細(xì)胞的可遺傳的細(xì)胞類型特異性DNA 甲基化）和T2DMR（腫瘤發(fā)生過程中的DNA 甲基化從頭合成）后進(jìn)行分層聚類分析。在多中心前瞻性臨床驗(yàn)證隊(duì)列中以雙盲方式對(duì)259 份尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)，模型預(yù)測(cè)產(chǎn)生的數(shù)值結(jié)果（基底型/管腔型腫瘤評(píng)分）可準(zhǔn)確地區(qū)分MIBC 與NMIBC，且與腫瘤的WHO 分級(jí)密切相關(guān)；術(shù)前尿液腫瘤評(píng)分可以將患者區(qū)分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，術(shù)后尿液腫瘤評(píng)分可以預(yù)測(cè)患者的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)[34-35]。

Chen 等[25]開發(fā)的甲基化檢測(cè)技術(shù)utMeMA，通過MassARRAY 方法基于檢測(cè)OTX1 與SOX1-OT 兩位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)計(jì)算得到尿液診斷評(píng)分，它與膀胱癌的分期分級(jí)與數(shù)量大小呈正相關(guān)，可反映腫瘤的惡性程度和腫瘤負(fù)荷，幫助醫(yī)患作出診療決策。同一團(tuán)隊(duì)在UriFind 的基礎(chǔ)上添加了3 個(gè)甲基化指標(biāo)（OSTM1、SLC4A10、AC092805.1），構(gòu)成了一個(gè)5 種標(biāo)志物分層模型，在98 例膀胱癌疑似患者伴隨泌尿系統(tǒng)成像異常患者組成的隊(duì)列中，以90.5%的靈敏度和86.8%的特異度識(shí)別出了高風(fēng)險(xiǎn)的膀胱癌（高危NMIBC 和MIBC）患者[24]。

5 小結(jié)

近年來，許多DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物在世界范圍內(nèi)得到廣泛臨床應(yīng)用，這樣多位點(diǎn)、大范圍的應(yīng)用證明了其優(yōu)越性。部分DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物應(yīng)用概況見表1[18，24-28，36-38]。

表1 部分DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物應(yīng)用概況

DNA 甲基化本身是一種相對(duì)穩(wěn)定存在的生物學(xué)標(biāo)志，可以被精確量化并比較；在上述許多研究中，尿液中DNA 的甲基化狀態(tài)被證明為不受其他尿路良性病變影響，也與患者的具體臨床特點(diǎn)無關(guān)。這都說明了DNA 甲基化作為檢測(cè)位點(diǎn)的優(yōu)越性。作為一種液體活檢策略，DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物在膀胱癌診治過程中的應(yīng)用具有其他檢測(cè)方式不具備的優(yōu)點(diǎn)。便捷、無創(chuàng)的操作可以減輕患者的生理及心理負(fù)擔(dān)，提升膀胱癌患者在整個(gè)疾病管理過程中的依從性，有利于在早期篩查或復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)過程中進(jìn)行反復(fù)檢查，也為偏遠(yuǎn)地區(qū)的患者提供了更具有可及性的輔助檢查手段。而較高的陰性預(yù)測(cè)值可以為患者減少不必要的膀胱鏡檢查，減少人力及經(jīng)濟(jì)損耗。由于診斷偏倚，在DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物檢測(cè)呈陽性而進(jìn)行的后續(xù)膀胱鏡檢查過程中，尿路上皮癌檢出率會(huì)顯著提高[39]。但這類診斷方法仍然存在著一些不足。許多DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物都展現(xiàn)出較高的靈敏度，但是其特異度的表現(xiàn)不盡如人意。部分假陽性可能是由于在患者出現(xiàn)膀胱癌的癥狀、體征和實(shí)體腫瘤之前，形態(tài)學(xué)正常的尿路上皮細(xì)胞中已發(fā)生了相關(guān)基因的DNA 甲基化，因此需要對(duì)“健康隊(duì)列”進(jìn)行長期隨訪，以進(jìn)一步明確其狀態(tài)[40]。此外，許多尿液生物標(biāo)志物檢測(cè)在可重復(fù)性上并不理想，這歸因于腫瘤異質(zhì)性，也可能是受制于醫(yī)生對(duì)患者狀態(tài)的選擇與檢測(cè)程序的復(fù)雜性[5，41]。將DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物作為膀胱癌診斷標(biāo)志物的基礎(chǔ)研究和實(shí)用產(chǎn)品數(shù)量眾多，但仍有許多尚未經(jīng)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)證實(shí)，今后仍需更大的驗(yàn)證隊(duì)列、更長的隨訪時(shí)間作進(jìn)一步驗(yàn)證，這也意味著眾多基礎(chǔ)研究成果的臨床轉(zhuǎn)化需要巨大成本。

需要注意的是，雖然指南列入了部分DNA 甲基化尿液生物標(biāo)志物作為診斷與隨訪手段的補(bǔ)充，但膀胱鏡檢查仍是目前膀胱癌診斷與復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[40，42]。

6 展望

除了上文所述的疑診患者診斷分層和術(shù)后患者定期隨訪，臨床上也可以利用DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物在高危人群（吸煙等）和職業(yè)暴露者（如接觸芳香胺、多環(huán)芳烴和氯化烴等化學(xué)試劑的從業(yè)人員）中進(jìn)行篩查，這將有助于對(duì)膀胱癌患者的早診早治，降低膀胱癌的死亡率與疾病負(fù)荷。

在精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，以DNA 甲基化為基礎(chǔ)的膀胱癌診治策略顯得尤為重要。二代測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，三代測(cè)序技術(shù)也在不斷優(yōu)化，隨著基礎(chǔ)研究的不斷進(jìn)步，越發(fā)全面地揭示DNA 甲基化的生物學(xué)特征以及其與腫瘤的聯(lián)系。這預(yù)示著DNA 分子水平的診斷技術(shù)將不斷精進(jìn)，膀胱癌分子分型體系將不斷完善，包括DNA 甲基化在內(nèi)的許多與腫瘤致病機(jī)制相關(guān)的遺傳物質(zhì)位點(diǎn)將被發(fā)現(xiàn)，而這些位點(diǎn)都可以成為膀胱癌精準(zhǔn)診斷與治療的靶標(biāo)。結(jié)合阿扎胞苷、地西他濱等DNA 去甲基化藥物，醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以更高效地為膀胱癌患者提供個(gè)體化的DNA 甲基化抑制策略；雖還未應(yīng)用至臨床，但此類逆轉(zhuǎn)DNA 甲基化的治療已在一些基礎(chǔ)研究中得到證實(shí)[43-45]。

Agundez 等[46]、Allen 等[47]發(fā)現(xiàn)，特定基因的DNA 甲基化狀態(tài)可用于預(yù)測(cè)T1期高級(jí)別膀胱癌患者對(duì)卡介苗膀胱灌注治療的反應(yīng)性，從而進(jìn)一步指導(dǎo)相關(guān)治療策略。Li 等[48]通過聚類分析確定的Methy-High 亞群膀胱癌細(xì)胞對(duì)DNMT 抑制劑SGI-110 具有更靈敏的反應(yīng)。Jarmalaite 等[49]發(fā)現(xiàn)p16 基因高DNA 甲基化的膀胱癌患者對(duì)IL-2 的治療反應(yīng)較好。Hu 等[50]基于5-甲基胞嘧啶調(diào)控因子開發(fā)了一個(gè)分子亞型系統(tǒng)，以全面反映膀胱癌的生物學(xué)特征，其中5-甲基胞嘧啶評(píng)分較高組對(duì)免疫治療、新輔助化療和放療的敏感性較低，但對(duì)抗血管生成療法和靶向治療的敏感性較高。先前有研究發(fā)現(xiàn)DNMT 抑制劑可以通過IFN-Ⅰ反應(yīng)促進(jìn)腫瘤浸潤免疫細(xì)胞聚集，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)DNA 異常甲基化造成的免疫檢查點(diǎn)抑制劑耐藥[51]。許多研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化水平與膀胱腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性相關(guān)[47，52-60]；但Taber 等[61]通過多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化簇與MIBC 的化療反應(yīng)之間無明顯關(guān)聯(lián)，Casadevall等[62]總結(jié)包括DNA 甲基化在內(nèi)的表觀遺傳學(xué)改變對(duì)膀胱癌患者預(yù)后的影響尚不清楚。因此，DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物對(duì)膀胱癌治療與長期管理的指導(dǎo)作用仍有待進(jìn)一步研究明確。

繼Conrad Waddington 在1957 年提出“沃丁頓表觀遺傳景觀”的概念以描述細(xì)胞發(fā)育分化的狀態(tài)后，發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者們逐漸開始運(yùn)用數(shù)學(xué)建模模擬這一過程。Feinberg 等[63]在此觀點(diǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了拓展，提出可以通過數(shù)學(xué)建模聯(lián)系癌癥的表型可塑性與驅(qū)動(dòng)癌癥的表觀遺傳變化。期待此方法用于定量描述膀胱癌細(xì)胞基因組中的DNA 甲基化水平，從而直接、細(xì)致地分類并量化膀胱癌致病過程中的表觀遺傳學(xué)異常，探尋其與癌癥表觀遺傳景觀和行為特征的關(guān)系，在臨床前階段更精準(zhǔn)、有效地作出膀胱癌的早期診斷與預(yù)后評(píng)估，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更有針對(duì)性的早期干預(yù)。

盡管存在一些缺陷與挑戰(zhàn)，不可否認(rèn)的是DNA 甲基化相關(guān)尿液生物標(biāo)志物具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和實(shí)用價(jià)值，在膀胱癌診治中的應(yīng)用前景值得肯定。

（本文由浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)推薦）