外泌體miRNA 在早期篩查與治療阿爾茨海默病的相關(guān)研究進(jìn)展

張俊峰，郝麗亞，高紅艷，劉光甫，張祖源，郭永剛

（平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，河南 平頂山 467000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是臨床常見的一種神經(jīng)退行性疾病，神經(jīng)病理學(xué)特征是大腦內(nèi)老年斑形成以及神經(jīng)纖維纏結(jié)，主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降和記憶能力減退。 隨著全球人口的老齡化，AD 的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢。然而由于AD 的病理機制復(fù)雜且尚未明確，目前仍然沒有發(fā)現(xiàn)高效靈敏的AD 早期診斷生物標(biāo)記物，同時臨床常用藥物治療AD 的效果也差強人意，這些都給社會和患者家庭帶來了巨大的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體（exosomes）是一種攜帶多種生物活性物質(zhì)的細(xì)胞外囊泡，在AD、帕金森癥（Parkinson’s disease，PD）和亨廷頓病（Huntington’s disease，HD）等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用［1］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，外泌體微小RNA（microRNA，miRNA）可以由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞等各種細(xì)胞分泌而來，在不同細(xì)胞之間的通訊發(fā)揮重要作用并且通過觀察表達(dá)含量變化間接反映大腦病變損傷程度，可以作為AD 早期篩查的生物標(biāo)志物［2］。 最重要的是外泌體可以通過血腦屏障從而到達(dá)病變腦區(qū)域發(fā)揮療效，具有治療神經(jīng)退行性疾病的潛在價值［3］。 本文就外泌體miRNA 在AD 中的診斷意義及治療前景進(jìn)行綜述，以期為臨床早期篩查和治療預(yù)防AD 提供思路參考。

1 外泌體miRNA 概述

外泌體是由內(nèi)泌體衍生而來直徑為30～150 nm的脂質(zhì)層包膜囊泡，Trams 等［4］于1981 年首次在羊網(wǎng)織紅細(xì)胞發(fā)現(xiàn)。 隨后的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，外泌體可以由神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）等多種類型細(xì)胞產(chǎn)生并釋放到血清、血漿、尿液、唾液、腦脊液和羊水中［2］。 外泌體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要活性物質(zhì)由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA 等多種成分組成，供體細(xì)胞合成釋放外泌體后，通過與靶細(xì)胞間接結(jié)合信號受體或直接與質(zhì)膜融合將外泌體中活性成分輸送至細(xì)胞質(zhì)中，從而介導(dǎo)細(xì)胞之間的信息傳遞發(fā)揮生物學(xué)作用［5］。 作為外泌體的重要組成部分之一，miRNA是一類由22～25 個核苷酸組成的小的非編碼RNA，通過與靶基因的3’ 未翻譯區(qū)（3’-Untranslated region，3’-UTR）結(jié)合從而抑制轉(zhuǎn)錄或阻滯翻譯［6］。越來越多的研究證明miRNA 與AD 的病理過程密切相關(guān)。 miRNA 可以調(diào)節(jié)α-secretase 和β-secretase等淀粉前體蛋白代謝相關(guān)酶蛋白的表達(dá)，還可以下調(diào)載脂蛋白E4（apolipoprotein E，apoE4）和2 型髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）的表達(dá)介導(dǎo)β 淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的清除，同時miRNAs 的表達(dá)水平與Tau 蛋白磷酸化水平密切相關(guān)；miRNA 還參與了其他與AD 發(fā)病相關(guān)的機制，比如氧化應(yīng)激、線粒體自噬、神經(jīng)炎癥、突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)釋放與清除異常［7］。

2 外泌體miRNA 參與阿爾茨海默病的病變過程

近年來已經(jīng)有很多研究證實海馬神經(jīng)發(fā)生抑制、突觸可塑性損傷、神經(jīng)炎癥等多種因素是AD 發(fā)生的重要病理機制［8－9］。 Abdullah 等［10］使用Aβ 刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）磷酸化增加從而減少外泌體的生成。 同時另外一項研究指出炎癥因子白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)多個外泌體miRNA 的表達(dá)發(fā)生了改變［11］。 這提示外泌體miRNA 可能參與AD 的病變過程。 神經(jīng)元來源的外泌體miR-124 通過間接調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸轉(zhuǎn)運體1（glutamate transporter-1，GLT-1）的蛋白表達(dá)，從而介導(dǎo)突觸可塑性變化［12］。 反復(fù)輕度顱腦外傷（repetitive mild traumatic brain injury，rmTBI）也被認(rèn)為是AD 的重要風(fēng)險因素。 Ge 等［13］在rmTBI 小鼠模型的海馬和皮質(zhì)損傷區(qū)域中發(fā)現(xiàn)有十個小膠質(zhì)細(xì)胞來源外泌體miRNA 的表達(dá)發(fā)生改變，其中變化最明顯的是miR-124-3p。 有趣的是AD 不同病程階段的同個小膠質(zhì)細(xì)胞源性外泌體miRNA 變化也大相徑庭，這提示外泌體miRNA 在AD 不同時期的作用可能有差異，因此需要在AD 的不同時期確定特異性改變外泌體miRNA 從而明確其具體作用機制。 隨后通過體內(nèi)外實驗證實隨著外泌體miR-124 的表達(dá)增加，可以直接調(diào)節(jié)Rela／ApoE 信號通路活性使腦源性營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）表達(dá)增加且淀粉前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）和Aβ 的生成減少，改善海馬神經(jīng)元損傷從而恢復(fù)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［13］。 此外，Micci 等［14］發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞來源的外泌體miR-17、miR-322 和miR-485 的表達(dá)比成熟海馬神經(jīng)元來源的外泌體高，并且在AD 小鼠模型中通過腦室注射海馬神經(jīng)干細(xì)胞來源的外泌體后，海馬Ca2＋／鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋／calmodulin-dependent kinase II，CaMKII）的磷酸化水平上升，神經(jīng)元軸突上Aβ 表達(dá)減少，從而使興奮性突觸后電位幅度增加，AD 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到改善；然而腦室注射成熟海馬神經(jīng)元來源的外泌體并沒有得到上述治療效果，說明不同細(xì)胞來源的外泌體對AD 的治療效果具有一定差異性，未來研究還需要注意比較不同細(xì)胞來源的同種外泌體miRNA 的表達(dá)是否有差別。 綜上可知，外泌體miRNA 參與了AD 病理生理過程，然而多種外泌體miRNA 聯(lián)合運用是否具有協(xié)同或拮抗調(diào)控作用值得后續(xù)深入分析研究。

3 外泌體miRNA 作為阿爾茨海默病患者早期篩查生物標(biāo)記物的應(yīng)用

AD 患者在表現(xiàn)認(rèn)知和記憶功能減退等癥狀之前，海馬和前額葉皮層等腦區(qū)就已經(jīng)出現(xiàn)β 淀粉樣蛋白沉積形成細(xì)胞外斑塊和Tau 蛋白過度磷酸化形成細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)等病理改變［15］。 因此早期篩查AD 的生物標(biāo)記物使用對疾病的預(yù)防治療具有重要意義。 Xing 等［16］通過meta 分析發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA 生物標(biāo)志物在AD 尤其是輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）患者的早期篩查中具有潛在診斷價值。 最新研究還發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA 可以作為有效早期篩查生物標(biāo)志物在MCI出現(xiàn)前5～7 年檢測出AD 高患病率人群［17］。 外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞合成釋放后可以通過血腦屏障進(jìn)入腦脊液或外周血液中，同時由于外泌體的雙層磷脂酶層結(jié)構(gòu)，可以使miRNA 不被循環(huán)系統(tǒng)中的核糖核酸酶所降解［18］。因此可以在AD 患者的外周血液以及腦脊液中檢測到外泌體miRNA 的表達(dá)變化，對AD 患者進(jìn)行早期篩查從而達(dá)到預(yù)防治療效果。

目前關(guān)于對臨床常見樣本的外泌體分離技術(shù)已逐漸成熟，主要分離方法有超速離心法、密度梯度分離法、尺寸排除色譜法、聚合物沉淀和免疫親合力捕獲法等［19－20］。 然而直接檢測外泌體中的miRNA 比較困難，并且在生物體液中，大多數(shù)體液循環(huán)的miRNA 通常與蛋白質(zhì)結(jié)合或被捕獲在外泌體中［18］。 因此，需要特定的技術(shù)工具釋放這些低分子量RNA 分子才能對其進(jìn)行分析和檢測，這也是影響AD 早期臨床診斷效率的重要原因之一。 但是隨著生物技術(shù)的發(fā)展和納米醫(yī)學(xué)的興起，已經(jīng)有多種新型檢測方法被陸續(xù)研發(fā)使用，如電化學(xué)生物傳感器、熒光生物傳感器、表面等離子體共振生物傳感器、DNA 納米技術(shù)等［21－23］。

3.1 外泌體miRNA 在阿爾茨海默病患者血清和血漿的變化

血液外泌體是由活細(xì)胞分泌到循環(huán)血液中的細(xì)胞外囊泡，被認(rèn)為是一種相對無創(chuàng)的監(jiān)測腦生理和疾病狀態(tài)的新型工具［24］。 越來越多的研究發(fā)現(xiàn)血液外泌體miRNA 可能作為檢測AD 的重要生物標(biāo)志物之一，Nie 等［25］通過測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)AD 患者血漿中外泌體miRNA 有22 個表達(dá)上調(diào)和21 個表達(dá)下調(diào)。 此外，Lugli 等［26］也檢測到AD 患者血漿外泌體miRNA 有20 個的表達(dá)發(fā)生變化。 這兩項研究數(shù)據(jù)中都顯示外泌體miR-34-3p 在AD 患者血漿中表達(dá)下調(diào)，說明血漿外泌體miR-342-3p 的表達(dá)變化與AD 的病理過程密切相關(guān)。 值得注意的是不同種族人群的AD 患者外泌體miRNA 表達(dá)譜變化還是具有差異性，這也提示未來的研究還需要進(jìn)一步精細(xì)不同種族人群AD 患者的血液外泌體miRNA 的診斷變化標(biāo)準(zhǔn)［27］。 同時，Cha 等［28］利用L1 細(xì)胞粘附分子（L1 cell adhesion molecule，L1CAM）抗體結(jié)合磁珠的方法捕獲神經(jīng)元來源的外泌體并發(fā)現(xiàn)miR-212 和miR-132 水平下調(diào)；Li 等［29－30］神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）／amphiphysin 1 雙標(biāo)記方法檢測AD 患者血漿中外泌體miR-29c 和miR-384 的表達(dá)上升，并且與Aβ42、Aβ42／40、Tau 和P-T181-Tau 的表達(dá)呈正相關(guān)，這提示可以根據(jù)對不同細(xì)胞來源的血漿外泌體miRNA進(jìn)行表達(dá)分析可能會使診斷結(jié)果更精準(zhǔn)化。 還有研究對AD 患者血清中外泌體miRNA 變化進(jìn)行分析并發(fā)現(xiàn)miR-135a 和miR-384 表達(dá)上調(diào)，而miR-193b 表達(dá)下調(diào)；同時，AD 患者血清外泌體miR-384的表達(dá)水平明顯高于血管性癡呆（vascular dementia，VD） 和 帕 金森 病 伴 癡 呆（Parkinson’ s disease with dementia，PDD）患者［31］。 這說明多種血清外泌體miRNA 的同時檢測有可能會使AD 的早期診斷方面更加具體化。 另外，Wei 等［32］發(fā)現(xiàn)AD患者血清外泌體miR-223 表達(dá)降低，且與簡易精神狀態(tài)檢查量表（ mini-mental state examination，MMSE）評分、臨床癡呆分級量表（clinical dementia rating，CDR）評分以及血清中炎癥因子IL-1β，IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性。 以上均提示血清外泌體miRNA 也是一種具有潛在診斷價值的AD 生物標(biāo)記物。 值得注意的是外周血外泌體中miRNAs 的水平是否受性別、種族、年齡、受教育程度等因素的影響還亟待進(jìn)一步研究。

3.2 外泌體miRNA 在阿爾茨海默病患者腦脊液的變化

腦脊液含有一定的細(xì)胞及化學(xué)成分，病理情況下這些物質(zhì)成分會發(fā)生改變，可以通過對腦脊液檢測分析從而進(jìn)行疾病的初步診斷［33］。 Gui 等［34］通過提取AD 患者腦脊液中的外泌體進(jìn)行miRNA 表達(dá)譜變化檢測發(fā)現(xiàn)AD 患者腦脊液中外泌體miRNA的表達(dá)與健康人群相比有6 個miRNA（miR-29c、miR-136-3p、miR-16-2、miR-331-5p、miR-132-5p 和miR-485-5p）表達(dá)水平發(fā)生改變。 但是，Liu 等［35］發(fā)現(xiàn)AD 患者腦脊液中外泌體miR-193b 的表達(dá)下降。而McKeever 等［36］在AD 患者腦脊液中檢測到外泌體miR-605-5p、miR-451a、miR-125b-5p 和miR-16-5p的變化都發(fā)生了不同變化。 造成這些研究結(jié)果出現(xiàn)差異性的原因，可能是由于不同樣品中miRNA 的穩(wěn)定性和濃度差異以及分析方法使用多樣性等因素造成，這些因素也阻礙了外泌體miRNA 作為AD患者早期篩查的生物標(biāo)志物在臨床實踐中的推廣。

在臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)中將小于65 歲的AD 患者歸類為早發(fā)型AD（young-onset Alzheimer’s disease，YOAD），而將大于65 歲的AD 患者歸類為晚發(fā)型AD（late-onset Alzheimer’ s disease， LOAD）。 在YOAD 患者腦脊液中外泌體miR-16-5p 的表達(dá)下降，而在LOAD 中沒有發(fā)現(xiàn)這種變化［36］。 Schneider等［37］發(fā)現(xiàn)腦脊液外泌體miR-204-5p 和miR-632 可能是遺傳性額顳葉癡呆（frontotemporal dementia，F(xiàn)TD）的診斷生物標(biāo)志物，而miR-632 可能是散發(fā)性FTD 的診斷生物標(biāo)志物。 以上提示不同病程階段或不同類型的AD 可以使用多種特異性外泌體miRNA 作為生物標(biāo)記物進(jìn)行早期篩查。 此外，Riancho 等［38］發(fā)現(xiàn)AD 患者腦脊液外泌體中miR-9和miR-598 的含量明顯高于無外泌體的腦脊液中miR-9 和miR-598 的含量，提示這兩種miRNA 可能被選擇性包裹在外泌體中。 雖然這些研究發(fā)現(xiàn)了AD 患者腦脊液中外泌體miRNA 的差異表達(dá)變化，為AD 早期篩查方法提供新的參考。 但目前臨床抽取腦脊液需要進(jìn)行有創(chuàng)操作，具有一定的難度和風(fēng)險，因此在早期篩查中具有局限性，選擇外周血液外泌體miRNA 作為AD 的特異性標(biāo)記物比腦脊液外泌體miRNA 更具優(yōu)勢。 與此同時，尿常規(guī)也是臨床檢測中常用手段，Song 等［39］在5x FAD 小鼠模型尿液中發(fā)現(xiàn)48 種外泌體miRNA 表達(dá)發(fā)生變化，并且周穎等［40］已經(jīng)在AD 患者的尿液中成功提取出外泌體。 未來可以對AD 患者尿液中外泌體miRNA表達(dá)是否發(fā)生變化展開進(jìn)一步研究工作。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體miRNA 作為阿爾茨海默病潛在治療方法的研究前景

改善AD 治療有效性的主要困難之一就是缺乏有效轉(zhuǎn)運載體來運輸藥物穿過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮治療功效。 作為納米載體的外泌體具有免疫原性低和天然穩(wěn)定性好的特點，同時不會被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)所吞噬且運輸效率高并能穿過血腦屏障［41］。 近年研究報告，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)使MSC 內(nèi)的miRNA 表達(dá)升高或降低，隨后提取的外泌體都檢測到miRNA 發(fā)生相應(yīng)的變化并將其通過不同的方式注射到AD 大鼠體內(nèi)可以改善其學(xué)習(xí)記憶功能［42］。 將MSC 來源的外泌體注射到AD 大鼠海馬CA1 區(qū)，觀察到過表達(dá)miR-29b 的外泌體可以降低β 位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）和Bcl-2相互作用細(xì)胞凋亡介導(dǎo)因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，BIM）的表達(dá)，減少Aβ 的形成和神經(jīng)元丟失從而改善空間學(xué)習(xí)記憶能力［43］。 Ma等［44］通過尾靜脈注射過表達(dá)miR-132-3p 的外泌體后發(fā)現(xiàn)靶基因Ras p21 蛋白活化子1（Ras p21 protein activator 1，RASA1）在VD 小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)域的表達(dá)減少，Ras／Akt／GSK-3β 信號通路激活，導(dǎo)致海馬和皮質(zhì)區(qū)域的樹突分支和樹突棘數(shù)量增加且神經(jīng)元凋亡率降低，從而減輕學(xué)習(xí)記憶能力下降癥狀。 Nakano 等［45］將過表達(dá)miR-146a 的骨髓MSC（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSC）注射到APP／PS1 小鼠的側(cè)腦室脈絡(luò)叢中，突觸數(shù)量恢復(fù)正常，提高學(xué)習(xí)記憶能力的同時也可以在腦脊液中檢測到外泌體中的miR-146a 表達(dá)也增加；隨后在體外實驗中觀察到，BM-MSC 分泌的外泌體miR-146a作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致靶基因腫瘤壞死因子受體 相 關(guān) 因 子 6 （ tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）的表達(dá)下降，核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）生成減少從而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)；值得注意的是Aβ 的生成和神經(jīng)元丟失的病變情況并沒有得到改善，可能的原因是不同的外泌體miRNA 改善AD 癥狀的機制不相同或者使用不同類型的AD 動物模型所導(dǎo)致。 然而AD的病理機制復(fù)雜，目前常用實驗動物模型并不能很好地模擬AD 患者的所有臨床分期的特點和病理特征。 例如Wenger 等［46］使用基于定性和定量質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對兩種常用的AD 小鼠模型（Thy1-hTau.P301 S 和rTg（tauP301 L）4510）進(jìn)行深入分析發(fā)現(xiàn)這兩種AD 小鼠模型在疾病期間都會積累不溶性Tau 種類，這反映了人類AD 早期階段攜帶P301 L Tau 突變的病理學(xué)特征。 然而，對于人類AD 晚期階段很重要的Tau 泛素化和乙?；谛∈竽Ｐ椭袥]有表現(xiàn)出來［46］。 因此外泌體miRNA 是否可以作為AD 的一種臨床治療手段還需要在臨床試驗中進(jìn)一步驗證。

雖然外泌體是miRNA 的一種理想轉(zhuǎn)運載體，但在實際應(yīng)用上miRNA 的裝載效率并不高，并且靜脈注射的方式會使經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)傳遞后的外泌體被肝、腎和脾等其他器官所攝取［47］。 因此如何提高外泌體的裝載效率以及精準(zhǔn)靶向且高效運輸至病變腦區(qū)是需要未來不斷完善解決的技術(shù)問題。 近年有研究報告，外界條件干預(yù)可以影響外泌體內(nèi)miRNA 的含量［48］。 與正常氧處理組相比，低氧預(yù)處理MSC 可以使分泌的外泌體內(nèi)miR-21 的表達(dá)增加，并且能更好恢復(fù)APP／PS1 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。 此外，利用基因工程方法在外泌體表面添加生物分子可以改變其靶向能力。 使用狂犬病病毒糖蛋白（rabies viral glycoprotein，RVG）多肽修飾MSC來源的外泌體可以提高靜脈注射后靶向APP／PS1小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)域的數(shù)量，更有效地抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和減少Aβ 沉積［49］。

5 總結(jié)與展望

綜上而言，在AD 患者的早期階段，腦脊液和外周血液中的外泌體miRNA 表達(dá)發(fā)生變化，可以作為早期診斷AD 的有效生物標(biāo)記物；并且作為小分子物質(zhì)的外泌體能穿過血腦屏障，可以將裝載miRNA的外泌體作為一種小分子治療藥物靶向輸送至受損腦區(qū)，從而為臨床診治AD 提供一種新的方案。但外泌體miRNA 作為一種基因治療方法在臨床的應(yīng)用仍然存在一些疑問。 例如miRNA 通?？梢酝瑫r調(diào)節(jié)許多下游靶基因，然而不同靶基因之間的相互作用是否可以影響治療效果知之甚少。 同時由于這種生物特性，外泌體miRNA 的治療方法是否還存在副作用也需要在未來動物實驗和臨床試驗中留意。