病證結(jié)合COPD 動(dòng)物模型研究進(jìn)展

把得婷郝彬彬李 娟

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000）

慢性阻塞性肺疾?。?chronic obstructive pulmonary disease，COPD），簡(jiǎn)稱慢阻肺，是一種常見的可防可治的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征在于持續(xù)的呼吸系統(tǒng)炎癥和不可逆的氣流受限，通常是由于大量暴露于有毒顆?；驓怏w引起的［1］，具有患病率、致殘率、病死率均較高的特點(diǎn)［2］。 在我國(guó)，40 歲及以上人群患病率為13.7%，有近1 億COPD 患者，在成年人群中高度流行，位居我國(guó)居民死因第三位［3］，顯然已成為當(dāng)今社會(huì)一個(gè)重要的衛(wèi)生問題。西醫(yī)常規(guī)治療包括控制性氧療、口服支氣管擴(kuò)張劑、霧化吸入激素、注射抗炎藥物等，雖在一定程度上可以緩解癥狀，但依舊具有耐藥性及諸多不良反應(yīng)［4－6］。 中醫(yī)藥在COPD 的綜合治療中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，在抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性細(xì)胞因子釋放［7］、抑制氣道粘液高分泌及有效改善病理?yè)p害［8－9］、提高患者肺功能及生活質(zhì)量［10］等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。 為了更好地發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療COPD 的潛在靶點(diǎn)和闡述其治療機(jī)理，制備病證結(jié)合的動(dòng)物模型必不可少，其可以輔助我們準(zhǔn)確模擬COPD 的病理生理狀態(tài)及證候特征，為辨證施治奠定基礎(chǔ)，推動(dòng)中醫(yī)藥治療疾病的發(fā)展。

1 中醫(yī)病因病機(jī)

COPD 在中醫(yī)學(xué)中并沒有與之相對(duì)應(yīng)的確切病名，根據(jù)患者臨床表現(xiàn)，多將其歸屬于“肺脹”“哮病”“喘病”“咳嗽”等范疇，穩(wěn)定期表現(xiàn)類似“咳嗽”，急性加重期多屬“肺脹”［11］。 關(guān)于“肺脹”論述，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有提及，《靈樞·脹論》云“夫脹者，皆在于藏府之外，排藏府而郭胸脅、脹皮膚，故命曰：‘脹’”，這里首次提出“脹”?。?2］。 后代醫(yī)家也多有補(bǔ)充與發(fā)展，《金匱要略》言，“咳而上氣，此為肺脹，其人喘，目如脫狀”詳細(xì)描述其癥狀，《丹溪心法》又言“肺脹而咳，或左或右不得眠，此痰夾瘀血礙氣而病”，提出痰、瘀與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病發(fā)生多因病久肺虛、年老體弱，外加感受六淫侵襲而引起，病機(jī)為肺體、肺氣損傷，痰瘀阻滯，肺管氣道不利，張縮無(wú)力，嗽則氣還肺間，加之外邪侵襲而觸動(dòng)伏邪，致使疾病發(fā)生［13］。

2 COPD 動(dòng)物模型

臨床上，COPD 因其高發(fā)病率一直成為研究熱點(diǎn)，經(jīng)過長(zhǎng)期探索與實(shí)踐，造模技術(shù)已漸趨完善，研究者在復(fù)制COPD 疾病模型時(shí)選用單因素誘導(dǎo)或復(fù)合因素誘導(dǎo)，常見的單因素誘導(dǎo)包括煙霧暴露（ cigarette smoke， CS ）［14］、 氣 管 脂 多 糖（lipopolysaccharides，LPS）滴注［15］、基因敲除［16］，復(fù)合因素誘導(dǎo)有CS ＋LPS［17］、CS 聯(lián)合病毒［18］等，以Wistar 大鼠、SD 大鼠、C57BL／6 小鼠等為造模對(duì)象，將動(dòng)物肺組織形態(tài)（肺泡、支氣管、肺間質(zhì)），肺組織病理評(píng)分（肺組織損傷程度、氣道炎癥評(píng)分、氣道黏液分泌評(píng)分），肺組織定量分析（肺泡損傷程度、氣道重塑程度、血管重構(gòu)程度）作為評(píng)判依據(jù)，去驗(yàn)證造模是否成功［19］。

3 COPD 病證結(jié)合動(dòng)物模型

“病證結(jié)合”動(dòng)物模型是指在中醫(yī)藥理論、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)知識(shí)的有機(jī)結(jié)合下，模擬出的與人類疾病表現(xiàn)和證候特征相同或相似的實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物［20］。 病證結(jié)合造模的原理為先根據(jù)西醫(yī)理論復(fù)制目標(biāo)疾病模型，如慢性支氣管炎、哮喘等，后在該疾病模型基礎(chǔ)上，根據(jù)中醫(yī)證候概念復(fù)制出證候模型，兩者結(jié)合起來使西醫(yī)的疾病中呈現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的中醫(yī)證型，體現(xiàn)了臨床辨病與辨證的結(jié)合，是當(dāng)前用于研究中醫(yī)藥治療疾病的理想模型［21－22］。在COPD 病證結(jié)合動(dòng)物模型中，實(shí)驗(yàn)者多采用“先病后證”的造模方式，先以“CS＋LPS”的方法復(fù)制出COPD 動(dòng)物模型，使模型具備與COPD 相關(guān)的病理表現(xiàn)，進(jìn)一步根據(jù)中醫(yī)病因病機(jī)去模擬證候特征，換而言之，在西醫(yī)病理?yè)p害的基礎(chǔ)上疊加中醫(yī)病因刺激，最后制備出COPD 病證結(jié)合模型，合格且穩(wěn)定的病證結(jié)合模型，能夠更好地為中醫(yī)藥治療慢阻肺提供模型支撐。

3.1 肺氣虛證動(dòng)物模型

李瑞祥等［23］采用復(fù)合因素造模，總計(jì)28 d：在第1 天、第14 天氣管滴注LPS（1 mg／mL），其余時(shí)間每天對(duì)其煙熏30 min，煙熏結(jié)束后再次將其置于冷空氣刺激1 h，以此建立肺氣虛證COPD 大鼠模型，并利用此模型驗(yàn)證了利金方通過升高肺組織免疫細(xì)胞的水平來改善肺氣虛證COPD 的癥狀。

沈俊希等［24］于造模第1 天、第14 天氣管注射200 μL LPS 溶液（濃度：1 g／L），第2 ～23 天（除第14 天）點(diǎn)燃7.11 g 煙絲和50 g 鋸末煙熏，每天1次，每次30 min，第24～30 天將煙熏頻次改為每天3次，每次30 min，造模時(shí)常為30 d，并以補(bǔ)肺湯的治療效果去判定模型的有效性。

肺為華蓋，主氣而司呼吸，主一身之表，外邪侵襲首先犯肺，病久而肺氣必虛，因此肺氣虛證是COPD 中最常見的證型。 臨床以咳喘反復(fù)發(fā)作、咳痰清稀，咳聲微弱、語(yǔ)聲低怯，面色淡白、自汗惡風(fēng)，舌淡苔白脈弱為肺氣虛常見癥狀［25］，治以補(bǔ)肺益氣平喘。 該模型主要通過“CS ＋LPS”的方法來復(fù)制（表1），個(gè)別造模方法略有變動(dòng)，但差異不大，在該證型造模的后期通過加大肺部的煙霧暴露次數(shù)或進(jìn)行冷刺激，對(duì)肺造成損傷，一定程度上模擬肺氣的損傷，使模型具備一定的合理性，但在模型評(píng)價(jià)方面尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

表1 常見病證結(jié)合動(dòng)物模型總結(jié)Table 1 Summarization of disease-syndrome combination animal models

3.2 肺脾兩虛證動(dòng)物模型

張旭輝等［26］在造模第1 天、第14 天氣管滴注LPS，第2 ～42 天進(jìn)行煙霧暴露，每天2 次，每次30 min（滴注LPS 當(dāng)天不煙熏），同時(shí)自造模第7 天起在熏煙前30 min 給予濃度為1 g／mL 的冰冷番瀉葉浸液，連續(xù)灌胃至第42 天，利用苦寒藥損傷脾胃的機(jī)理建立脾虛證慢阻肺動(dòng)物模型，研究者使用該動(dòng)物模型觀察到ghrelin 及obestatin 與炎癥因子的相互作用在COPD 合并營(yíng)養(yǎng)不良中起重要作用。

何嘉等［27］于造模第1 天、第14 天氣管滴注0.2 mL LPS，第2～28 天（氣管滴注LPS 日除外）對(duì)其進(jìn)行煙熏，1 h／d；同時(shí)以“二次造?！钡姆绞皆谠炷ｉ_始后第7 天以大黃混懸液灌胃，2 mL／d，共8 d，第28 天成功制備COPD 肺脾兩虛證模型，并使用該模型驗(yàn)證了健脾益肺口服液可提高COPD 患者的免疫功能。

肺氣虛證為慢阻肺主要證型，肺虛日久，子盜母氣，脾失健運(yùn)，同時(shí)母病及子，又進(jìn)一步加重肺臟的失常，二者相互影響，終成肺脾兩虛之證，該證型也主要集中出現(xiàn)在COPD 穩(wěn)定期，主要表現(xiàn)為咳嗽喘息氣短，動(dòng)則加重，或神疲乏力易感冒，或食少納呆便溏，舌體胖大舌苔膩，脈沉細(xì)或細(xì)弱，治療以益氣健脾為主［35］。 此類模型先進(jìn)行COPD 的復(fù)合造模，后期以苦寒藥物煎劑灌胃處理模擬中醫(yī)證候（表1），體現(xiàn)了疾病發(fā)展過程中的動(dòng)態(tài)變化，番瀉葉、大黃苦寒攻下，藥效峻猛，易傷脾陽(yáng)，母病及子，因此可致肺臟失養(yǎng)，較為符合肺脾兩虛證產(chǎn)生的機(jī)理。

3.3 痰熱郁肺證動(dòng)物模型

金朝暉等［28］點(diǎn)燃50 g 煙葉、10 g 硫磺對(duì)其煙霧暴露，每次30 min，每天2 次，兩次間隔4 h 以上，隨后鼻腔滴入0.1 mL 肺炎雙球菌菌液（濃度：6×108CFU／mL，最后兩次濃度：18×108CFU／mL），每周2次，共計(jì)滴8 次，造模28 d 結(jié)束，成功制備COPD 痰熱郁肺證模型，作者借此模型證實(shí)了清金暢肺飲對(duì)COPD 氣道炎癥具有抑制作用［36］。

許光蘭等［29］在實(shí)驗(yàn)第1 天、第14 天經(jīng)氣管滴注LPS（濃度：1 g／L）200 μL，第2 ～30 天（除第14天）進(jìn)行煙霧暴露，早晚各30 min，首先制備COPD疾病模型。 在此基礎(chǔ)上，于造模第26 天氣管多滴注LPS 1 次，以此模擬痰熱郁肺證型，使“病”“證”相結(jié)合，并設(shè)置清金化痰顆粒治療作為對(duì)照組，以方測(cè)證，結(jié)果對(duì)照組大鼠病理改變有所好轉(zhuǎn)，模型制備成功。

陳錦標(biāo)等［30］在實(shí)驗(yàn)第1、8、15 天氣道滴入200 μL LPS 溶液（濃度：1 mg／mL），第2～28 天煙霧暴露（LPS 滴注當(dāng)日除外），每次30 min，上、下午各一次。 后在第29 ～37 天將其置于風(fēng)箱中（溫度（39±1）℃，風(fēng)速0.7 m／s，相對(duì)濕度50%）進(jìn)行風(fēng)熱刺激，依舊每次30 min，每天2 次，造模時(shí)長(zhǎng)37 d，成功制備COPD 痰熱郁肺證模型。

該證型多出現(xiàn)在急性加重期，肺失宣肅，津液失于布散而聚集體內(nèi)，日久積熱化痰，或感受風(fēng)熱之邪侵襲，灼傷津液，煉液成痰，痰熱壅結(jié)于肺而發(fā)?。?7－38］。 咳嗽喘息，發(fā)熱痰黃，口渴喜飲，舌紅苔黃為痰熱蘊(yùn)肺證常見癥狀［25］，治以清熱化痰。 在痰熱郁肺證模型中，研究者在造模后期多將動(dòng)物置于人為制造的風(fēng)熱環(huán)境中進(jìn)行刺激（表1），以此模擬風(fēng)熱侵襲，從而使動(dòng)物產(chǎn)生與風(fēng)熱證相似的癥狀，值得借鑒。

3.4 痰瘀阻肺證動(dòng)物模型

朱張求等［31］將大鼠放入水槽中（恒溫：43±1℃）強(qiáng)迫游泳30 min，后進(jìn)行煙霧暴露，每天1 次，每次0.4 h，最后將其置于通入氮?dú)獾牡脱跸鋬?nèi)（氧濃度：10.0%±0.5%，CO2濃度：0.03%），每天低氧7 h，連續(xù)造模1 個(gè)月，由此成功建立COPD 痰瘀阻肺證模型。 作者基于此模型明確了芪白平肺膠囊通過降低炎癥因子表達(dá)來改善肺血管重塑及炎癥［39］。

石孟瑤等［32］將大鼠置于煙箱內(nèi)，1 h／d，隨后將其置于低氧裝置內(nèi)（氧濃度：10.0%～10.5%，CO2濃度：0.03%左右），每天低氧5 h，每周6 d，連續(xù)造模4 周，成功復(fù)制出目標(biāo)模型。

肺氣虧虛，津液不布，聚為痰濁；氣與血相互依存相互為用，氣為血之帥，氣能行血，亦能攝血，氣虛無(wú)力助血運(yùn)行，則血留成瘀，痰瘀共為病理因素，二者相互影響，終成氣虛痰瘀之證。 臨床以咳嗽咳痰氣短，神疲乏力自汗，口唇發(fā)紺，舌質(zhì)淡暗，脈沉細(xì)或澀為主要表現(xiàn)，治以補(bǔ)肺益氣、化瘀祛痰［40］。研究者多采用復(fù)合因素造模（表1），強(qiáng)迫大鼠在水中游泳，使其勞累損傷肺氣，正是利用了“氣虛則無(wú)力助血運(yùn)行”這一理念，模型動(dòng)物癥狀表現(xiàn)穩(wěn)定，造模時(shí)間短，周期基本一致，均為1 個(gè)月左右。

3.5 寒飲證動(dòng)物模型

周健美［33］在造模第1、14、28 天氣管滴注200 μL LPS，第2～56 天（第14、28 天除外）進(jìn)行煙霧暴露，每天2 次，每次30 min，兩次間隔4 h 左右。 后在低溫環(huán)境下（溫度：0℃左右）冷凍，1 h／d，同時(shí)將其置于冷水游泳，持續(xù)4 周，伴隨冰水混合物喂養(yǎng)，總計(jì)56 d，復(fù)制出目標(biāo)模型。

楊淑等［34］以藥測(cè)證，選用生姜為治療藥物，在第1、14 天鼻腔滴注200 μL 脂多糖（濃度：1 mg／mL），第2 ～30 天（第14 天除外）進(jìn)行煙熏，每天2次，每次30 min，每次間隔4 h，隨后置于低溫環(huán)境中（溫度：0℃左右）刺激1 h，同時(shí)以冰水混合物喂養(yǎng)，12 h／d，持續(xù)30 d。 生姜具有解表散寒、溫中止嘔之藥效，實(shí)驗(yàn)中給予生姜治療后大鼠寒癥明顯減輕，加之造模完成后動(dòng)物表現(xiàn)出明顯寒象，表明寒飲蘊(yùn)肺模型造模成功。

在寒飲證模型中，研究者遵循中醫(yī)“苦寒傷陽(yáng)”的理論，以冰水灌胃?jìng)捌㈥?yáng)，使得脾胃運(yùn)化水飲功能失職，加之感受寒邪，內(nèi)克于肺，肺主通調(diào)水道功能紊亂，造成水液內(nèi)停，終成寒飲內(nèi)停之證，以“飲冷＋寒冷刺激”的方式（表1）復(fù)制寒飲蘊(yùn)肺中醫(yī)證型，共建COPD 寒飲蘊(yùn)肺證大鼠模型。

4 討論

病證結(jié)合的治療方法既能對(duì)某種疾病有宏觀上的把握，又可以了解疾病某一階段或某一類型的具體本質(zhì)，做到辨病為先，辨證為主，二者有機(jī)結(jié)合，從宏觀和微觀兩個(gè)層次去認(rèn)識(shí)疾病，從而進(jìn)行有效治療，具有事半功倍的效果。 總結(jié)發(fā)現(xiàn)，不同類型的COPD 病證結(jié)合動(dòng)物模型均具有造模周期適中（大部分為28 d），可操作性強(qiáng)以及花費(fèi)成本低的特點(diǎn)，可以作為用于研究中醫(yī)藥治療COPD 的模型基礎(chǔ)，同時(shí)研究者多選用大鼠為造模對(duì)象，因其具有繁殖周期短、飼養(yǎng)方便易成活等優(yōu)點(diǎn)。 驗(yàn)證目標(biāo)模型是否成功時(shí)，研究者將動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)與病理形態(tài)改變相結(jié)合，同時(shí)會(huì)輔助一些相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，如炎癥因子等，綜合去判定，使動(dòng)物模型更具說服力。

4.1 存在問題

病證結(jié)合動(dòng)物模型雖在一定程度上可以模擬目標(biāo)疾病及中醫(yī)證候，展示干預(yù)手段對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的影響，支持中醫(yī)藥防治疾病的研究進(jìn)展。 但依舊存在以下問題：（1）所選動(dòng)物種類及品系不統(tǒng)一，由于它們存在個(gè)體差異性，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不一致；（2）在此類造模方式下，對(duì)動(dòng)物模型證候的評(píng)價(jià)多依賴實(shí)驗(yàn)者的主觀判斷，并沒有明確規(guī)范的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，制定科學(xué)的模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依舊是COPD 病證結(jié)合模型領(lǐng)域的難點(diǎn)；（3）眾所周知，中醫(yī)認(rèn)識(shí)疾病講求整體觀念，某種疾病或證型的形成并不是通過單純的一種外在干預(yù)方式就可以蹴就的，同時(shí)在疾病發(fā)展過程中，伴隨諸多并發(fā)癥，研究人員單純以一種致病因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)會(huì)使模型具有片面性，另一方面，疾病與證候同時(shí)存在，實(shí)驗(yàn)者以“先病后證”的造模方式割裂了二者原先相輔相成的關(guān)系；（4）關(guān)于病證結(jié)合COPD 動(dòng)物模型的研究及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量較少，供研究人員參考的方法較為缺乏；（5）中醫(yī)辨證注重四診合參，重視對(duì)舌象和脈象的觀察與鑒別，由于采集動(dòng)物的舌象、脈象比較困難且不能將動(dòng)物與人體的生理表現(xiàn)混為一談，因此在目前所報(bào)道的諸多文獻(xiàn)中，均缺乏描述；（6）COPD 患者以中老年男性為主要患病人群，但大多數(shù)研究者在選用模型動(dòng)物時(shí)經(jīng)常忽略動(dòng)物性別及年齡這一細(xì)節(jié)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。

4.2 發(fā)展思路

病證結(jié)合動(dòng)物模型是將實(shí)驗(yàn)研究與臨床治療相銜接的橋梁，復(fù)制一個(gè)恰當(dāng)準(zhǔn)確、切合臨床的病證結(jié)合動(dòng)物模型，對(duì)開發(fā)新型制劑及研究量效關(guān)系具有極高價(jià)值，但目前病證結(jié)合動(dòng)物模型的建立依舊處于探索階段，針對(duì)在造模過程中存在的諸多問題，研究者需統(tǒng)一動(dòng)物品系與年齡性別，完善證候評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，利用好現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)手段，探尋規(guī)范采集動(dòng)物四診信息的技術(shù)，從諸多方面去規(guī)避造模過程中的不足，從而建立一個(gè)符合中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制的高質(zhì)量動(dòng)物模型，推動(dòng)中醫(yī)藥防治疾病的發(fā)展，為人類的健康做出貢獻(xiàn)。