基于高通量測(cè)序分析不同地區(qū)魔芋根際土壤細(xì)菌群落多樣性

雷 高，李珊珊，李亮亮，王佰濤，楊文玲，劉德海*

（1.河南省科學(xué)院生物研究所，河南 鄭州 450008；2.河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450008）

魔芋（Amorphophallus konjac）為天南星科（Araceae）魔芋屬（AmorphophallusB1.ex Decne.）多年生草本植物的塊莖，是目前自然界唯一能大量提供葡甘聚糖的重要經(jīng)濟(jì)作物[1]。葡甘聚糖是一種高分子優(yōu)質(zhì)膳食纖維，具有凝膠性、增稠性、持水性和成膜性等獨(dú)特的性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品和化工等領(lǐng)域[2-3]。雖然葡甘聚糖得到了廣泛的應(yīng)用，但由于其相對(duì)分子質(zhì)量較大、黏度大，因此在食品工業(yè)的應(yīng)用上受到了限制[4]。因此將魔芋中的大分子降解為小分子，即魔芋低聚糖，不僅可以大大降低其黏度，還可以提高其在食品中的應(yīng)用范圍[5]。據(jù)報(bào)道，魔芋低聚糖具有促進(jìn)有益微生物特別是耐氧雙歧桿菌生長(zhǎng)[6-7]、提高機(jī)體抗氧化能力[8]、降血脂及護(hù)肝作用[9-10]、排毒與增強(qiáng)免疫功能的作用[11]。

魔芋低聚糖是一系列葡甘露低聚糖的混合物，是由β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖中的β-1,4-D-甘露糖苷鍵得到的產(chǎn)物[12]。β-甘露聚糖酶的活性決定了魔芋低聚糖的水解程度[13]。目前，β-甘露聚糖酶主要來源于微生物[14-15]，細(xì)菌來源的常見于芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）及產(chǎn)酸細(xì)菌等[16-18]。雖然β-甘露聚糖酶來源廣泛、數(shù)量眾多，但由于飼料固體發(fā)酵中發(fā)酵溫度不易控制和底物復(fù)雜性的影響，β-甘露聚糖酶的應(yīng)用受到了限制[19-20]。因此，獲得底物利用廣泛，溫度適應(yīng)區(qū)間大，活性高的β-甘露聚糖酶是解決飼料發(fā)酵中的重點(diǎn)[21-22]。本實(shí)驗(yàn)擬以昆明、寧德和南陽(yáng)的多年種植魔芋區(qū)域的根際土壤為研究對(duì)象，通過Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3地區(qū)魔芋根際土壤中細(xì)菌種類和群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析，旨在獲得魔芋根際土壤中更加準(zhǔn)確、全面的細(xì)菌多樣性信息，為后續(xù)β-甘露聚糖酶的篩選及開發(fā)利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

魔芋根際土壤：分別采自云南昆明、福建寧德、河南南陽(yáng)。

1.1.2 化學(xué)試劑

E.Z.N.A.RSoil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit：美國(guó)Omega Bio-Tek公司；瓊脂糖：西班牙Biowest公司；FastPfu 聚合酶：北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit：美國(guó)Axygen公司；NEXTFLEXRRapid DNA-Seq Kit：美國(guó)Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3：美國(guó)llumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N13462C移液器、5430R小型離心機(jī)、5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BioTek ELx800酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；QuantiFluorTM-ST微型熒光計(jì)：美國(guó)Promega公司；ABI GeneAmpR9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；Illumina Miseq測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

試驗(yàn)樣品采自云南昆明、福建寧德、河南南陽(yáng)的魔芋根際土壤，分別編號(hào)為ND（種植時(shí)間3年，海拔1 992 m，東經(jīng)118°88′，北緯27°08′）、KM（種植時(shí)間1年，海拔996 m，東經(jīng)103°47′、北緯25°40′）、NY（種植時(shí)間半年，海拔949 m，東經(jīng)111°15′，北緯33°38′）。采用隨機(jī)取樣法，在魔芋種植區(qū)域隨機(jī)選取3個(gè)樣方（1 m×1 m），每個(gè)樣方中隨機(jī)選取3個(gè)魔芋植株。取樣時(shí)鏟去表層土壤（0～5 cm），取5～20 cm附著于魔芋根際及塊莖上的土壤裝入無菌自封袋后充分混勻，將3個(gè)取樣點(diǎn)采集的土壤混合為一個(gè)樣品。每個(gè)取樣地點(diǎn)采集樣品3個(gè)，-20 ℃保存，備用。

1.3.2 樣品總DNA提取和PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

采用磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA，使用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序。選擇細(xì)菌16S rRNA通用引物338F和806R對(duì)細(xì)菌16S rRNA序列的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR擴(kuò)增體系：4 μL 5×FastPfu Buffer，0.4 μL FastPfu聚合酶，0.2 μL 牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），上下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，2 μL 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）（2.5 mmol/L），1 μL DNA模板（10 ng/μL），雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)合格，純化后構(gòu)建PE文庫(kù)，使用Illumina公司的Miseq臺(tái)式測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控后，采用Flash軟件進(jìn)行拼接。過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接（merge）成一條序列。結(jié)合序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，調(diào)整序列的方向，得到有效序列。使用Uchime軟件對(duì)拼接好的序列剔除嵌合體，采用Uparse軟件按照97%的相似度對(duì)有效序列聚成不同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。通過Mothur和Qiime軟件計(jì)算不同地區(qū)魔芋根際土壤中細(xì)菌基于OTU分類水平的生物多樣性指數(shù)，主要包括Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)，用以探索不同地區(qū)魔芋根際土壤樣本間細(xì)菌群落組成的相似性和差異性。

1.3.4 魔芋根際土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

魔芋根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀、堿解氮：參照《土壤農(nóng)化分析》中的方法測(cè)定[23]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理采用Excel 2016，顯著性差異分析采用SPSS 20.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)魔芋根際土壤理化性質(zhì)分析

昆明（KM）、寧德（ND）和南陽(yáng)（NY）魔芋根際土壤樣品的pH、有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀和堿解氮含量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 不同地區(qū)魔芋根際土壤理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of konjac rhizosphere soil samples from different regions

由表1可知，寧德（ND）魔芋根際土壤的pH、有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效鉀顯著高于昆明（KM）和南陽(yáng)（NY）（P＜0.05）；堿解氮指標(biāo)寧德（ND）與昆明（KM）、南陽(yáng)（NY）差異顯著（P＜0.05），南陽(yáng)（NY）與昆明（KM）差異不顯著（P＞0.05）。表明不同地區(qū)魔芋根際土壤的理化性質(zhì)存在明顯的差異。

2.2 不同地區(qū)魔芋根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

基于OTU分類水平，對(duì)3處魔芋根際土壤樣品進(jìn)行多樣性指數(shù)分析。通過對(duì)KM、ND、NY 3處魔芋根際土壤樣品中細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果見表2。

表2 不同地區(qū)魔芋根際土壤樣品中細(xì)菌菌群多樣性分析結(jié)果Table 2 Analysis results of bacterial community diversity of konjac rhizosphere soil samples from different regions

由表2可知，KM、ND、NY樣品得到有效序列數(shù)分別為123 365、129 763、130 598。在97%相似度水平下劃分OTU，3處樣品共得到8 156個(gè)OTU。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)常用來表述群落豐富度，其數(shù)值越大表明群落物種豐富度越高。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用來表述群落多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，表明群落物種的多樣性越高。由表2可知，ND樣品的Chao1指數(shù)（1292.35）、Ace指數(shù)（1296.47）均顯著高于KM和NY（P＜0.05），說明其土壤中細(xì)菌群落物種豐富度最高；ND樣品的Shannon指數(shù)（5.89）顯著高于KM和NY（P＜0.05），Simpson指數(shù)（0.006 7）顯著低于KM（P＜0.05），表明其土壤中細(xì)菌群落多樣性最高。

選取OTU序列，繪制Venn圖見圖1。

圖1 不同地區(qū)魔芋根際土壤樣品中細(xì)菌OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacterial OTU of konjac rhizosphere soil samples from different regions

由圖1可知，KM、ND、NY 3處地點(diǎn)的土壤樣品共有的OTU數(shù)量為1355個(gè)，特有的OTU數(shù)量分別為442、692、447個(gè)，其余OTU為不同地區(qū)間共有。3處地點(diǎn)的土壤樣品測(cè)序的覆蓋率均＞99%，表明試驗(yàn)的取樣合理，測(cè)序數(shù)據(jù)較好，能真實(shí)反映樣本的實(shí)際情況，可進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

基于土壤樣品中細(xì)菌的OTU得到Sobs稀釋曲線見圖2。由圖2可知，隨著抽樣數(shù)的增加，3處地點(diǎn)的土壤樣品9個(gè)土壤樣品的Sobs指數(shù)沒有趨于平緩，表明繼續(xù)加大測(cè)序量可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多OTU。

圖2 不同地區(qū)魔芋根際土壤樣品Sobs稀釋曲線Fig.2 Sobs rarefaction curves of konjac rhizosphere soil samples from different regions

Shannon-Wiener曲線是反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測(cè)序量在不同深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣品在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。當(dāng)曲線趨向平緩時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以準(zhǔn)確反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。以KM、ND和NY 3處地點(diǎn)的9個(gè)土壤樣品的香農(nóng)指數(shù)和序列數(shù)繪制Shannon-Wiener曲線見圖3。由圖3可知，隨著測(cè)序序列數(shù)的增加，3處地點(diǎn)的9個(gè)土壤樣品的香農(nóng)指數(shù)趨于平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以準(zhǔn)確反映樣品中微生物群落的多樣性。

圖3 不同地區(qū)魔芋根際土壤樣品Shannon-Wiener曲線Fig.3 Shannon-Wiener curves of konjac rhizosphere soil samples from different regions

2.3 屬水平上不同地區(qū)魔芋根際土壤細(xì)菌的種類和相對(duì)豐度分析

在屬水平上，基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同地區(qū)的魔芋根際土壤中細(xì)菌的種類和相對(duì)豐度進(jìn)行分析。根據(jù)相對(duì)豐度將樣本中的菌屬分為優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度≥1.0%）和次要菌屬（相對(duì)豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類于其他（others），結(jié)果見圖4。

圖4 基于屬水平KM（a）、ND（b）及NY（c）魔芋根際土壤樣品中細(xì)菌種類及相對(duì)豐度Fig.4 Species and relative abundance of bacteria in KM (a), ND (b) and NY(c)konjac rhizosphere soil samples based on genus level

由圖4a可知，KM樣本中優(yōu)勢(shì)菌屬有12個(gè)，其中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）相對(duì)豐度最高，為4.06%；其次為大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium），相對(duì)豐度為3.64%；其余依次為鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）（3.20%）、黃色桿菌屬（Xanthobacter）（2.12%）、放線菌屬（Gaiellales）（1.82%）、鏈霉菌屬（Streptomyces）（1.79%）、Vicinamibacterales（1.52%）、芽球菌屬（Blastococcus）（1.39%）、熱酸菌屬（Acidothermus）（1.15%）、地桿菌屬（Terrabacter）（1.15%）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）（1.03%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）（1.01%）。

由圖4b可知，ND樣本中優(yōu)勢(shì)菌屬有7個(gè)，節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）相對(duì)豐度最高，為3.49%；其余依次為Vicinamibacterales（2.12%）、放線菌屬（Gaiellales）（1.72%）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）（1.71%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）（1.31%）、微桿菌屬（Microbacterium）（1.14%）、地桿菌屬（Terrabacter）（1.07%）。

由圖4c可知，NY樣本中優(yōu)勢(shì)菌屬有7個(gè)，其中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）相對(duì)豐度最高，為4.59%；其余依次為Vicinamibacterales（4.01%）、大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（2.53%）、鏈霉菌屬（Streptomyces）（1.40%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（1.38%）、黃色桿菌屬（Xanthobacter）（1.37%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）（1.02%）。

對(duì)比昆明（KM）、寧德（ND）、南陽(yáng)（NY）3個(gè)地區(qū)魔芋根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬的種類，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)之間存在種類上的差異。節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、Vicinamibacterales、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）為3個(gè)地區(qū)所共有，熱酸菌屬（Acidothermus）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）為昆明樣品獨(dú)有；微桿菌屬（Microbacterium）為寧德樣品特有；芽孢桿菌屬（Bacillus）則只在南陽(yáng)樣品中發(fā)現(xiàn)。表明不同地區(qū)魔芋根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬種類存在差異，這與彭玉嬌等[24]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)昆明、寧德和南陽(yáng)魔芋根際土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)分析比較，結(jié)果表明，昆明、寧德和南陽(yáng)地區(qū)魔芋根際土壤的細(xì)菌豐富度和物種多樣性存在顯著性差異（P＜0.05），其中昆明樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬有12個(gè)，熱酸菌屬（Acidothermus）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）為獨(dú)有；寧德樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬有7個(gè)，微桿菌屬（Microbacterium）為其特有；南陽(yáng)樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬有8個(gè)，芽孢桿菌屬（Bacillus）為其獨(dú)有。