產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚菌株的篩選、鑒定及其在醬油釀造中的應(yīng)用

張穎超，于 鑫，趙祥穎，*，劉麗萍，黃艷紅，張家祥，劉建軍

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東 濟南 250013；2.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；3.山東玉兔食品股份有限公司，山東 淄博 255300）

醬油是一種傳統(tǒng)調(diào)味品，在中國、韓國和日本廣受歡迎[1]。目前，高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝仍是我國醬油釀造的主要方法，其主要的工藝特征是在較高鹽濃度（20%）下進行控溫或非控溫發(fā)酵2～6個月[2]。醬油發(fā)酵機理是一個錯綜復雜的生物化學反應(yīng)過程，發(fā)酵過程中環(huán)境中的微生物，如芽孢桿菌（Bacillus）、酵母菌和乳酸菌等，會產(chǎn)生許多特征性風味化合物[3]。

目前，從醬油中發(fā)現(xiàn)的特征性風味化合物主要有4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮、苯乙醛、3-甲硫基丙醇、吡嗪類化合物等[4-6]。其中，4-EG是一種揮發(fā)性酚類化合物，呈發(fā)酵香氣，具有煙熏味、丁香味和辛香味，屬醬香型香氣，其作為醬油關(guān)鍵風味成分，具有緩和咸味作用[7-8]。此外，4-EG可以對抗人體異常氧化應(yīng)激，具有保護細胞和抑制炎癥免疫反應(yīng)的作用[9-10]。4-EG風味閾值極低，0.5 mg/L的質(zhì)量濃度就能被感官識別，1～2 mg/L的質(zhì)量濃度便可明顯改善醬油的風味品質(zhì)[11]。目前，報道能夠產(chǎn)4-EG的微生物菌株比較少，大部分菌株是以4-VG為前體合成4-EG，然而能直接利用阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）合成4-EG的微生物卻鮮有報道[12-13]。

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法結(jié)合耐鹽性及4-EG生產(chǎn)能力測定，從廣式高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵醬醪中分離篩選能代謝FA合成4-EG的微生物，通過形態(tài)觀察、分子生物學技術(shù)對分離菌株進行鑒定，同時對其生長特性進行研究，并將其應(yīng)用于醬油生產(chǎn)，為改善提升醬油品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株豆粕、炒麥、麥麩、米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042的孢子粉、生醬油、醬醪：山東玉兔食品股份有限公司。

1.1.2 試劑

食鹽（未加碘）：濟南家家悅購物超市；大豆蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；酵母浸出物（生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖（分析純）：山東西王糖業(yè)有限公司；FA、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-VG）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-EG）（均為色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

麥芽汁培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

分離培養(yǎng)基[14]：30%生醬油，20%麥芽汁，15%MRS肉湯，2%瓊脂，10%氯化鈉，0.01%氯霉素，pH為7.1。

LB液體培養(yǎng)基[15]：1%大豆蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母浸粉。固體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加0.01%FA。

高鹽LB培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基中添加10%氯化鈉。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

7200分光光度計：上海尤尼科儀器有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀：山東科學院生物研究所；PB-10 pH計：德國賽多利斯集團；Diane Utimate3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、U3000紫外檢測器、ProFlexTM96孔聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技有限公司；FlavourSpecR風味分析儀：山東海能科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

在無菌條件下將醬醪用10%的鹽水稀釋1倍制成懸浮液，再用10%的鹽水進行梯度稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑取單菌落接種于高鹽LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，經(jīng)多次分離純化得到單菌落。

1.3.2 高產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚菌株的篩選

將分離純化的菌株接種于篩選培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中的4-EG含量，篩選4-EG產(chǎn)量高的菌株。

1.3.3 篩選菌株的鑒定

形態(tài)觀察：挑取篩選菌株的單菌落接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄培養(yǎng)基上菌落的質(zhì)地和形態(tài)等特征，用接種環(huán)挑取典型菌落進行鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

分子生物學鑒定：將純化的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心棄去上清液，采用0.9%生理鹽水洗滌菌體，將菌體送到青島生物工程有限公司進行測序。將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basiclocalalignmentsearch tool，BLAST）序列同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA 11.0中的鄰接（neigh bor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次bootstraps檢驗計算支持率。

1.3.4 篩選菌株生長性能測試

培養(yǎng)溫度的影響：將純化的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h制備種子液，按照5%（V/V）的接種量將種子液接種到LB液體培養(yǎng)基中，在不同的培養(yǎng)溫度（37 ℃、45 ℃、52 ℃）條件下靜置培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液菌體濃度（OD600nm值），根據(jù)菌體濃度確定菌株的最佳生長溫度。

轉(zhuǎn)速的影響：按照5%（V/V）的接種量將種子液接種到LB液體培養(yǎng)基中，在最佳生長溫度條件下，在不同轉(zhuǎn)速（0、40 r/min、80 r/min、120 r/min、160 r/min）條件下培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液菌體濃度（OD600nm值），確定最佳轉(zhuǎn)速。

鹽含量的影響：按照5%（V/V）的接種量將種子液接種到不同鹽含量（0、5%、10%、15%、20%）的LB液體培養(yǎng)基中，在最適條件下培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液菌體濃度（OD600nm值），考查菌株的耐鹽性。

1.3.5 高鹽含量下篩選菌株轉(zhuǎn)化FA進程

將種子液按5%（V/V）的接種量接種至鹽含量為20%的LB液體培養(yǎng)基中，其中添加初始質(zhì)量濃度為100 mg/L的FA。在45 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)5 d、10 d、15 d時取樣，測定發(fā)酵液中的FA、4-VG、4-EG含量。

1.3.6 篩選菌株在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用

采用高鹽稀態(tài)法釀造醬油[16]。將純化的單菌落接種到鹽含量為5%的LB液體培養(yǎng)基中，45 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，待菌液濃度達2×108CFU/mL時，停止培養(yǎng)。實驗組按5%（V/V）的接種量接種產(chǎn)4-EG菌株，對照組加入5%（V/V）的LB液體培養(yǎng)基，45 ℃發(fā)酵。發(fā)酵前5 d，每天攪拌一次，之后間隔5 d攪拌一次，取發(fā)酵0、5 d、10 d、15 d、30 d、60 d的樣品，測定醬油發(fā)酵液中FA、4-EG、氨基酸、有機酸和葡萄糖含量，選取發(fā)酵15 d和30 d的樣品測定揮發(fā)性風味物質(zhì)，并對發(fā)酵結(jié)束的醬油進行感官品評。

1.3.7 測定方法

菌體濃度的測定：將菌體培養(yǎng)液適當稀釋，采用UNICO 7200分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值。FA、4-VG、4-EG含量的測定：按照文獻[17]的HPLC法。氨基酸含量的測定：按照文獻[18]的HPLC法。有機酸和葡萄糖含量的測定：按照文獻[19]的HPLC法。揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定：按照文獻[20-21]的氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatographyion mobility spectrometry，GC-IMS）法。感官評價：選取7位受到系統(tǒng)培訓的品評員按照文獻[22-23]對滅菌的醬油發(fā)酵液的滋味和香氣進行盲評。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每個實驗均設(shè)置3次平行，實驗數(shù)據(jù)使用Origin2019和SPSS 26處理，實驗結(jié)果用“平均值±標準差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)4-EG菌株的分離篩選

將醬醪樣品進行多次稀釋涂布培養(yǎng)和劃線分離，根據(jù)菌落特征初步分離篩選獲得6株耐高鹽的菌株，編號為XJB-1、XJB-2、XJB-3、JLB30-1、JLB30-2、JLB30-3。6株菌株發(fā)酵液中的4-EG含量見表1。由表1可知，菌株JLB30-1、JLB30-2、JLB30-3可利用篩選培養(yǎng)基中的FA產(chǎn)生4-EG，且菌株JLB30-2產(chǎn)4-EG的能力最強，4-EG含量可達15.67mg/L。

表1 初篩菌株的4-EG產(chǎn)量測定結(jié)果Table 1 Determination result of 4-EG yield of the initial screening strain

2.2 菌株JLB30-2的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株JLB30-2在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌株JLB30-2的菌落形態(tài)（a）與細胞形態(tài)（b）Fig.1 Colony morphology (a) and cell morphology (b) of strain JLB30-2

由圖1可知，菌株JLB30-2的菌落白色不透明，形狀不規(guī)則，中央隆起，表面粗糙有皺褶，邊緣不規(guī)則，濕潤粘稠且易挑起；在顯微鏡下菌體呈長桿狀。

2.2.2 分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株JLB30-2的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株JLB30-2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于同一分支，綜合該菌株的形態(tài)特征，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株JLB30-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain JLB30-2 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 枯草芽孢桿菌JLB30-2的生長特性

2.3.1 培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌JLB30-2生長的影響

枯草芽孢桿菌JLB30-2在不同培養(yǎng)溫度條件下的生長情況見圖3。由圖3可知，B.subtilisJLB30-2在37～52 ℃條件下均能生長，且在45 ℃條件下OD600nm值最高。說明該菌株最佳生長溫度為45 ℃，適合高溫發(fā)酵。目前，醬油發(fā)酵工藝主要有兩大類：以高鹽稀態(tài)和低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝為代表的高溫發(fā)酵工藝，發(fā)酵的溫度在45 ℃左右；以日式醬油為代表的常溫發(fā)酵，發(fā)酵溫度在30 ℃左右[24-25]。B.subtilisJLB30-2的生長溫度與高溫發(fā)酵工藝相適應(yīng)，因此，可以作為產(chǎn)香菌株添加到醬油中發(fā)揮作用。

圖3 培養(yǎng)溫度對菌株JLB30-2生長的影響Fig.3 Effect of culture temperature on the growth of strain JLB30-2

2.3.2 轉(zhuǎn)速對菌株JLB30-2生長的影響

菌株JLB30-2在不同轉(zhuǎn)速條件下的生長情況見圖4。由圖4可知，菌體OD600nm值隨搖床轉(zhuǎn)速的升高呈上升趨勢，在低氧條件下，B.subtilisJLB30-2仍能較好生長，并且隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液菌體OD600nm值逐漸變大，靜置培養(yǎng)6 d時，發(fā)酵液的菌體OD600nm值可達12.93。表明B.subtilisJLB30-2能在溶氧較少的醬醪中生長，為其作為產(chǎn)香菌株添加到醬油中應(yīng)用提供了可能。

圖4 轉(zhuǎn)速對菌株JLB30-2生長的影響Fig.4 Effect of rotational speed on the growth of strain JLB30-2

2.3.3 鹽含量對枯草芽孢桿菌JLB30-2生長的影響

醬油釀造所需的高鹽濃度影響微生物的生長和繁殖，能在這種環(huán)境下生存的微生物必須具有一定的耐鹽特性。因此，對枯草芽孢桿菌JLB30-2的耐鹽性進行分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在相同培養(yǎng)條件下，隨著鹽含量的增加，B.subtilisJLB30-2的生長受到抑制，但隨著培養(yǎng)時間的延長，OD600nm值仍呈緩慢增加態(tài)勢，在20%的高鹽含量下B.subtilisJLB30-2仍能緩慢生長。由此可知，B.subtilisJLB30-2能耐受醬油的高鹽環(huán)境。

圖5 鹽含量對菌株JLB30-2生長的影響Fig.5 Effect of salt concentration on the growth of strain JLB30-2

2.4 高鹽環(huán)境對枯草芽孢桿菌JLB30-2轉(zhuǎn)化FA的影響

高鹽環(huán)境（20%鹽含量）對枯草芽孢桿菌JLB30-2轉(zhuǎn)化FA生產(chǎn)4-VG和4-EG的影響見圖6。由圖6可知，在20%鹽含量條件下，隨著發(fā)酵時間的延長，F(xiàn)A含量逐漸下降，4-VG和4-EG含量逐漸升高，發(fā)酵15 d后發(fā)酵液中FA含量降至47.00 mg/L，4-VG含量及4-EG含量均達到最高，分別為34.20 mg/L、21.00 mg/L。在整個發(fā)酵過程中FA的利用量與4-EG的生成量呈負相關(guān)。由此可知，B.subtilisJLB30-2可以適應(yīng)高鹽條件，具有優(yōu)越的代謝功能，在高鹽環(huán)境下發(fā)酵可以產(chǎn)生大量的4-EG，使得發(fā)酵液香氣濃郁，適合增強醬油的風味，因此，選擇B.subtilisJLB30-2作為產(chǎn)香菌株添加到醬油中。

圖6 高鹽環(huán)境對菌株JLB30-2轉(zhuǎn)化阿魏酸的影響Fig.6 Effect of high salt environment on converting ferulic acid of strain JLB30-2

2.5 枯草芽孢桿菌JLB30-2在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用

2.5.1 強化枯草芽孢桿菌JLB30-2對醬油中4-EG含量的影響醬油中的阿魏酸主要存在于谷物原料（大豆、小麥和麩皮）的細胞壁中，其單體以及二聚體主要以酯鍵結(jié)合到阿拉伯糖殘基上或醚鍵結(jié)合到木質(zhì)素表面[26]。在醬油發(fā)酵過程中，細胞壁中的FA需要被微生物產(chǎn)生的阿魏酸酯酶水解才能釋放[27]。醬油發(fā)酵過程中，F(xiàn)A及4-EG含量的變化見圖7。由圖7可知，隨著發(fā)酵時間的延長，對照組和實驗組FA的含量逐漸降低，4-EG含量逐漸升高。發(fā)酵60 d時，實驗組FA含量降到17.5 mg/L，4-EG產(chǎn)量達到29.75 mg/L，而未強化枯草芽孢桿菌JLB30-2的對照組FA含量為55.5 mg/L，4-EG含量為6.85 mg/L，所以在醬醪中強化B.subtilisJLB30-2能明顯提高FA到4-EG轉(zhuǎn)化效率，提高醬油中的4-EG含量。

圖7 菌株JLB30-2對醬油發(fā)酵中生成4-EG的影響Fig.7 Effect of strain JLB30-2 on 4-EG production in soy sauce fermentation

2.5.2 強化枯草芽孢桿菌JLB30-2對醬油中揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響

采用GC-IMS分析強化枯草芽孢桿菌JLB30-2實驗組和對照組醬油發(fā)酵15 d和30 d的揮發(fā)性風味物質(zhì)組成，指紋圖譜見圖8。由圖8可知，隨著發(fā)酵時間延長，揮發(fā)性風味物質(zhì)的組成變化比較明顯，且實驗組和對照組之間也有差異。發(fā)酵15 d時，對照組中含量多的揮發(fā)性風味物質(zhì)主要是醛類，如糠醛、苯甲醛、苯乙醛等，呈杏仁味香氣[28]，實驗組中含量多的揮發(fā)性風味物質(zhì)主要是酮類，如3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、1-辛烯-3-酮等，呈花果香和奶油香氣[29]。發(fā)酵30 d時，對照組中苯乙醛、己醛、壬醛等物質(zhì)含量比發(fā)酵15 d的變多，實驗組中2-己酮、2-丁酮、3-辛酮等物質(zhì)含量比發(fā)酵15 d的變多。由圖8亦可知，對照組和實驗組中含量多的揮發(fā)性風味物質(zhì)以醛類和酮類物質(zhì)為主，隨著發(fā)酵時間的增加，醛類物質(zhì)含量逐漸減少，而酮類物質(zhì)含量不斷增加，其中實驗組中的酮類物質(zhì)含量高于對照組的酮類物質(zhì)含量，說明菌株JLB30-2能夠促進醬油中酮類物質(zhì)的產(chǎn)生，有助于醬香風味的形成。

圖8 菌株JLB30-2對醬油揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響Fig.8 Effect of strain JLB30-2 on the volatile flavor substances in soy sauce

2.5.3 強化枯草芽孢桿菌JLB30-2對醬油中氨基酸、有機酸及葡萄糖的影響

醬油發(fā)酵過程中游離氨基酸、有機酸及葡萄糖含量的變化見圖9。游離氨基酸是醬油鮮味的主要來源，另外，氨基酸可以通過酶催化和非酶催化生成各類呈香物質(zhì)，豐富醬油的香氣[30-31]。由圖9a可知，隨著發(fā)酵時間的延長，醪液中氨基酸含量也逐步增加，前期增速較快，后期增速變慢，這主要是蛋白酶的作用。值得注意的是，強化枯草芽孢桿菌JLB30-2實驗組的氨基酸含量明顯高于對照組，這可能與枯草芽孢桿菌JLB30-2可以分泌少量蛋白酶有關(guān)。

圖9 菌株JLB30-2對醬油發(fā)酵過程中氨基酸（a）、有機酸（b）及葡萄糖（c）含量的影響Fig.9 Effect of strain JLB30-2 on the contents of amino acids (a), organic acids (b), and glucose (c) in soy sauce fermentation process

有機酸和葡萄糖對醬油的風味形成也發(fā)揮重要作用[32]，由圖9b可知，在醬油發(fā)酵過程中，實驗組和對照組的有機酸組成相似，主要為乳酸、草酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸，含量也沒有明顯的區(qū)別，說明枯草芽孢桿菌JLB30-2對有機酸的合成影響較小。由圖9c可知，醬油發(fā)酵過程中葡萄糖含量始終處于較低水平，實驗組發(fā)酵初期葡萄糖有快速下降階段，說明枯草芽孢桿菌JLB30-2在醪液中有較高的活性，增加了糖消耗。

2.5.4 強化枯草芽孢桿菌JLB30-2對醬油感官品質(zhì)的影響

對兩組醬油的滋味和香氣特征進行感官評分，結(jié)果見圖10。由圖10可知，在滋味方面，實驗組的鮮味、煙熏味、厚味、甜味、酸味、綜合口感和偏愛程度均高于對照組；在香氣方面，實驗組的花果香、焦香、醇香、醬香、麥芽香、大豆香、綜合香氣和偏愛程度均高于對照組，說明強化B.subtilisJLB30-2后可以提升成品醬油的感官品質(zhì)，這與文獻[33]報道添加B.subtilis或其他產(chǎn)香細菌可以改善醬油的感官品質(zhì)的研究結(jié)果相似，說明B.subtilisJLB30-2在改善醬油風味和感官方面有較好的應(yīng)用前景。

圖10 菌株JLB30-2對醬油滋味（a）和香氣（b）的影響Fig.10 Effect of strain JLB30-2 on taste(a)and aroma(b)of soy sauce

3 結(jié)論

本研究從廣式高鹽稀態(tài)醬油的醬醪中分離篩選到1株能夠?qū)A高效轉(zhuǎn)化為4-EG的細菌JLB30-2，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學技術(shù)鑒定其為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌株在45 ℃、160 r/min、20%鹽含量環(huán)境下，能將發(fā)酵液中的FA轉(zhuǎn)化為4-EG，說明其能夠很好地適應(yīng)廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中高鹽、高溫、低氧環(huán)境。在醬油釀造過程強化菌株JLB30-2，發(fā)酵60 d時，醬油中4-EG含量為29.75 mg/L，是對照組（6.85 mg/L）的3.34倍，同時增加了醬油中氨基酸、酮類化合物的含量，強化了醬油醇香和醬香，提高了醬油的感官品質(zhì)，對提升醬油品質(zhì)具有重要實用價值。