一株高產(chǎn)胞外多糖半夏內(nèi)生真菌的鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及生物活性測(cè)定

楊立軍，花嬌嬌，崔晨旭，賈艷嬌，陳 瓊，赫丁軒*

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 制藥工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000）

生物活性多糖因其治療特性和相對(duì)較低的副作用而被廣泛研究和用于食品和藥品行業(yè)。多糖的抗腫瘤[1]、免疫調(diào)節(jié)[2]和抗菌[3]活性已在生化和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到充分研究和應(yīng)用，植物和藻類作為人類多糖的重要來(lái)源，需求壓力越來(lái)越大，這使得生物聚合物的全球市場(chǎng)價(jià)格被推高，同時(shí)過(guò)度依賴地球上的水生和陸地綠植來(lái)滿足人類的經(jīng)濟(jì)、能源、食品與醫(yī)學(xué)等需求是全球變暖和氣候變化挑戰(zhàn)的直接原因[4]。因此，尋找到無(wú)需進(jìn)行耕地或光合生產(chǎn)的替代品至關(guān)重要[5]。

植物內(nèi)生菌種類繁多，廣泛分布在植物的根莖葉中，而且在與宿主植物長(zhǎng)期共存中，產(chǎn)生了一系列有活性的次生代謝產(chǎn)物，如抗菌物質(zhì)、抗腫瘤物質(zhì)、抗病蟲(chóng)害物質(zhì)等，是天然藥物的重要來(lái)源。半夏（Pinellia ternata）含有豐富的內(nèi)生菌菌種資源，且多株菌具有代謝抑菌活性物質(zhì)的特性，在獲取天然藥用生物活性成分方面存在很大潛能。劉建玲等[6]從半夏的根莖葉中分離出多株內(nèi)生真菌，證明了半夏內(nèi)生真菌的多樣性與分布差異性。黃筱鈞等[7]對(duì)分離得到的半夏內(nèi)生菌進(jìn)行初步鑒定，對(duì)研究制備半夏益生菌制劑提供了重要的理論依據(jù)。

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）作為與適應(yīng)、存活和功能相關(guān)生物體（植物，動(dòng)物，藻類，細(xì)菌和真菌）的細(xì)胞外代謝物，具有短時(shí)間內(nèi)可大量生產(chǎn)、易于分離和純化等優(yōu)點(diǎn)[8]，屬于無(wú)毒天然產(chǎn)物，是生物活性多糖替代品的首選。此外，這些多糖還具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤等[9-11]多種藥理活性，并且含有不同的反應(yīng)基團(tuán)，如羥基、羧基等可進(jìn)行化學(xué)修飾[12]，在生物材料和制藥工業(yè)方面潛力巨大，是合成聚合物的綠色替代品[13-14]。EPS在結(jié)構(gòu)、性能和生產(chǎn)方面的優(yōu)勢(shì)使其受到廣泛關(guān)注，成為目前研究和應(yīng)用較多的一類微生物多糖。目前，對(duì)EPS的研究主要集中在乳酸菌與細(xì)菌上，對(duì)于從藥用植物中分離得到的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的胞外多糖的研究?jī)H有些許報(bào)道，且主要集中于對(duì)胞外多糖的生物活性進(jìn)行研究。如黑板樹(shù)內(nèi)生真菌鐮刀菌SD5的胞外多糖對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）表現(xiàn)出顯著的清除活性[15]；紅樹(shù)林內(nèi)生真菌胞外多糖具有良好的抗氧化活性[16]。但對(duì)于從藥用植物中分離得到的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的胞外多糖的研究?jī)H有些許報(bào)道，藥用植物內(nèi)生菌作為一種新型的微生物資源，具有重大的研究意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

因此，本研究從本實(shí)驗(yàn)室分離的藥用植物半夏內(nèi)生真菌中篩選出高產(chǎn)胞外多糖的菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定；以EPS產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素與正交試驗(yàn)對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化；并通過(guò)掃描電鏡以及抗氧化與降血糖試驗(yàn)對(duì)EPS的結(jié)構(gòu)與活性進(jìn)行研究，以期為開(kāi)發(fā)新型活性多糖、藥物和功能性食品提供新的菌株來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半夏內(nèi)生真菌：42株，實(shí)驗(yàn)室分離并保藏；氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、α-葡萄糖苷酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline）-6-sulfonic acid，ABTS）：合肥千盛生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基內(nèi)不添加瓊脂，高壓蒸汽滅菌121 ℃、20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800-DS2紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；WT-3003型電子天平：杭州萬(wàn)特衡器有限公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海榮亞生化儀器廠；S-3400N掃描電子顯微鏡：日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗胞外多糖的制備與提取

將菌株接種在PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d后得活化菌株。挑取菌絲體于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d得種子液。將種子液按4%的接種量接種于PDB培養(yǎng)基中，同等條件下培養(yǎng)7 d得發(fā)酵液。參照YUAN P等[9]的方法進(jìn)行粗胞外多糖的提取，采用苯酚-硫酸法[17]測(cè)定多糖產(chǎn)量，以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，以波長(zhǎng)490 nm條件下的吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=23.749x+4.107 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1。

1.3.2 高產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選

高產(chǎn)胞外多糖菌株的初篩與復(fù)篩參考陸娟等[18]的方法。首先以菌落周圍是否有粘稠分泌物為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初篩，然后采用1.3.1所述的粗胞外多糖的提取方法制備初篩菌株的粗胞外多糖，通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定菌株胞外多糖產(chǎn)量，選取胞外多糖產(chǎn)量最高的菌株進(jìn)行后續(xù)鑒定與分析。

1.3.3 高產(chǎn)胞外多糖菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：采用插片法[19]培養(yǎng)菌株，28 ℃倒置培養(yǎng)96 h，每隔24 h觀察并記錄菌落的形態(tài)變化。將插片經(jīng)草酸銨結(jié)晶紫染色后，置于載玻片上，然后在顯微鏡下觀察并記錄菌絲與孢子的形態(tài)特征。

分子生物學(xué)鑒定：菌株的分子生物學(xué)鑒定參考段鴻斌等[20]的方法。

1.3.4 高產(chǎn)胞外多糖菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

為提高胞外多糖產(chǎn)量，在原發(fā)酵條件為28 ℃、發(fā)酵時(shí)間120 h、接種量4%、轉(zhuǎn)速120 r/min的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間與接種量3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)因素水平設(shè)置條件如下：發(fā)酵溫度為25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃；發(fā)酵時(shí)間為100 h、110 h、120 h、130 h、140 h；接種量為4%、6%、8%、10%、12%。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別選取發(fā)酵溫度（A），發(fā)酵時(shí)間（B）與接種量（C）為評(píng)價(jià)因素進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5 抗氧化能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定：參考莫宏輝等[21]的方法；ABTS自由基清除能力測(cè)定：采用ABTS自由基清除法[22]；羥基自由基清除能力測(cè)定：參考劉娜等[23]的方法。

1.3.6 抑制α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定

采用對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenylα-D-galactopyranoside，PNPG）法[24-25]進(jìn)行測(cè)定。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，將粗胞外多糖和阿卡波糖分別配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的樣品溶液。向96孔酶標(biāo)板中加入80 μL磷酸緩沖液（pH6.8），16 μL樣液和16 μLα-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL），37 ℃反應(yīng)15 min；加入16 μL濃度為2.5 mmol/L的PNPG溶液，37 ℃反應(yīng)30 min；最后加入100 μL濃度為1.0 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)405 nm處的吸光度值。按下式計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中：A0為磷酸緩沖溶液代替樣品吸光度值；Ai為樣品吸光度值；Aj為磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液的吸光度值。

1.3.7 表面形態(tài)觀察

將樣品固定在導(dǎo)電膠上，鍍金后，利用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）在電壓為10 kV，放大倍數(shù)為×5 000和×10 000條件下，觀察EPS的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，分別使用SPSS 26.0、Origin2018進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)胞外多糖菌株篩選

對(duì)42株內(nèi)生真菌進(jìn)行初篩，得到7株粘稠拉絲的菌株，表明其可能分泌粘性多糖，測(cè)定7株菌株的EPS產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株BX-2產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量最高，為6.14 mg/mL，明顯高于其他菌株。因此，選擇菌株BX-2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 復(fù)篩菌株的胞外多糖產(chǎn)量Fig.1 Exopolysaccharides production of re-screened strains

2.2 菌株BX-2的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株BX-2的菌落形態(tài)與孢子形態(tài)見(jiàn)圖2。由圖2可知，其菌絲發(fā)達(dá)，邊緣偏乳白色，內(nèi)部呈黃色，且有淡黃色色素沉積，可能是內(nèi)生菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。光學(xué)顯微鏡下，菌株BX-2的孢子呈長(zhǎng)橢狀，簇生或單生，排列較為規(guī)整，大小為（7.5～12.1）×（2.8～4.7）μm。根據(jù)菌落形態(tài)與顯微觀察，并結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)，初步判斷該菌株是曲霉屬（Aspergillussp.）真菌。

圖2 菌株BX-2的菌落形態(tài)（A）與孢子形態(tài)（B）Fig.2 Colony morphology(A)and spore morphology(A)of strain BX-2

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)來(lái)自菌株BX-2的16S rDNA基因片段進(jìn)行測(cè)序，并存放在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中。在MEGA 5.0軟件中使用具有1 000個(gè)自舉重復(fù)的鄰居連接方法構(gòu)建了具有該序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[26]，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株BX-2序列與土曲霉（Aspergillus terreus）MT558939.1序列之間的遺傳距離值較小，同源性＞99%，親緣關(guān)系最近。結(jié)合其形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，最終鑒定菌株BX-2為土曲霉（Aspergillus terreus）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株BX-2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain BX-2 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響

真菌細(xì)胞內(nèi)的酶活力受溫度的影響，進(jìn)而影響體內(nèi)的生長(zhǎng)與代謝，在一定溫度范圍內(nèi)，酶活力隨著溫度的升高先增加后降低[27]，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on exopolysaccharides production of strain BX-2

由圖4可知，在發(fā)酵溫度25～31 ℃時(shí)，EPS產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度的上升而增加，在發(fā)酵溫度31 ℃時(shí)達(dá)到最高水平，為6.18 mg/mL，當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)31 ℃時(shí)，EPS產(chǎn)量急劇下降，可能是因?yàn)槊富盍档蛯?dǎo)致胞外多糖產(chǎn)量下降。綜上，選取發(fā)酵溫度28 ℃、31 ℃、34 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on exopolysaccharides production of strain BX-2

由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為110 h時(shí)，EPS產(chǎn)量最高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，EPS產(chǎn)量呈階梯狀減少，可能是由于發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗和菌體產(chǎn)生降解多糖的酶[28]，這與IBRAHIM S等[29]的研究結(jié)果相一致。綜上，選取發(fā)酵時(shí)間100 h、110 h、120 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.3 接種量對(duì)菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響

接種量對(duì)菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖6。

圖6 接種量對(duì)菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of inoculum on exopolysaccharides production of strain BX-2

由圖6可知，其對(duì)菌株BX-2的胞外多糖產(chǎn)量影響較大。EPS產(chǎn)量在接種量為4%～8%內(nèi)穩(wěn)步增加，在8%達(dá)到最高水平，為6.27 mg/mL，然后逐漸下降，當(dāng)接種量為12%時(shí)，EPS產(chǎn)量最低，僅為3.59 mg/mL。可能是由于接種量過(guò)少時(shí)，菌種數(shù)量太少，EPS產(chǎn)量被限制；而接種量的增加又會(huì)使碳源過(guò)早被消耗，無(wú)法維持菌株豐富的營(yíng)養(yǎng)，菌體過(guò)早進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵能力下降，從而影響菌株的EPS產(chǎn)量[30]。綜上，選取接種量6%、8%、10%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、接種量（C）為評(píng)價(jià)因素，以菌株的EPS產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，所得正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表2和表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2和表3可知，影響EPS產(chǎn)量的主次因素為：發(fā)酵時(shí)間（B）＞發(fā)酵溫度（A）＞接種量（C），其中發(fā)酵時(shí)間對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。高產(chǎn)胞外多糖菌株BX-2產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵條件為A2B2C2，即發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間110 h、接種量8%。按上述發(fā)酵條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，最終EPS產(chǎn)量為7.38 mg/mL，相較于優(yōu)化前提高了63.64%。

2.5 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果與分析

不同質(zhì)量濃度菌株BX-2胞外多糖與維生素C對(duì)3種自由基的清除率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 菌株BX-2胞外多糖的抗氧化能力Fig.7 Antioxidant capacity of exopolysaccharides of strain BX-2

由圖7可知，雖然總體而言菌株BX-2胞外多糖的清除率遠(yuǎn)小于VC，但均具有一定的清除能力，其清除作用均隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)菌株BX-2胞外多糖質(zhì)量濃度＜0.4 mg/mL時(shí)，其對(duì)3種自由基的清除作用相差較小，隨著質(zhì)量濃度不斷上升，它對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除作用隨之急劇上升，而對(duì)于羥基自由基的清除作用的增長(zhǎng)則相對(duì)緩慢。其中，菌株BX-2胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)，對(duì)ABTS自由基的清除作用次之，羥基自由基最弱；當(dāng)菌株BX-2胞外多糖質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH、ABTS、羥基自由基的清除率分別為82.43%、62.71%、48.63%，相較于葉兆偉等[31]所測(cè)DPPH和羥基自由基清除率數(shù)據(jù)更高，這可能與環(huán)境等因素有關(guān)。BX-2胞外多糖對(duì)DPPH、ABTS、羥基3種自由基清除作用的IC50分別為0.565 mg/mL、0.895 mg/mL、1.677 mg/mL，它對(duì)DPPH與ABTS兩種自由基具有一定的清除能力。

2.6 抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果與分析

不同質(zhì)量濃度菌株BX-2胞外多糖與阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 菌株BX-2胞外多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.8 Inhibition rate of α-glucosidase by exopolysaccharides of strain BX-2

由圖8可知，在0.2～1.2 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菌株BX-2胞外多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率與濃度呈正相關(guān)。當(dāng)菌株BX-2胞外多糖的質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到86.96%，此時(shí)阿卡波糖的抑制率為96.84%，二者相差小于10%；菌株BX-2胞外多糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為0.553 mg/mL，這說(shuō)明菌株BX-2產(chǎn)的胞外多糖具有良好的體外降血糖能力。

2.7 掃描電鏡結(jié)果

對(duì)菌株BX-2胞外多糖進(jìn)行表面微觀形貌觀察的電鏡圖見(jiàn)圖9。由圖9a可以觀察到BX-2胞外多糖表面存在明顯的斷裂；掃描電鏡的原理是電子成像，亮的區(qū)域高，暗的區(qū)域低，圖9b中所呈樣品圖像亮度相差不大，說(shuō)明BX-2胞外多糖的厚度相對(duì)均一。

圖9 菌株BX-2胞外多糖的掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.9 Scanning electron microscope observation results of exopolysaccharides of strain BX-2

3 結(jié)論

本研究從42株半夏內(nèi)生真菌中篩選出1株高產(chǎn)胞外多糖菌株BX-2?；谛螒B(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)鑒定其為土曲霉（Aspergillus terreus）。由單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)得到菌株BX-2的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間110 h、接種量8%。此條件下菌株BX-2的EPS產(chǎn)量為7.38 mg/mL，相較于優(yōu)化前提高了63.64%。體外抗氧化與降血糖試驗(yàn)表明，菌株BX-2胞外多糖具有良好的抗氧化與體外降血糖能力。本研究豐富了產(chǎn)胞外多糖內(nèi)生菌的來(lái)源，為利用菌株BX-2生產(chǎn)胞外多糖作為天然抗氧化劑、降血糖劑提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。