基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDC20基因在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義

汪家盛,沈曉鵬,蔣恩琰,蔡丹丹,沈瑞林,

膀胱癌是泌尿外科臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi)膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第4位,泌尿系腫瘤第二位,僅次于前列腺癌[1]。近年來(lái)膀胱癌的診治取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,然而目前對(duì)于膀胱癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。隨著高通量測(cè)序與生物信息分析技術(shù)的發(fā)展,研究[2]表明膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展與多種基因的差異表達(dá)相關(guān),為膀胱癌的早期診斷、治療靶點(diǎn)及預(yù)后評(píng)價(jià)提供了更多的可能,但當(dāng)前對(duì)膀胱癌的治療手段仍有限,其復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率仍較高,預(yù)后不理想。因此,通過(guò)生物信息學(xué)方法深入挖掘與膀胱癌相關(guān)的生物標(biāo)記物,可以提高診斷,增加臨床療效,改善病人預(yù)后。CDC20是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子,在有絲分裂中,CDC20通過(guò)結(jié)合APC/C復(fù)合體促使姐妹染色單體分離,進(jìn)而完成細(xì)胞分裂從中期到后期的轉(zhuǎn)變[3]。近年來(lái),在多種人類腫瘤中觀察到CDC20的過(guò)表達(dá),如胰腺癌[4]、乳腺癌[5]、前列腺癌[6]等。但目前無(wú)相關(guān)證據(jù)表明CDC20可作為膀胱癌的候選預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)。因此,本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法探討CDC20在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義,為膀胱癌的臨床診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù) Oncomine(https://www.oncomine.org/)是一個(gè)大型腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù),涵蓋65個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)集、4 700個(gè)芯片及4.8億個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù),可用于分析基因表達(dá)差異、尋找離群值、預(yù)測(cè)共表達(dá)基因等[7]。使用該數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDC20基因在癌組織與正常組織中的表達(dá)情況。注冊(cè)賬號(hào)并篩選條件:(1)Gene:CDC20;(2)Analysis Type:cancer vs Normal Analysis;(3)Date type:mRNA;(4)Threshold(P-value):P<0.001;(5)Threshold(fold change):fold change>0.5;(6)Threshold(gene rank):Top10%。檢索時(shí)間:2021年5月。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù) GEPIA(http://gepia2.cancer-pku.cn/)是一個(gè)由北京大學(xué)團(tuán)隊(duì)研發(fā)的用于癌癥和正?；虮磉_(dá)譜分析的公共數(shù)據(jù)庫(kù)?？苫诎┌Y基因組圖譜(TCGA)和基因型-組織表達(dá)(GTEx)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析、生存分析、類似基因篩選等研究[8]。利用該數(shù)據(jù)庫(kù)分析膀胱癌組織與正常組織中CDC20表達(dá)差異情況。篩選條件:(1)Expression Analysis:Expression DIY;(2)Box Plot;(3)Gene:CDC20;(4) log2FC Cutoff:2,P-value Cut off:0.001;(5)Cancer name:BLCA;(6)MatchTCGA normal and GTEx data。檢索時(shí)間:2021年5月。

1.3 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù) Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)能夠評(píng)估5.4萬(wàn)個(gè)基因(mRNA、miRNA、蛋白質(zhì))對(duì)21種癌癥類型生存率的影響,數(shù)據(jù)庫(kù)的來(lái)源包括GEO、EGA和TCGA。該工具的主要目的是基于meta分析的生存生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDC20表達(dá)水平與病人總體生存時(shí)間(overall survival,OS)之間的聯(lián)系。篩選條件:(1)Gene symbol:CDC20;(2)Cancer:Bladder carcinoma;(3)Survival:OS。檢索時(shí)間:2021年5月。

1.4 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù) LinkedOmics(http://www.linkedomics.org)數(shù)據(jù)庫(kù)包含來(lái)自TCGA32種癌癥和11 158例病人的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含LinkFinder、LinkCompare和 LinkInterpreter 模塊,用于分析和比較腫瘤內(nèi)和腫瘤間的多組學(xué)數(shù)據(jù)[9]。運(yùn)用該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行CDC20與膀胱癌病人年齡、種族及臨床病理分期的相關(guān)性的研究。在該數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)賬號(hào)后選定篩選步驟:(1)Select cancer cohort:BLCA;(2)Select search dataset:Data,stype:RNAseq;(3)Select sample dataset:No input;(4)Select search dataset attribute:CDC20;(5)Select target dataset:Clinical;(6)Select statistical method:Nonparametric test。檢索時(shí)間:2021年5月。

1.5 STRING數(shù)據(jù)庫(kù) STRING(https://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)可用于整合蛋白質(zhì)之間所有已知和預(yù)測(cè)的關(guān)聯(lián),包括物理相互作用和功能關(guān)聯(lián)[10]。本研究通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建CDC20基因相關(guān)蛋白的網(wǎng)絡(luò)圖,并進(jìn)一步發(fā)掘其相關(guān)蛋白的富集分析。檢索時(shí)間:2021年5月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)和Kaplan-Meier生存分析。

2 結(jié)果

2.1 CDC20在膀胱癌中的表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示,CDC20基因在正常組織與癌組織中存在差異表達(dá)共有321個(gè)。CDC20在膀胱癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤中高表達(dá),在血液及骨髓系統(tǒng)腫瘤中低表達(dá)。進(jìn)一步薈萃分析該數(shù)據(jù)庫(kù)涉及的6項(xiàng)關(guān)于CDC20在膀胱癌中差異表達(dá)的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CDC20在膀胱癌中高表達(dá),在基因表達(dá)差異中排名118(P<0.01)。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中,共432例樣本,其中膀胱癌組織404例,正常膀胱組織28例,CDC20基因在膀胱癌中的表達(dá)量(6.12±0.82)明顯高于正常膀胱組織(1.96±1.21)(t=25.05,P<0.01),與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果相符。

2.2 CDC20與膀胱癌病人預(yù)后的關(guān)系 為了進(jìn)一步明確CDC20表達(dá)與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系,采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDC20與膀胱癌病人的OS的關(guān)系。根據(jù)約登指數(shù)最大,計(jì)算截?cái)嘀禐? 401。當(dāng)樣本中CDC20表達(dá)大于截?cái)嘀禃r(shí)為高表達(dá)組,否則為低表達(dá)組。結(jié)果顯示,CDC20高表達(dá)的膀胱癌病人OS低于CDC20低表達(dá)的膀胱癌病人(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

2.3 CDC20表達(dá)與膀胱癌病人年齡及臨床病理分期的關(guān)系 采用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDC20表達(dá)與年齡、種族及臨床病理分期的關(guān)系,結(jié)果顯示,CDC20的表達(dá)與年齡(n=407,FDR=0.033 4,P<0.05)、人種(n=391,FDR=0.000 1,P<0.01)均有相關(guān)關(guān)系,與病理分期(n=406,FDR=0.293 0,P>0.05)、T分期(n=375,FDR=0.194 6,P>0.05)、N分期(n=366,FDR=0.237 7,P>0.05)、M分期(n=207,FDR=0.448 6,P>0.05,)均無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。

2.4 CDC20相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)及其功能分析 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)篩選,發(fā)現(xiàn)CDC20相關(guān)蛋白主要包括:FBXO5、CCNB1、AURKA、UBE2S、SKP2、ANAPC5、CCNA2、CENPE、NDC80、ESP21等(見(jiàn)圖2),主要參與的生物過(guò)程包括:細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、病毒致癌機(jī)制、FoxO信號(hào)通路等(見(jiàn)表1)。

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的腫瘤之一。近年來(lái)由于受到環(huán)境污染及吸煙等因素影響,膀胱癌的全球發(fā)病率在逐漸上升,也是中國(guó)老年人死亡的主要原因[11]。目前治療膀胱癌的治療策略主要包括:手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療及生物治療,但膀胱癌的十年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)74.3%[12]?，F(xiàn)階段膀胱鏡是診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn),但由于操作的復(fù)雜性及侵入性,容易造成部分病人的不良醫(yī)療體驗(yàn),增加出血和感染的風(fēng)險(xiǎn)[13]。尿細(xì)胞學(xué)檢查也是膀胱癌診斷和術(shù)后隨訪的主要方法之一,然而這種診斷方法對(duì)低級(jí)別膀胱癌的診斷敏感性較低[14]。隨著腫瘤基因組學(xué)和腫瘤分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展,極大地提高了人們對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí),雖然現(xiàn)有研究已經(jīng)確定了一些在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用的基因,但膀胱癌的治療效果和預(yù)后并未得到令人滿意的改善,因此仍需進(jìn)一步探究在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用的相關(guān)分子標(biāo)志物,為早期診斷、預(yù)后判斷尋求新的基因治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

CDC20作為一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子,通過(guò)結(jié)合APC/C復(fù)合體使姐妹染色單體分離,使細(xì)胞在有絲分裂中完成中期到后期的轉(zhuǎn)換。以往的研究[15]中,在人類的多種腫瘤中都觀察到CDC20基因的過(guò)表達(dá),并與病理臨床分期具有明顯相關(guān)性。在CHANG等[16]的一項(xiàng)回顧性研究中,發(fā)現(xiàn)CDC20在胰腺腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于慢性胰腺炎組織和正常胰腺組織中的表達(dá),且與低分化的胰腺腫瘤的5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)。ALFARSI等[17]證實(shí)了CDC20基因的高表達(dá)致雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌病人預(yù)后不良,對(duì)內(nèi)分泌治療效果不理想。XIONG等[18]揭示了CDC20可能是肝癌中免疫相關(guān)的治療靶標(biāo)。因此,我們猜測(cè)CDC20可能參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展,通過(guò)生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)整合,從CDC20在膀胱癌中的表達(dá),與膀胱癌的臨床病理特征相關(guān)性,CDC20基因相關(guān)蛋白及富集分析等方面,多維度評(píng)估CDC20在膀胱癌中的表達(dá)與預(yù)后意義。

本研究通過(guò)Oncomine、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)了CDC20在膀胱癌中高表達(dá),再通過(guò) Kaplan-Meier方法分析生存數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),CDC20高表達(dá)的病人OS較低,說(shuō)明CDC20的表達(dá)與膀胱癌病人的預(yù)后有關(guān),提示其可能成為膀胱癌病人預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)指標(biāo)。有研究[19]證實(shí),CDC2基因的功能障礙可導(dǎo)致包括膀胱癌在內(nèi)的多種癌癥的分化不良、腫瘤非整倍體和不良預(yù)后。通過(guò)LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù),本研究發(fā)現(xiàn)CDC20與年齡和人種具有相關(guān)性,遺憾的是,并未發(fā)現(xiàn)CDC20與TNM分期及病理分期具有相關(guān)性。分析其原因可能是由于本研究是通過(guò)多個(gè)統(tǒng)計(jì)步驟得出的,設(shè)置不同的檢索標(biāo)準(zhǔn),使用不同的工具,結(jié)果可能有所不同。因此,該結(jié)論仍然是理論性的,未來(lái)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證研究以確認(rèn)其臨床效果,期待有樣本量更大、臨床信息更詳細(xì)的生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)展我們的研究。