學(xué)齡前兒童肺炎鏈球菌耐藥性及大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因分析

賴劍秀,宋相泉,徐菊芳,戴玉柱,段達(dá)榮

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,Sp)是兒童呼吸道感染常見致病菌之一,同時(shí)也可引起中耳炎、化膿性腦膜炎及血流感染,給病人的生命安全帶來(lái)了巨大的威脅。據(jù)估計(jì),2015年全球約33.5萬(wàn)名<5歲兒童死于Sp引起的細(xì)菌性肺炎[1]。隨抗菌藥物的廣泛使用,Sp耐藥性不斷發(fā)生變化,Sp耐藥菌也被廣泛報(bào)道,且耐藥菌株的產(chǎn)生速度不斷增加,導(dǎo)致部分抗菌藥物治療效果不佳,給臨床治療帶來(lái)很大的困難[2]。本研究分析Sp的耐藥性和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因檢出情況,為臨床Sp感染治療提供參考?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年1月至2019年6月杭州市西湖區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科病人下呼吸道標(biāo)本分離的Sp。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病人年齡≤5歲,剔除重復(fù)菌株;(2)病人信息記錄完善者。共收集符合條件患兒60例,其中男36例,年齡1～57個(gè)月;女24例,年齡3～60個(gè)月?；純喊茨挲g分為0～12個(gè)月組、>12～36個(gè)月組和37～60個(gè)月組。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 PICO 17型臺(tái)式高速離心機(jī)和NANO-DROP型超微量分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo公司;PAC 3000型電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;GIS-1600型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司;ABI 7500型PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;MCO-15CA型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋株式會(huì)社;GFP-9270型普通培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒醫(yī)療器械有限公司。

1.2.2 試劑 哥倫比亞血瓊脂平板(批號(hào):070811-2)、藥敏培養(yǎng)基為5%綿羊血、MHA培養(yǎng)皿(批號(hào):1002022190)購(gòu)自廣州迪景生物技術(shù)有限公司,青霉素E-test 試條購(gòu)自溫州康泰生物科技有限公司。PCR 試劑盒KAPA2G Fast Multiplex Mix購(gòu)自上海益啟生物科技有限公司,PCR引物見表1。

表1 耐藥基因引物

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 晨起漱口,清除口腔和鼻腔內(nèi)的分泌物,深呼吸將痰液用力咳出,置于無(wú)菌痰杯中;如果是嬰幼兒晨起喂奶前由專人用低壓吸引器連接一次性無(wú)菌吸痰管,經(jīng)鼻咽部負(fù)壓吸取痰標(biāo)本,置消毒試管內(nèi)。采集到的標(biāo)本均在1 h內(nèi)送至微生物實(shí)驗(yàn)室室進(jìn)行痰涂片鏡檢,白細(xì)胞>25個(gè)/低倍鏡視野,鱗狀上皮細(xì)胞<10個(gè)/低倍鏡視野為合格標(biāo)本。

1.3.2 Sp培養(yǎng)和鑒定 將痰標(biāo)本接種于哥倫比亞血瓊脂平板,置于35 ℃含5% CO2孵箱中孵育18～24 h,然后挑選周圍有草綠色溶血環(huán)、邊緣整齊,呈臍窩狀的菌落,進(jìn)行革蘭染色,奧普托欣試驗(yàn)進(jìn)行初篩,結(jié)果陽(yáng)性再用法國(guó)生物梅里埃自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀VITEK 2 Compact GP卡進(jìn)行鑒定。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 采用 E-test 法檢測(cè)Sp對(duì)青霉素、頭孢曲松及頭孢噻肟的最低抑菌濃度;采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)Sp對(duì)紅霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氯霉素、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺的藥物敏感性。質(zhì)控菌株為SpATCC49619,來(lái)源于南京便診生物科技有限公司?？咕幬锩舾行耘卸ㄒ罁?jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)2020版判定標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施和執(zhí)行。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 (1)DNA提取:Sp在哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)24 h,傳代后收集整個(gè)血平板上菌落,用十六烷基三甲基溴化銨法提取基因組DNA。(2)PCR反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液5.0 μL,MgCl22 mmol/L,dNTP 200 pmol/L,上、下游引物各50 pmol/L,Taq酶2 U/μL,模板DNA 50 ng/μL。(3)反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、1 min,35次循環(huán);72 ℃延伸5 min[3]。(4)電泳:將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠100 V電泳45 min,紫外燈下觀察結(jié)果,凝膠成像系統(tǒng)掃描成像,選用ATCC49619標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)和Fisher′s確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 60株Sp耐藥情況 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,60株Sp對(duì)紅霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率較高,分別為95.0%,93.3%,61.7%;Sp對(duì)萬(wàn)古霉素、厄他培南、利耐唑胺和泰利霉素均敏感,敏感率為100.0%(見表2)。

表2 60株Sp耐藥情況[n;百分率(%)]

2.2 不同年齡組抗菌藥物不敏感率比較 0～12個(gè)月組兒童對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、青霉素G、阿莫西林、紅霉素、美洛培南不敏感率均高于13～36個(gè)月組和37～60個(gè)月組,其中3組頭孢噻肟、頭孢曲松不敏感率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),37～60個(gè)月組兒童對(duì)復(fù)方新諾明、氧氟沙星、四環(huán)素不敏感率最高(見表3)。

2.3 Sp耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)的Sp大環(huán)內(nèi)酯類三個(gè)基因分別為ermB、mefE與mefA,結(jié)果表明,ermB檢出率最高(98.33%),mefA和ermB+mefA測(cè)出率均為78.33%,mefE和ermB+mefE檢出率均為60.00%,ermB+mefA+mefE檢出率最低(46.67%)。mefE和ermB+mefE在0～12個(gè)月組、13～36個(gè)月組、37～60個(gè)月組檢出率逐漸降低(P<0.05)(見表4)。

表4 不同年齡組耐藥基因檢出率比較[n;百分率(%)]

2.4 Sp耐藥基因電泳結(jié)果 本研究共檢測(cè)3種耐藥基因,ermB、mefE與mefA基因產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為639、363、553 bp,電泳結(jié)果見圖1。

3 討論

近年來(lái),我國(guó)抗菌藥物濫用日趨嚴(yán)重,隨著臨床上抗菌藥物的大量應(yīng)用,兒童感染Sp多重耐藥率逐漸升高,導(dǎo)致相關(guān)感染控制難度增大,已成為全球性問(wèn)題[4-5]。本研究分離的60株Sp藥敏結(jié)果表明,紅霉素耐藥率為95.00%,與KIM等[6]在亞洲耐藥病原體監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)研究報(bào)道我國(guó)Sp的紅霉素耐藥率(96.4%)結(jié)果一致。除紅霉素表現(xiàn)高度耐藥外,四環(huán)素耐藥率也保持高位,本次檢測(cè)四環(huán)素耐藥率為93.33%,高于王揚(yáng)帆等[7]報(bào)道的86.54%。究其原因,一方面可能不同分離菌株間存在差異,另一方面可能不同地區(qū)醫(yī)療、養(yǎng)殖和環(huán)境中抗生素的使用有關(guān)。由于Sp對(duì)紅霉素高度耐藥,在臨床治療中應(yīng)避免使用,研究中未檢測(cè)到耐萬(wàn)古霉素、厄他培南、利耐唑胺及泰利霉素菌株,這為臨床治療Sp感染相關(guān)疾病提供了更多的用藥選擇。

本研究中,不同年齡組抗菌藥物不敏感率比較表明,0～12月兒童對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、阿莫西林不敏感率高于12～36月和36～60月年齡組(P<0.05),可能與當(dāng)?shù)厣罟?jié)奏快,工作壓力大,許多家庭6～12月兒童,用奶粉或輔食代替母乳喂養(yǎng)。另外,該時(shí)期免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善,特別容易患呼吸道疾病(如咳嗽、打噴嚏、流涕、發(fā)熱等感冒癥狀及肺炎等)和胃腸道疾病(如腹瀉等),導(dǎo)致該時(shí)期的嬰幼兒,經(jīng)常使用抗生素,從而對(duì)許多抗菌藥物產(chǎn)生耐藥和中介現(xiàn)象,引起不敏感率增加。由于本研究的標(biāo)本數(shù)量有限,不同年齡組的不敏感率比較需要再收集標(biāo)本進(jìn)一步分析。

Sp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥是通過(guò)多種不同的耐藥機(jī)制完成的。耐藥機(jī)制主要包括核糖體靶位改變和主動(dòng)外排系統(tǒng)。另外,IZE-IYAMU等[8]報(bào)道轉(zhuǎn)座子在Sp耐藥進(jìn)化中起重要作用,與質(zhì)粒DNA無(wú)關(guān)的耐藥性傳遞主要由轉(zhuǎn)座因子完成。不同地區(qū)檢測(cè)的紅霉素Sp的耐藥基因結(jié)果有所同,多數(shù)歐洲和亞洲國(guó)家以ermB介導(dǎo)為主,美國(guó)、中國(guó)香港等地以mefA為主。本研究分離的60株Sp,采用PCR法檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB、mefA和mefE,結(jié)果表明,耐藥基因攜帶率以ermB最高(98.33%),與WANG等[9]報(bào)道的100.0%及黃阿環(huán)等[10]報(bào)道的98.1%一致,但高于宋彬容[11]報(bào)道的87.5%與BAO等[12]報(bào)道的70.2%,表明ermB基因?yàn)楹芏嗟貐^(qū)Sp耐紅霉素的主要原因,另外在不同地區(qū)也存在著很大的差異。mefA和mefE攜帶率分別為78.33%與60.00%,高于賴玉華[13]報(bào)道的mefA 6.1%和mefE 44.7%,可能與不同地區(qū)菌株差異有關(guān)。另外28株同時(shí)檢測(cè)到耐藥基因ermB、mefA和mefE,占比46.67%,表明該地區(qū)Sp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,且耐藥機(jī)制復(fù)雜;1株耐紅霉的Sp均未檢到ermB、mefA和mefE耐藥基因,可能存在其他的耐藥基因或耐藥機(jī)制,有待于進(jìn)一步研究。本研究中,不同年齡組的耐藥基因比較發(fā)現(xiàn),mefE與ermB+mefE在不同年齡組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且0～12月組比13～36月與37～60月組高,與上述討論的不同年齡組耐藥率0～12月組高于其他2組較為一致,因此,0～12月患兒治療Sp感染疾病盡量避免大環(huán)內(nèi)酯類藥物使用。

綜上,學(xué)齡前兒童Sp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率與耐藥基因攜帶率均處于高位,對(duì)青霉素耐藥率較低,對(duì)萬(wàn)古霉素、厄它培南、利耐唑胺及泰利霉素均未出現(xiàn)耐藥菌,因此,臨床在治療Sp感染相關(guān)疾病時(shí),必須加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)。