lncRNA Zeb1-AS1調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路影響骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡

劉 旋,張 磊,張鳳軍

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是常見的關(guān)節(jié)疾病,以關(guān)節(jié)軟骨退化和骨贅形成為特征,是世界范圍內(nèi)引起成人疼痛、殘疾的主要原因[1]。臨床主要采用藥物、干細(xì)胞治療等手段來減輕疼痛和控制癥狀,但不能有效阻止疾病進(jìn)展[2]。多項(xiàng)研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNA)參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等病理生理學(xué)過程,其表達(dá)改變與OA發(fā)生有關(guān)[3-5]。如OA病人軟骨組織中l(wèi)ncRNA母系表達(dá)基因3(MEG3)表達(dá)降低,過表達(dá)MEG3促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡、軟骨基質(zhì)降解[5]。軟骨傷害有關(guān)lncRNA(lncRNA-CIR)通過調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨變性[4]。lncRNA E盒結(jié)合鋅指蛋白1反義1(Zeb1-AS1)已被證實(shí)在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[4],但lncRNA Zeb1-AS1在OA中的潛在作用機(jī)制尚不清楚。最近研究表明蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號(hào)通路與OA軟骨退變的病理過程密切相關(guān),姜黃素通過激活JAK2/STAT3信號(hào)通路可增加軟骨細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力,緩解關(guān)節(jié)軟骨蛻變[6]。丹參可激活JAK2/STAT3途徑在體內(nèi)和體外水平對(duì)OA的軟骨損傷具有抑制作用[7]。本研究探討lncRNA Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響,及是否與調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司;Zeb1-AS1小干擾RNA(si-Zeb1-AS1)及其陰性對(duì)照(si-NC)購于廣州復(fù)能基因;JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490、兔抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)抗體、兔抗Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、兔抗p-JAK2抗體、兔抗p-STAT3抗體、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購于美國Abcam公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Super mix購于美國Bio-rad公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購于日本同仁公司;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)試劑盒購于上海凱基生物。

1.2 人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 收集2017年1月至2018年1月我院行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的5例OA病人的組織標(biāo)本,年齡52～72歲。參照趙曉燕[8]實(shí)驗(yàn)方法分離OA軟骨細(xì)胞。磷酸鹽緩沖液洗滌關(guān)節(jié)軟骨片后,剪碎組織塊,加入胰酶在含5%CO2、37 ℃、濕度飽和的培養(yǎng)箱中消化30 min,吸出消化夜后,采用Ⅱ型膠原酶于培養(yǎng)箱震蕩消化18 h,每隔8 h收集一次細(xì)胞。200目濾網(wǎng)過濾,離心棄去上清液,用含20%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,接種新的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。細(xì)胞80%融合時(shí)按照1∶2比例進(jìn)行傳代,采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),選用第3代對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 按照2×105個(gè)/孔的密度將對(duì)數(shù)期OA軟骨細(xì)胞接種6孔板,當(dāng)細(xì)胞50%融合時(shí)按照LipofectamineTM2000使用說明將si-NC、si-Zeb1-AS1分別轉(zhuǎn)染OA軟骨細(xì)胞,依次記為si-NC組、si-Zeb1-AS1組。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)收集細(xì)胞,RT-qPCR檢測(cè)Zeb1-AS1表達(dá)水平,轉(zhuǎn)染合格后進(jìn)行后續(xù)分析。用AG490處理轉(zhuǎn)染si-Zeb1-AS1細(xì)胞48 h,記為si-Zeb1-AS1+ AG490組,隨后分析細(xì)胞增殖和凋亡情況。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)Zeb1-AS1表達(dá)量 Trizol試劑提取各組OA軟骨細(xì)胞的總RNA,取40 ng進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA,利用SYBR Green Super mix進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),2-ΔΔCt法分析Zeb1-AS1相對(duì)表達(dá)量。ZEB1-AS1上游引物5′-TCC CTG CTA AGC TTC CTT CAG TG T-3′,下游引物5′-GAC AGT GAT CAC TTT CAT ATC C-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′,下游引物5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 每組取100 μL細(xì)胞懸液接種96孔板,培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)每孔加入10 μL的CCK-8試劑,再培養(yǎng)4 h后,分光光度計(jì)檢測(cè)450 nm處光密度(OD)值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取500 μL結(jié)合緩沖液重懸各組細(xì)胞,按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞染色,黑暗環(huán)境孵育15 min后,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blotting檢測(cè)Bax、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)量 裂解各組細(xì)胞提取總蛋白,將等量蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉莫后,在4℃下用Bax抗體、Bcl-2抗體、p-JAK2抗體、p-STAT3抗體以及GAPDH抗體孵育膜過夜;室溫下用二抗孵育膜2 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影,以GAPDH為內(nèi)參,通過Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組比較,si-Zeb1-AS1組OA軟骨細(xì)胞Zeb1-AS1表達(dá)水平明顯降低(P<0.01),48、72 h OD值均明顯升高(P<0.01)(見表1)。

表1 干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響

2.2 干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC組比較,si-Zeb1-AS1組OA軟骨細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)、凋亡率明顯降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)(見表2、圖1)。

表2 干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響 與si-NC組比較,si-Zeb1-AS1組OA軟骨細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)(見表3、圖2)。

表3 干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

2.4 JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑逆轉(zhuǎn)干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖的影響 與si-Zeb1-AS1組比較,si-Zeb1-AS1+AG490組OA軟骨細(xì)胞48、72 h OD值明顯降低(P<0.01)(見表4)。

表4 JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑逆轉(zhuǎn)干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖的影響

2.5 JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑逆轉(zhuǎn)干擾Zeb1-AS1對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響 與si-Zeb1-AS1組比較,si-Zeb1-AS1+AG490組OA軟骨細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)、凋亡率明顯升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)(見表5、圖3)。

表5 JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑對(duì)干擾Zeb1-AS1處理的OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

OA是關(guān)節(jié)軟骨的退行性疾病,其主要病理特征是軟骨破壞。由于OA進(jìn)展分子機(jī)制并未完全闡明,目前OA仍缺乏有效的治療策略。近年來,lncRNA人類疾病中進(jìn)展中的作用引起人們重視,多項(xiàng)研究證實(shí)lncRNA具有疾病診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)潛力。目前,包括PART-1[9]、X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物(XIST)[10]、漿細(xì)胞瘤變異易位1(PVT1)[11]在內(nèi)的多種lncRNA均被證實(shí)參與OA進(jìn)展。Zeb1-AS1是一種致癌lncRNA,其高表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、臨床分期、器官轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),具有癌癥預(yù)后標(biāo)志物作用[12]。干擾Zeb1-AS1表達(dá)顯著降低食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,抑制裸鼠異種移植瘤形成[13]。此外,干擾Zeb1-AS1還可抑制上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制肺纖維化[14]。本研究探討其在OA進(jìn)展中作用顯示,轉(zhuǎn)染si-Zeb1-AS1干擾Zeb1-AS1表達(dá)可顯著提高OA軟骨細(xì)胞活力,抑制細(xì)胞凋亡。眾所周知,Bcl-2家族在軟骨細(xì)胞的存活和凋亡中發(fā)揮重要作用,促凋亡蛋白Bax通過激活半胱天冬酶9(Caspase9)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而抗凋亡蛋白Bcl-2通過阻止Bax移位和構(gòu)象改變具有相反作用[15]。研究顯示,OA軟骨組織中Bcl-2表達(dá)水平降低,杜仲苷通過調(diào)控Bcl-2、Bax等關(guān)鍵介質(zhì)抑制軟骨細(xì)胞發(fā)凋亡對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用[16]。本研究顯示,干擾Zeb1-AS1表達(dá)顯著抑制Bax蛋白表達(dá),促進(jìn)Bcl-2表達(dá),與其抗凋亡作用一致。提示,Zeb1-AS1通過調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖和凋亡在OA進(jìn)展中具有重要作用。

JAK2/STAT3途徑已被證實(shí)與OA的多個(gè)病理過程有關(guān)。如染料木素通過激活JAK2/STAT3信號(hào)通路可抑制OA炎癥反應(yīng),抑制軟骨細(xì)胞凋亡,緩解關(guān)節(jié)軟骨退變,進(jìn)而抑制OA進(jìn)展[17]。抑制miR-375可提高軟骨細(xì)胞抗氧化能力,維持細(xì)胞外基質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài),其機(jī)制也與激活JAK2/STAT3途徑有關(guān)[18]。本研究中,干擾si-Zeb1-AS1表達(dá)顯著提高OA軟骨細(xì)胞中JAK2和STAT3的磷酸化水平,提示干擾si-Zeb1-AS1表達(dá)可能提高激活JAK2/STAT3途徑進(jìn)而在OA中發(fā)揮保護(hù)作用。進(jìn)一步研究顯示,采用AG490抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路顯著逆轉(zhuǎn)干擾si-Zeb1-AS1表達(dá)對(duì)OA軟骨細(xì)胞的促增殖和抗凋亡作用,恢復(fù)OA軟骨細(xì)胞的增殖能力和凋亡水平,這進(jìn)一步說明JAK2/STAT3途徑介導(dǎo)Zeb1-AS1在OA進(jìn)展中的作用。

綜上所述,干擾lncRNA Zeb1-AS1通過激活JAK2/STAT3信號(hào)通路能夠促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制OA進(jìn)展。因此,lncRNA Zeb1-AS1有望成為OA治療的有效靶點(diǎn)。