納米靜電紡絲纖維對糖尿病小鼠創(chuàng)面修復的影響

劉芯君,岳 園,邱婷婷,蔣運蘭

糖尿病作為全球常見的慢性疾病,在中老年人群中發(fā)病率較高[1]。目前糖尿病尚無治愈方法,僅能通過長期控制血糖改善癥狀[2-3]。長期高血糖刺激能夠影響視網(wǎng)膜、腎臟及血管等重要臟器和組織功能,嚴重危害病人健康[4]。創(chuàng)面長期不愈合是糖尿病病人經(jīng)常遇到的難題,且糖尿病病人創(chuàng)面極易并發(fā)感染,若治療不及時甚至有可能導致截肢等嚴重后果[5-8]。近年納米技術(shù)在臨床應用中取得較好效果[9-10]。靜電紡絲是聚合物液體靜電霧化的一種特殊形式,通過纖維制造生產(chǎn)的納米聚合物顯示出較好前景[11]。靜電紡絲具有細小、致密、完整的形態(tài)特征,與人體組織器官相似,臨床上已被用于修復受損組織器官[12]。研究[13-14]顯示,靜電紡絲可加速創(chuàng)面愈合。因此,本研究通過制備納米靜電紡絲纖維,建立糖尿病創(chuàng)面小鼠模型,觀察納米靜電紡絲對糖尿病創(chuàng)面修復的影響,以期為臨床應用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞 6～8周齡 C57BL/6L小鼠30只(購自北京百奧賽圖股份有限公司),造模前適應性喂養(yǎng)1周。人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC) (購自美國模式菌種收集中心),Ham′s F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng),置于恒溫培養(yǎng)箱 (37 ℃,5%CO2)。

1.2 方法

1.2.1 納米靜電紡絲纖維制備及凝血效率評估 制備Ⅰ型膠原蛋白(泉州久邦公司)和殼聚糖(北京索萊寶公司)混合溶液,經(jīng)高壓靜電紡絲后,將上述混合溶液與涂有PR1500膠(上海漢高公司)的海藻纖維(青島明月海藻集團)混合 24 h(60 Co,25 kGy)。

1.2.2 糖尿病創(chuàng)面小鼠建模及處理 小鼠腹腔連續(xù)注射鏈脲佐菌素5 d[15],在建模第3天空腹采血并測量血糖水平,若空腹血糖≥20 mmol/L則表明造模成功。用剃毛器和脫毛膏去除小鼠背毛,用剪刀制作直徑約8 mm的全層皮膚創(chuàng)面,構(gòu)建糖尿病創(chuàng)面小鼠模型。將小鼠隨機分為觀察組、對照組和自愈組,各10只。觀察組使用納米靜電紡絲纖維包扎創(chuàng)面,對照組使用涂藥紗布包扎創(chuàng)面,自愈組不做處理。

1.3 觀察指標

1.3.1 止血效果評估 將制備好的納米靜電紡絲纖維和涂藥紗布(1 cm×1 cm)分別放入燒杯中,37 ℃水浴5 min后加入50 μL新鮮抗凝小鼠血和20 μL氯化鈣溶液(0.2 moL/L),孵育5 min。加入25 mL去離子水后,讀取所得上清液在540 nm處的吸光度值,計算體外凝血指數(shù)(BCI)。

1.3.2 創(chuàng)面愈合評估 術(shù)后 3、5、7、9、11 d,分別觀察小鼠創(chuàng)面愈合情況。通過 Image J軟件測量創(chuàng)面面積。創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面總面積-未愈合面積)/創(chuàng)面總面積×100%。

1.3.3 炎癥因子檢測 術(shù)后3、6、9 d,通過尾靜脈收集小鼠靜脈血樣本。qRT-PCR法檢測白細胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-6和腫瘤壞死因子α (TNF-α)水平。Trizol提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳測量純度、濃度和完整性后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒(Takara Bio,日本)進行PCR擴增,反應條件:95 ℃ 60 s,95 ℃ 30 s,60 ℃ 40 s,共40 個循環(huán)。所有樣本均重復檢測3次。以β-actin作為內(nèi)參,2-△△ct法計算mRNA相對表達量。相關(guān)引物序列見表1。

表1 炎癥因子引物序列(5′-3′)

1.3.4 表皮生長因子(EGF)蛋白濃度檢測 術(shù)后第11天處死小鼠,取創(chuàng)面組織制備組織勻漿。通過Western blotting法檢測EGF、表皮生長因子受體(EGFR)、缺氧誘導因子-1α (HIF-1α)、增殖細胞核抗原 (PCNA) 蛋白表達水平。

1.4 納米靜電紡絲纖維對HUVECs生物學行為影響評估 將與48孔板尺寸相同的納米靜電紡絲纖維經(jīng)乙醇消毒后放置在板底部,以1.5×104/孔的密度接種HUVEC。在培養(yǎng)24、48、72 h,分別加入10 μL CCK-8溶液,并測量450 nm處吸光度值。將納米靜電紡絲纖維干預下HUVECs生長曲線與正常條件下生長曲線進行比較。使用移液器吸頭在細胞培養(yǎng)24 h時劃痕,PBS去除漂浮細胞,將 HUVEC與納米靜電紡絲纖維共培養(yǎng)6 h。并設無干預組,鏡下分別觀察HUVECs在納米靜電紡絲纖維干預下和無干預條件下的劃痕寬度。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 靜電紡納米纖維止血效果 電紡納米纖維呈圓形,在掃描顯微鏡下排列緊密(見圖1)。觀察組納米靜電紡絲纖維BCI 為(32.62±6.26)%,明顯低于對照組涂藥紗布的(72.63±6.41)%(t=14.12,P<0.01)。

2.2 3組小鼠創(chuàng)面愈合率比較 3組小鼠均未發(fā)生創(chuàng)面感染、化膿。術(shù)后3 d,3組創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);術(shù)后5 d,觀察組創(chuàng)面愈合率高于自愈組(P<0.05);術(shù)后7、9、11 d,觀察組創(chuàng)面愈合率均高于對照組和自愈組(P<0.05),對照組亦均高于自愈組(P<0.05)(見表2)。

表2 3組小鼠創(chuàng)面愈合率比較

2.3 3組小鼠炎癥因子比較 術(shù)后3 d,3組各炎癥因子指標間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術(shù)后6、9 d,觀察組IL-1β mRNA、IL-6 mRNA和TNF-α mRNA均低于對照組和自愈組(P<0.05),而 IL-4 mRNA均高于對照組和自愈組(P<0.05);除術(shù)后6 d IL-1β mRNA與自愈組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外,對照組術(shù)后6、9 d各炎癥因子指標與自愈組差異亦均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 3組不同時點炎癥因子指標比較

2.4 3組小鼠創(chuàng)面組織EGF和EGFR水平比較 觀察組EGF和EGFR水平均高于自愈組和對照組(P<0.05),對照組亦均高于自愈組(P<0.05)(見表4)。

表4 3組小鼠EGR和EGFR水平比較

2.5 3組小鼠HIF-1α和PCNA比較 觀察組HIF-1α均低于對照組和自愈組(P<0.05),對照組亦低于自愈組(P<0.05);觀察組PCNA均高于對照組和自愈組(P<0.05),對照組亦高于自愈組(P<0.05)(見表5)。

表5 3組小鼠HIF-α 和PCNA比較

2.6 納米靜電紡絲纖維對HUVECs生物學行為的影響 納米靜電紡絲纖維干預后,HUVECs增殖、遷移能力均提高(P<0.05和P<0.01),凋亡率降低(P<0.05)(見表6)。

表6 納米靜電紡絲纖維對HUVEC增殖、遷移和凋亡的影響

3 討論

糖尿病病人創(chuàng)面由于處于高糖環(huán)境下,通常難以愈合[16]。雖然國內(nèi)外學者對糖尿病創(chuàng)面愈合進行了多項研究[17-19],但目前尚較少涉及納米材料的應用。本研究結(jié)果顯示,納米靜電紡絲纖維較傳統(tǒng)藥用紗布具有更高的凝血效率,這與之前的研究[20-22]一致。納米靜電紡絲纖維具有與人體器官組織相似的結(jié)構(gòu),具有較高的生物相容性和可降解性,可加快創(chuàng)面組織的吸收利用[22],在生物醫(yī)學方面取得了顯著成果[24-25]。本研究結(jié)果顯示,觀察組小鼠創(chuàng)面愈合率亦均高于對照組和自愈組,提示納米靜電紡絲纖維能有效促進糖尿病創(chuàng)面愈合。

納米靜電紡絲纖維促進糖尿病創(chuàng)面愈合中的具體分子機制尚待探索,為了更好地了解其功效,本研究小鼠體內(nèi)幾種常見炎性細胞因子水平進行檢測,結(jié)果顯示,觀察組小鼠促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均低于對照組和自愈組,抑炎因子IL-4水平均高于對照組和自愈組,提示納米靜電紡絲纖維對糖尿病創(chuàng)面組織中的炎癥反應具有抑制作用。研究[26]顯示,創(chuàng)面愈合過程中炎癥反應易導致組織感染和愈合受限。納米靜電紡絲纖維的帶電粒子可以誘導巨噬細胞活化,減輕炎癥反應并提高對感染的抵抗力,繼而改善創(chuàng)面愈合[27]。本研究結(jié)果還顯示,觀察組EGF和EGFR水平均高于對照組和自愈組,進一步佐證了研究結(jié)論。

HIF-1α作為一種異源二聚體構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子,已被證實與組織缺氧、炎癥和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[28]。正常生理條件下,HIF-1α含量極低而無法被檢測到。而一旦組織、器官或細胞發(fā)生缺氧,HIF-1α亞基的降解能力明顯受限,形成HIF-1促進核轉(zhuǎn)錄活性[29]。本研究中,觀察組小鼠HIF-1α均低于對照組和自愈組,提示納米靜電紡絲纖維可有效抑制HIF-1α表達,有助于改善創(chuàng)傷性缺氧。這與既往靜電紡絲通過調(diào)節(jié)細胞的氧化平衡來促進傷口修復的研究[30]結(jié)論一致。而PCNA在真核細胞中作為DNA聚合酶的輔助因子,對DNA復制具有重要意義[31]。臨床上常將PCNA作為反映細胞增殖能力的分子標志物。本研究中,觀察組小鼠PCNA明顯較對照組和自愈組升高,提示納米靜電紡絲纖維干預下細胞增殖能力得到提高,這可能也是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵。為了驗證納米靜電紡絲纖維對細胞活性的確切影響,我們進一步進行了體外實驗,結(jié)果顯示,納米靜電紡絲纖維干預后HUVECs的增殖和遷移能力得到改善,凋亡率降低,提示其可能可激活內(nèi)皮細胞并增加細胞自愈能力。我們推測該機制可能與上述動物實驗結(jié)論一致,但由于缺乏更詳細的實驗支持,尚無法完全確定。

綜上,納米靜電紡絲纖維可能通過抑制炎癥反應和組織缺氧,上調(diào)EGF表達,促進糖尿病創(chuàng)面愈合,具有潛在的臨床應用前景。本研究尚存在以下不足,首先,我們只通過鏈脲佐菌素注射建立了1型糖尿病小鼠模型,而臨床上則以2型糖尿病更為常見,尚需更深入的實驗來分析納米靜電紡絲纖維對2型糖尿病創(chuàng)面愈合的影響;其次,有關(guān)電紡納米纖維的研究尚較少,目前尚無法完全確定電紡是否影響創(chuàng)面愈合;再次,本研究僅針對糖尿病小鼠,尚無法明確電紡納米纖維對其他疾病中創(chuàng)面愈合有何影響;最后,尚需進一步臨床試驗來探討納米靜電紡絲纖維對人體糖尿病創(chuàng)面愈合的效果。由于上述局限,我們將盡快開展針對性實驗和分析,以期獲得更有效的實驗結(jié)果供臨床參考。