circBACH1靶向miR-4500調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌HSC3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的分子機(jī)制研究

胡 洋,賈崴崴,柳星光,王立威,王曉亭

口腔鱗狀細(xì)胞癌是常見的一種口腔頜面部惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),臨床主要采用手術(shù)、放療、化療相結(jié)合等方式進(jìn)行治療,但口腔鱗狀細(xì)胞癌病人5年生存率較低且病人預(yù)后較差,目前口腔鱗狀細(xì)胞癌的致病機(jī)制尚未完全闡明,因而深入探究口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)探討新的治療方式具有重要意義[1]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)與線性RNA分子不同,其不具有5′端帽子與3′尾巴結(jié)構(gòu),而是以共價(jià)鍵結(jié)合的方式形成的一種環(huán)狀RNA分子,其具有高度穩(wěn)定性、保守性與組織特異性,近年來(lái),隨著對(duì)circRNA的深入研究發(fā)現(xiàn),circRNA可通過(guò)與微小RNA(miRNA)結(jié)合而調(diào)控靶基因的功能從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),進(jìn)而參與口腔鱗狀細(xì)胞癌等多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程[2-4]。circBACH1(ID:hsa_circ_0061395)在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá),干擾其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。但circBACH1與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)研究尚未見報(bào)道。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析顯示,circBACH1與miR-4500存在結(jié)合位點(diǎn),但二者是否存在靶向結(jié)合關(guān)系尚需進(jìn)一步驗(yàn)證,已有研究[6]表明miR-4500在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移。但miR-4500在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制尚未可知。因此,本研究主要探討circBACH1是否通過(guò)靶向調(diào)控miR-4500的表達(dá)影響口腔鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,為進(jìn)一步闡釋口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與試劑 收集2019年3月至2020年1月于我院接受手術(shù)治療切除的39例口腔鱗狀細(xì)胞癌病人的癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本,所有研究對(duì)象術(shù)前均未接受放療、化療等治療,且均未合并其他惡性腫瘤,其中男20例,女19例,年齡45～67歲。病人或其近親屬知情同意,本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

人口腔鱗狀細(xì)胞癌HSC3細(xì)胞購(gòu)自上海通派生物;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco;LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;circBACH1小分子干擾RNA(si-circBACH1)及其陰性對(duì)照(si-NC)、miR-4500寡核苷酸模擬物(miR-4500 mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)、miR-4500特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-4500)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購(gòu)自廣州銳博生物;pcDNA、pcDNA-circBACH1購(gòu)自上海吉滿生物;Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher;反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Green試劑購(gòu)自北京天根生化;CCK-8試劑、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京索萊寶;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning;兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗體與二抗購(gòu)自美國(guó)Santan Cruz。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 用不含血清的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋si-NC、si-circBACH1、miR-NC、miR-4500 mimics、si-circBACH1與anti-miR-NC、si-circBACH1與anti-miR-4500后室溫孵育5 min,用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM3000 Transfection Reagent后室溫孵育5 min,將轉(zhuǎn)染物與轉(zhuǎn)染試劑稀釋液充分混勻后室溫孵育20 min,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC3細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)接種于6孔板,按照每孔200 μL將混合液加入6孔板的細(xì)胞中,6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,分別記為si-NC組、si-circBACH1組、miR-NC組、miR-4500組、si-circBACH1+anti-miR-NC組、si-circBACH1+anti-miR-4500組。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)circBACH1、miR-4500的表達(dá)水平 取口腔鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織與各組HSC3細(xì)胞,加入1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞,提取組織或細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:SYBR Green Master Mix 10 μL,正反向引物0.8 μL,cDNA 2 μL,ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40次循環(huán)。circBACH1以GAPDH為內(nèi)參基因,miR-4500以U6為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算circBACH1、miR-4500相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組HSC3細(xì)胞按照每孔3 000個(gè)接種于96孔板中,于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將各組HSC3細(xì)胞按照每孔200個(gè)接種于6孔板中,每隔48 h更換1次培養(yǎng)液,培養(yǎng)14 d,用PBS洗滌細(xì)胞,4%多聚甲醛固定15 min,然后加入0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min,流水洗滌染色液,空氣干燥后于顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 取各組HSC3細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)密度接種于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%時(shí)用200 μL移液槍槍頭在細(xì)胞層上沿著培養(yǎng)孔的直徑劃線,PBS洗去劃掉的細(xì)胞,于顯微鏡下拍照并記為0 h,然后將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,在顯微鏡下拍照,用ImageJ軟件計(jì)算劃痕寬度并計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 Matrigel基質(zhì)膠稀釋液平鋪于小室的上室,加入培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h,取各組HSC3細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/mL)100 μL接種于小室的上室,下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基,于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后除去上室上膜面的非侵入細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定20 min,用0.5%結(jié)晶紫染色液染色10 min,于顯微鏡下觀察下室細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circBACH1與miR-4500的靶向關(guān)系 用StarBase在線工具預(yù)測(cè)circBACH1與miR-4500存在結(jié)合位點(diǎn),采用PCR與overlap PCR分別擴(kuò)增包含與miR-4500結(jié)合位點(diǎn)野生型和突變型的circBACH1片段,構(gòu)建野生型報(bào)道基因載體WT-circBACH1與突變型報(bào)告基因載體MUT-circBACH1,分別與miR-4500 mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染至HSC3細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將pcDNA、pcDNA-circBACH1、si-NC、si-circBACH1轉(zhuǎn)染至HSC3細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,采用qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-4500的表達(dá)量。

1.2.8 Western blotting檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)量 用PBS分別洗滌各組HSC3細(xì)胞,分別在細(xì)胞內(nèi)加入RIPA裂解液,將其置于冰上孵育20 min,然后轉(zhuǎn)移至離心機(jī)內(nèi)以12 000×g離心10 min,用移液槍吸取蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度,按照每個(gè)泳道加入40 μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳凝膠,在上樣前需要將蛋白樣品與上樣緩沖液按照等體積充分混勻,并在100 ℃沸水中孵育5 min,電泳結(jié)束后取出凝膠,然后90 V電壓條件下凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉封閉2 h,加入E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)一抗稀釋液,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌,加入二抗稀釋液(1∶4 000),室溫孵育1 h,滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑,暗室內(nèi)曝光顯影,用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 circBACH1和miR-4500在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較,口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中circBACH1的表達(dá)量明顯升高(P<0.01),miR-4500的表達(dá)量明顯降低(P<0.01)(見表1)。

表1 circBACH1和miR-4500在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

2.2 干擾circBACH1表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 與si-NC組比較,si-circBACH1組HSC3細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01),細(xì)胞克隆形成數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.01),劃痕愈合率和N-cadherin蛋白水平均明顯降低(P<0.01),E-cadherin蛋白水平明顯升高(P<0.01)(見表2、圖1)。

表2 干擾circBACH1表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及遷移與侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 miR-4500過(guò)表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 與miR-NC組比較,miR-4500組HSC3細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01),細(xì)胞克隆形成數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.01),劃痕愈合率和N-cadherin蛋白水平均明顯降低(P<0.01),E-cadherin蛋白水平明顯升高(P<0.01)(見表3、圖2)。

表3 miR-4500過(guò)表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及遷移與侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 circBACH1靶向調(diào)控miR-4500的表達(dá) StarBase預(yù)測(cè)顯示circBACH1與miR-4500存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖3)。WT-circBACH1與miR-4500 mimics共轉(zhuǎn)染組HSC3細(xì)胞的熒光素酶活性明顯低于WT-circBACH1與miR-NC共轉(zhuǎn)染組(P<0.01)(見表4)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與pcDNA組比較,pcDNA-circBACH1組miR-4500的表達(dá)量降低(P<0.05);與si-NC組比較,si-circBACH1組miR-4500的表達(dá)量升高(P<0.05)(見表5)。WT-circBACH1與miR-4500 mimics共轉(zhuǎn)染組HSC3細(xì)胞的熒光素酶活性明顯低于WT-circBACH1與miR-NC共轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 circBACH1調(diào)控miR-4500的表達(dá)

2.5 下調(diào)miR-4500表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circBACH1表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用 與si-circBACH1+anti-miR-NC組比較,si-circBACH1+anti-miR-4500組HSC3細(xì)胞活力明顯升高(P<0.01),細(xì)胞克隆形成數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增多(P<0.01),劃痕愈合率和N-cadherin蛋白水平均明顯升高(P<0.01),E-cadherin蛋白水平明顯降低(P<0.01),(見圖4、表6)。

表6 下調(diào)miR-4500表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circBACH1表達(dá)對(duì)HSC3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及遷移與侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率占全身惡性腫瘤的3%左右,酒精、煙草等均可能是口腔鱗狀細(xì)胞癌重要的致病誘因,隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展,分子靶向治療、基因治療等均已成為治療腫瘤的新型治療方式,因而尋找口腔鱗狀細(xì)胞癌分子治療的潛在靶點(diǎn)成為研究重點(diǎn),越來(lái)越多的研究表明circRNA在口腔鱗狀細(xì)胞癌中異常表達(dá),并可能作為口腔鱗狀細(xì)胞癌治療的潛在靶點(diǎn),circRNA是由外顯子與內(nèi)含子剪切形成的環(huán)化轉(zhuǎn)錄物序列,其與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,例如,circ_0011946通過(guò)上調(diào)PCNA促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲[7]。circPHIP通過(guò)充當(dāng)miR-142-5p的海綿分子而調(diào)節(jié)PHIP和ACTN4的表達(dá)從而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[8]。circMDM2通過(guò)調(diào)控miR-532-3p/HK2而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞糖酵解及細(xì)胞轉(zhuǎn)移[9]。circRNA ITCH通過(guò)調(diào)節(jié)miR-421/PDCD4軸抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖,而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。circ-PKD2通過(guò)調(diào)控miR-204-3p/APC2軸而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[11]。circRNA_101036通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。但circRNA在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的報(bào)道相對(duì)較少。

circBACH1在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),并可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成[13]。但circBACH1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)尚未可知。本研究結(jié)果顯示,口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中circBACH1的表達(dá)量明顯高于癌旁組織,干擾circBACH1表達(dá)后口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞活力明顯降低,細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少,提示干擾circBACH1表達(dá)可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及克隆形成。E-cadherin作為上皮細(xì)胞標(biāo)志物,其表達(dá)失調(diào)可促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展,而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin的作用與之相反[14-15]。本研究結(jié)果顯示,干擾circBACH1表達(dá)后口腔鱗狀細(xì)胞癌侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少,劃痕愈合率和N-cadherin蛋白水平均明顯降低,E-cadherin蛋白水平明顯升高,提示干擾circBACH1表達(dá)可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲。

為進(jìn)一步探究circBACH1調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制,本研究證實(shí)circBACH1可靶向結(jié)合miR-4500,并可負(fù)向調(diào)控miR-4500的表達(dá)。提示circBACH1可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-4500的表達(dá)從而發(fā)揮癌基因作用。研究[16]表明,miR-4500在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低,抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-4500在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[17]。circPLK1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-4500/IGF1軸而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18]。本研究結(jié)果顯示,口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-4500的表達(dá)量明顯低于癌旁組織,抑制miR-4500表達(dá)可拮抗干擾circBACH1表達(dá)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用。

綜上所述,口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中circBACH1的表達(dá)量升高,而miR-4500的表達(dá)量降低,干擾circBACH1表達(dá)可通過(guò)上調(diào)miR-4500的表達(dá)從而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌HSC3細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲,circBACH1可能成為口腔鱗狀細(xì)胞癌潛在治療靶點(diǎn)。目前circBACH1在口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究尚處于探索階段,其是否可通過(guò)靶向結(jié)合其他miRNA而發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步探究。