臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)體系的篩選

肖 瓊,黃象艷,劉 宣,曲偉紅

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是起源于胚胎發(fā)育早期中胚層的干細胞,也是機體含量最豐富的干細胞類型,具有支持造血、多向分化、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)等作用[1],正是因為它的分化能力和再生潛力使其大量應(yīng)用于干細胞研究和再生醫(yī)學中,用來治療一些疑難雜癥和組織器官修復或重建、抗衰老以及美容等。

MSCs屬于成體干細胞,可從骨髓、臍帶、臍血、胎盤、脂肪等組織中分離,但從這些組織中獲取的MSCs的原始數(shù)量較少,而臨床應(yīng)用時必須移植足夠數(shù)量的干細胞才有療效,所以體外培養(yǎng)擴增MSCs尤為重要,不僅要滿足臨床需要的數(shù)量,還要保證細胞產(chǎn)品的安全性。但目前關(guān)于MSCs的培養(yǎng)沒有標準的培養(yǎng)體系,常用的MSCs的培養(yǎng)體系分為:含有胎牛血清的培養(yǎng)基、無胎牛血清培養(yǎng)基。含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSCs應(yīng)用于臨床有一定局限性[2],無血清培養(yǎng)基越來越受到重視。目前,市面上無血清培養(yǎng)基品種多,質(zhì)量存在較大的差異,導致MSCs的質(zhì)量不可控,且培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基添加物的理化性質(zhì)對MSCs的生物學特性有一定影響,因而選擇合適的培養(yǎng)基是MSCs發(fā)揮治療效應(yīng)的前提。本研究采用不同的商品化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶MSCs,以篩選建立安全穩(wěn)定、快速高效且經(jīng)濟的體外擴增培養(yǎng)體系,在滿足MSCs數(shù)量的同時,又能夠維持其分化能力。

1 材料與方法

1.1 材料 選用健康新生兒臍帶樣本,解放軍聯(lián)勤保障部隊九六〇醫(yī)院婦產(chǎn)科提供,產(chǎn)婦均簽署知情同意書,實驗獲得該醫(yī)院倫理委員會批準。MSCs無血清培養(yǎng)基(STEMCELL Technologies,TBD,Lonza),成骨分化誘導培養(yǎng)基、成軟骨分化誘導培養(yǎng)基(stemcell),CD105單克隆抗體(Beckman),CD90單克隆抗體、CD73單克隆抗體、CD34單克隆抗體、CD45單克隆抗體(美國BD公司),HLA-DR單克隆抗體(美國eBiosience公司),CCK-8(上海碧云天生物技術(shù)),油紅O、茜素紅(北京索萊寶生物科技)。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶MSCs的原代分離及擴增培養(yǎng) 無菌條件下剝離臍帶外膜,并將臍動脈和靜脈去除,用PBS充分沖洗后將其剪碎至約1 mm3大小組織塊,再用PBS多次沖洗,將剪碎的臍帶組織塊隨機分為9份接種至9個培養(yǎng)瓶,再將9個培養(yǎng)瓶隨機分為A組、B組、C組,每組3瓶。A組、B組、C組分別加MesenCult、Ultraculture、AM-V無血清培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3～5 d更換培養(yǎng)基1次,并記錄細胞爬出的時間,觀察細胞的生長狀態(tài)。待細胞密度達到約80%后移除組織塊,進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MSCs生長曲線的測定 3組臍帶MSCs用0.25%胰蛋白酶消化,培養(yǎng)基重懸計數(shù)后,每孔約2×104個細胞接種于7個96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)3個復孔,置于37 ℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于24 h后取第一塊培養(yǎng)板,每孔避光加入10 μL CCK8溶液,2.5 h后用酶標儀在450 nm波長條件下檢測吸光度(OD)值,48 h后取第二塊培養(yǎng)板,以此類推,每24 h按以上步驟檢測OD值。

1.2.3 MSCs表面抗原的檢測 3組臍帶MSCs,用0.25%胰蛋白酶消化并離心,PBS清洗3遍,用PBS重懸細胞調(diào)整密度為1×106個/mL,分別吸取100 μL加入10 mL的流式檢測管中,然后加入適量PE和FITC標記的CD105、CD90、CD73、CD34、CD45、HLA-DR的抗體,同時設(shè)陰性對照。常溫下避光孵育20 min,PBS沖洗2次,每管加入500 μL PBS重懸細胞,用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 細胞誘導分化能力檢測 3組均取第1代至第5代的臍帶MSCs,以1×105/mL的密度接種24孔板,每孔接種0.5 mL,于細胞融合度達到60%時去掉原培養(yǎng)基,PBS洗滌2次,分別用成脂誘導培養(yǎng)基和成骨誘導培養(yǎng)基誘導分化,每3～4 d更換培養(yǎng)液1次,前者在誘導培養(yǎng)第14天用油紅-O染色,后者在28 d用茜素紅染色,倒置顯微鏡觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 臍帶原代MSCs的生長時間及形態(tài)學觀察 組織塊接種第6～7天,倒置相差顯微鏡下觀察可見B、C組有少量短梭形細胞從組織塊邊緣游出,散在分布。第10天時已有大量細胞爬出,并呈單層梭型不規(guī)則樣生長,放射狀排列,組織塊之間亦可見大量細胞。B組組織塊邊緣的MSCs于第14天長至融合狀態(tài),成旋渦狀生長,細胞折光性好,大小均一,而C組細胞細長,折光性稍差,無明顯的旋渦狀生長的特征。A組在培養(yǎng)第17天時僅見少量短梭形或不規(guī)則形細胞從組織塊邊緣游出,折光性好。培養(yǎng)第28天后組織塊邊緣的MSCs成旋渦狀生長至融合狀態(tài)。3組原代MSCs形態(tài)和融合狀態(tài)見圖1～3。

2.2 3組MSCs的生長情況 3組臍帶MSCs在傳代后第1～2天增殖不明顯,為細胞適應(yīng)期;第3～6天進入對數(shù)生長期,之后進入平臺期。第3代MSCs OD值顯示,培養(yǎng)第3天、第5天,B組和C組OD值均高于A組(P<0.05);培養(yǎng)第7天,3組OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);每組內(nèi)細胞和第7天的OD值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各組MSCs培養(yǎng)第5天OD值高于第3天(P<0.05),培養(yǎng)第7天OD值高于第3天和第5天(P<0.05)(見表1)。

表1 3組臍帶MSCs傳代培養(yǎng)OD值比較

2.3 MSCs表面抗原表達情況 3組第3代臍帶MSCs均表達CD105、CD90和CD73,表達率均在95%以上,CD34、CD45和HLA-DR未表達或弱表達,表達率均在2%以下;3組各標志物的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2),圖4為A組MSCs表面抗原表達情況的代表圖。

表2 3組臍帶MSCs表面抗原表達率比較

2.4 MSCs分化能力 3組MSCs經(jīng)成骨誘導體系誘導2周后,細胞基質(zhì)可見粗糙的顆粒樣沉積,誘導4周后進行茜素紅染色,可見紅色的礦化結(jié)節(jié)沉積,A、B組鈣鹽沉淀較C組多(見圖5)。經(jīng)成脂誘導體系誘導7～10 d后,在光鏡下可看見微小明亮的脂肪滴,誘導至14 d,融合的脂肪滴充滿整個細胞,油紅-O染色呈明亮的橙紅色,A、B組脂滴分布較C組密集(見圖6)。

3 討論

MSCs是近年來細胞治療和再生醫(yī)學的研究熱點,研究已證實MSCs存在于人體多種組織中,不同組織來源的MSCs均具有相似的生物學特性[3]。特定的環(huán)境下,MSCs能夠向骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等多種組織細胞進行分化,可以作為細胞替代治療的種子細胞,以替換或再生受損的組織。MSCs治療缺損性疾病時通過旁分泌作用或細胞分化發(fā)揮作用[4-5]。研究[6-9]顯示,MSCs對心肌梗死、糖尿病足、腦損傷、脊髓損傷等疾病的修復顯示出良好的效果。由于其強大的修復潛力,MSCs應(yīng)用于不斷擴大的臨床適應(yīng)證,特別是骨、軟骨和關(guān)節(jié)損傷的修復,已有研究[10-11]證實MSCs作為組織工程的種子細胞治療骨和軟骨缺損是安全和有效的,治療骨折后不愈合及骨不連病人已能達到臨床愈合的標準[12-13]。在脂肪組織工程領(lǐng)域MSCs也有巨大的研究價值,很多學者將MSCs和自體脂肪共移植用于醫(yī)學整形和美容,相比于單獨的脂肪細胞移植,MSCs和自體脂肪共移植使得移植的脂肪細胞存活率升高,減少了脂肪細胞的液化和重吸收,提高了塑形效果,減少了手術(shù)次數(shù),減輕了病人的痛苦。

隨著研究的深入,MSCs產(chǎn)品最終會用于人體治療多種疾病,因此,必須建立可控的培養(yǎng)體系,確保MSCs產(chǎn)品的安全性、有效性及穩(wěn)定性。當前,MSCs的培養(yǎng)體系分為:含胎牛血清的培養(yǎng)基、無胎牛血清的培養(yǎng)基。添加胎牛血清的培養(yǎng)基被認為是體外擴增MSCs最有效的培養(yǎng)基[14],因為胎牛血清中含有許多對細胞生長有利的成分,提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì),促進細胞生長,另一方面,血清中異種蛋白的免疫原性,潛在的病原體等使其生物安全性受到人們普遍質(zhì)疑[15],在生產(chǎn)臨床級別的人用細胞產(chǎn)品時,理論上會導致這些病原體的傳播。此外,細胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子細胞內(nèi)在化,當進行細胞移植時將導致宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng),限制了臍帶MSCs在臨床的應(yīng)用。

無血清培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基的一種,不含任何動物血清成分,只添加細胞生長所需的營養(yǎng)成分和生長因子的培養(yǎng)基,這種培養(yǎng)基成分均為已知,因而能夠避免異種血清所帶來的異源性污染[16],但是不同商品的無血清培養(yǎng)基養(yǎng)份含量不同,則會導致細胞生長效果不同,或蛋白表達不同,有實驗數(shù)據(jù)顯示細胞在無血清培養(yǎng)體系中隨傳代次數(shù)遞增擴增效率下降,細胞生長緩慢,難以維持干細胞的特性,因而影響治療功能[17]。因此,選擇適合MSCs培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)體系,仍是目前工作的重心所在。

本研究中選用了國內(nèi)外3種不同的無血清培養(yǎng)基,其中2種為國外干細胞領(lǐng)域知名公司生產(chǎn)的,一種為國內(nèi)知名企業(yè)生產(chǎn)的,3種培養(yǎng)基中未添加其他任何生長因子。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)臍帶MSCs,A組培養(yǎng)基培養(yǎng)原代臍帶MSCs時,細胞從組織塊游出時間較B組和C組長,而C組從組織塊游出的細胞形態(tài)不如A組和B組,尤其是融合后未呈現(xiàn)典型的MSCs的形態(tài)。3組獲得的原代細胞能夠連續(xù)傳代,傳代后細胞能夠大量增殖。經(jīng)流式細胞儀檢測,3組MSCs在表型方面無顯著性差異,不表達造血細胞標志CD34、CD45,表明 MSCs是區(qū)別于造血細胞的另一種處于未分化狀態(tài)的非定向干/祖細胞,不表達HLA-DR,說明MSCs的免疫原性低,表達CD105、CD90和CD44,說明MSCs的干性保持良好。3組MSCs經(jīng)成骨和成脂肪誘導后,茜素紅和油紅-O染色均呈陽性,表明無血清培養(yǎng)基擴增后的臍帶MSCs具有分化成骨和脂肪細胞的能力。A組和B組染色陽性的細胞多于C組,說明A組和B組細胞分化能力高于C組。這些結(jié)果證明3組無血清培養(yǎng)基能夠在體外進行臍帶MSCs的原代和傳代培養(yǎng),培養(yǎng)的細胞仍能保持其多向分化的潛能。但是三種培養(yǎng)基培養(yǎng)原代細胞時間長短不一,分化能力亦不同,這種差異可能是培養(yǎng)基中的因子種類和濃度導致的。MSCs分化功能和所處的微環(huán)境有關(guān),不同的外源基因激活和不同的細胞因子作用,均可導致其向不同的細胞系分化。本研究中的結(jié)果提示不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞分化方向和分化能力不同,這為臨床細胞治療提供了思路,因為不同的組織工程應(yīng)用不同分化的細胞,選擇利于向某種細胞分化的培養(yǎng)基能大大提高細胞的分化率,從而提高治療效果。

本研究中的3種培養(yǎng)基,培養(yǎng)原代臍帶MSCs用時較短的是B組和C組,分化潛能較大的是A組和B組,因此,B組培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶MSCs用時短,細胞干性維持好,分化率高,價格適中,在目前階段可以作為臨床級人臍帶MSCs培養(yǎng)體系的理想選擇。用此培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶MSCs的安全性和有效性如何,還需要進一步研究。