KRT81在乳腺癌組織中的表達(dá)及其調(diào)控AKT/mTOR通路影響糖代謝抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用

王 騰,張 暉

乳腺癌是全球女性最常見的致命癌癥[1]。盡管各種治療方法取得了進(jìn)展,但乳腺癌仍然是女性腫瘤相關(guān)死亡的第二個(gè)主要原因[2-3]。輔助治療、根治性手術(shù)和早期診斷可提高乳腺癌病人的生存時(shí)間和預(yù)后,但死亡率仍不能令人滿意[4]。為了制定實(shí)用的治療策略,迫切需要全面了解乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的分子信號(hào)傳導(dǎo)[5]。

角蛋白是一種在特定區(qū)域的表皮細(xì)胞中表達(dá)的中間絲。大的角蛋白多基因家族由細(xì)胞角蛋白組成,它們?cè)诟鞣N類型的上皮中差異表達(dá)[6-8]。角蛋白81(KRT81)是一種Ⅱ型頭發(fā)角蛋白,是頭發(fā)皮質(zhì)中表達(dá)的主要頭發(fā)蛋白質(zhì)之一。據(jù)報(bào)道[9],KRT81表達(dá)在黑色素瘤組織中上調(diào),在人黑色素瘤細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)了KRT81的過(guò)表達(dá),并且KRT81通過(guò)調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素8(IL-8)來(lái)抑制黑素瘤的進(jìn)展。然而,截至目前KRT81在乳腺癌組織中的表達(dá)及對(duì)乳腺癌的影響機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。因此,本研究分析KRT81在乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理因素的相關(guān)性,體外實(shí)驗(yàn)觀察KRT81調(diào)控AKT/mTOR通路影響糖代謝從而干預(yù)乳腺癌細(xì)胞的增殖,為尋找較為特異的分子標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2016-2021年就診于我院的100例乳腺癌病人的腫瘤和癌旁組織(距離腫瘤>4 cm)的標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病理學(xué)診斷為乳腺癌;(2)術(shù)前未放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)非原發(fā)性乳腺癌;(2)失訪及預(yù)后信息不全者。根據(jù)病人信息電話隨訪,日期至2021年12月。

1.2 免疫組織化學(xué)分析 病人組織經(jīng)過(guò)低溫保存固定后,石蠟包埋。并收集相關(guān)臨床資料,包括年齡、腫瘤大小、雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人類表皮生長(zhǎng)因子-2(epidermal growth factor-2,Her2)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織分級(jí)、生存時(shí)間和預(yù)后結(jié)局。腫瘤組織經(jīng)過(guò)兩位病理學(xué)專家診斷為乳腺癌,免疫組織化學(xué)檢測(cè)KRT81的表達(dá)和位置。判定標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)染色強(qiáng)度和染色范圍判定結(jié)果。其中染色強(qiáng)度,根據(jù)顏色分為無(wú)染色(0分),淡黃色(1分),棕黃色(2分),深棕色(3分);染色范圍為0分(0～10%)、1分(>10%～25%)、2分(>25%～50%)、3分(>50%～76%)和4分(>75%～100%)。用染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞數(shù)得分的作為判斷表達(dá)結(jié)果,積分0～4分為陰性,>4～12分為陽(yáng)性。本研究獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),并且所有病人知情同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及主要試劑 乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231和人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。使用含10%胎牛血清(FBS)和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

KRT81過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-KRT81-Flag)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司,一抗(KRT81、GAPDH、GLUT1、LDH、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Bax、Bcl2)均購(gòu)買于Abcam公司,二抗購(gòu)于武漢三鷹生物科技有限公司,蛋白印跡試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)量試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司,CCK8購(gòu)自Biofroxx公司。Transwell購(gòu)自NEST公司。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,于轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞以3.0×104個(gè)/孔接種于6孔板;轉(zhuǎn)染時(shí)按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書,MCF-7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒、對(duì)照敲低質(zhì)粒、敲低質(zhì)粒,記作oeKRT81、NC、Control及si-KRT81組。轉(zhuǎn)染時(shí)加入相應(yīng)試劑并混合均勻,將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基,5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基,然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組: NC組、oeKRT81組、Control組、si-KRT81組。

1.5 細(xì)胞集落克隆形成實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化離心后,以1 000/孔的密度種植于6孔板中,加入含10% FBS的培養(yǎng)基,隨后培養(yǎng)10 d。去上清,加入4%的多聚甲醛固定30 min,加入1∶8稀釋的結(jié)晶紫染液,染色30 min,PBS沖洗3～4遍,拍照計(jì)數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取處理好的細(xì)胞懸浮液,密度為40×104個(gè)/毫升,種植于6孔板中,培養(yǎng)24 h后換液,換取不含血清的培養(yǎng)基并按照處理要求轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后培養(yǎng)48 h,采用不含EDTA的胰酶消化,并離心(2 500 r/min),收集細(xì)胞用PBS重懸后,繼續(xù)離心(2 500 r/min),隨后按照凋亡試劑盒操作指南依次加入試劑,上機(jī)檢測(cè)。

1.7 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞,用RIPA裂解液提取總蛋白裂解物,用于蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將等量配置好的蛋白質(zhì)(40 μg)加載到凝膠上,在10%凝膠上電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用TBST洗膜5 min,共3次,用5%脫脂牛奶溶液封閉1 h,然后與一抗孵化,4 ℃孵育過(guò)夜。第二天用TBST溶液清洗膜3次,再與二抗在37 ℃下孵育1 h。用TBST溶液清洗膜3次,曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌病人的組織樣本中KRT81的表達(dá)情況及與病理特征的相關(guān)性 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,KRT81蛋白在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯低于癌旁正常組織(P<0.01)(見表1、圖1)。臨床資料結(jié)合免疫組織化學(xué)結(jié)果分析顯示,Her2為陽(yáng)性時(shí)KRT81表達(dá)升高;TNM分期越大,KRT81的表達(dá)越低;當(dāng)病人有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí),KRT81的表達(dá)越低;組織分級(jí)越高,KRT81的表達(dá)越低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見表2)。

表2 乳腺癌病人KRT81表達(dá)與臨床資料的關(guān)系(n)

2.2 KRT81在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平及轉(zhuǎn)染效率 相比于乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A,KRT81在乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)下降(P<0.05)(見表3、圖2A)。采用oeKRT81質(zhì)粒及si-KRT81質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)KRT81后,KRT81蛋白表達(dá)升高;敲低KRT81后,KRT81蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(見圖2B、2C、表4)。MCF-7細(xì)胞中KRT81表達(dá)水平最低,因此選用其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

表3 KRT81在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平比較

表4 KRT81在乳腺癌細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)染效率

2.3 KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞集落克隆形成能力的影響 細(xì)胞集落克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,oeKRT81組MCF-7細(xì)胞集落克隆數(shù)明顯低于NC組[(31.0±8.9)個(gè)vs(85.0±16.2)個(gè),t=4.78,P<0.01)];siKRT81組MCF-7細(xì)胞集落克隆數(shù)明顯高于Control組[(241.0±23.1)個(gè)vs(113.0±8.6)個(gè),t=8.99,P<0.01)](見圖3)。

2.4 KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 與NC組相比,oeKRT81組MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01);與Control組相比,si-KRT81組MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯減少(P<0.01)(見表5、表6、圖4A)。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,oeKRT81組MCF-7細(xì)胞中Bax蛋白水平明顯高于NC組,si-KRT81組Bax蛋白水平明顯低于Control組(P<0.01);oeKRT81組MCF-7細(xì)胞中Bcl2蛋白水平明顯低于NC組,si-KRT81組Bcl2蛋白水平明顯高于Control組(P<0.01)(見圖4B、圖4C、表5～6)。

表5 過(guò)表達(dá)KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表6 敲低KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 oeKRT81組MCF-7細(xì)胞中GLUT1、LDH水平均明顯低于NC組(P<0.01),si-KRT81組GLUT1、LDH水平均明顯高于Control組(P<0.01)(見圖5、表7～8)。

表7 敲低KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表8 過(guò)表達(dá)KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6 KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組比較,oeKRT81組MCF-7細(xì)胞中p-AKT、p-mTOR蛋白水平均明顯下降(P<0.01),而AKT、mTOR蛋白水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與Control組比較,si-KRT81組p-AKT、p-mTOR蛋白水平均明顯升高(P<0.01),而AKT、mTOR蛋白水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表9～10、圖6)。

表9 敲低KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表10 過(guò)表達(dá)KRT81對(duì)MCF-7細(xì)胞AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

乳腺癌是中國(guó)最常見的婦科腫瘤類型[10]。根據(jù)全球癌癥項(xiàng)目(GLOBOCAN,2020),2020年全球約有684 996例乳腺癌死亡[11]。盡管努力集中在診斷技術(shù)和病人管理上,但在提高乳腺癌病人的總體生存率方面進(jìn)展甚微[12]。此外,據(jù)報(bào)道[13],乳腺癌的發(fā)病率和死亡率有明顯上升的趨勢(shì)。 目前,乳腺癌治療包括手術(shù)在內(nèi)的綜合治療、放射療法、化學(xué)療法、內(nèi)分泌療法和生物靶向劑[14-15]。隨著診斷技術(shù)和治療方法的改進(jìn),乳腺癌相關(guān)死亡率隨著生存率的總體上升而下降。然而,晚期乳腺癌目前幾乎無(wú)法治愈,治療的主要目標(biāo)是姑息治療,重點(diǎn)是控制疾病的快速進(jìn)展、提高生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期[16]。盡管已經(jīng)開發(fā)出多種新的靶向藥物來(lái)治療乳腺癌病人;然而,特效藥物尚未出現(xiàn)。因此,有必要研究乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)。本研究細(xì)胞集落克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)KRT81可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,敲低KRT81促進(jìn)乳腺癌增殖,提示KRT81的表達(dá)水平可影響乳腺癌細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)及凋亡蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)KRT81可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡,敲低KRT81抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡。

KRT81是一種Ⅱ型頭發(fā)角蛋白,是頭發(fā)皮質(zhì)中表達(dá)的主要頭發(fā)蛋白質(zhì)之一。其已經(jīng)被證實(shí)在多種疾病中發(fā)揮重要作用[17-18]。然而,其在乳腺癌中的作用尚不清楚。本研究收集了100例乳腺癌病人病例資料,進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,乳腺癌組織蠟塊和與其相匹配的癌旁正常組織中,KRT81在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯低于癌旁正常組織。并且KRT81表達(dá)水平與Her2、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和組織分級(jí)相關(guān)。這些結(jié)果均提示KRT81對(duì)乳腺癌的預(yù)后具有影響。

癌細(xì)胞糖代謝的重要性主要體現(xiàn)在能量供應(yīng)維持其生命活動(dòng);生物合成為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂提供原料; 調(diào)節(jié)信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等重要生物學(xué)過(guò)程;免疫逃避逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。這種代謝重編程的特點(diǎn)是,即使在存在足夠氧氣的情況下,癌細(xì)胞或其他高度增殖的細(xì)胞也傾向于將葡萄糖代謝成乳酸,而不是丙酮酸(有氧糖酵解)[19]。糖代謝與腫瘤微環(huán)境的變化、癌基因和腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄、線粒體功能的調(diào)節(jié)以及糖代謝酶的異常表達(dá)密切相關(guān)。這種現(xiàn)象為癌細(xì)胞提供了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),幫助它們逃避凋亡并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[20]。本研究通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)糖代謝相關(guān)蛋白水平,相較于NC組,oeKRT81組MCF-7細(xì)胞中GLUT1、LDH蛋白表達(dá)均明顯下降;然而,相較于Control組,si-KRT81組GLUT1、LDH蛋白表達(dá)均明顯升高。結(jié)果說(shuō)明改變KRT81的表達(dá)水平,可影響細(xì)胞糖代謝過(guò)程。AKT/mTOR信號(hào)通路與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)[21-22]。在乳腺癌中,新型錳絡(luò)合物PdpaMn通過(guò)下調(diào)Akt/mTOR信號(hào)通路抑制糖酵解[23]。本研究中,敲低KRT81可上調(diào)Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白p-AKT和p-mTOR表達(dá),同時(shí),糖代謝相關(guān)蛋白GLUT1、LDH的表達(dá)量升高;過(guò)表達(dá)KRT81可抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白p-AKT和p-mTOR表達(dá),糖代謝相關(guān)蛋白GLUT1、LDH的表達(dá)量降低。

綜上所述, KRT81在乳腺癌組織中低表達(dá),且與乳腺癌病人的預(yù)后相關(guān)。同時(shí),KRT81可能通過(guò)抑制AKT/mTOR通路影響糖代謝抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,將為乳腺癌靶向治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。