嬰幼兒配方乳粉中葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株制備

張濤,張瑞,張子侖,李獻,祝巖波,劉雨蒙,張雅倫,周巍

(河北省食品檢驗研究院,河北省食品安全重點實驗室,國家市場監(jiān)管重點實驗室(特殊食品監(jiān)管技術), 特殊食品安全與健康河北省工程研究中心,河北 石家莊,050200)

葉酸(又稱為維生素B9)是一種在人體細胞分裂增殖及新陳代謝中發(fā)揮重要作用[1-2]的水溶性維生素[3]。動物肝臟和綠葉蔬菜含有十分豐富的天然葉酸[4]。葉酸缺乏可引起一系列的不良癥狀,如細胞性貧血[5-6]、骨關節(jié)炎、粒細胞減少[7]。葉酸含量還與新生兒神經(jīng)管畸形有關[8-10],含量過低可導致新生兒出生缺陷發(fā)生率上升[11],如泌尿道缺陷、肢體縮短缺陷、唇腭裂、先天性心臟病[12-14]。孕婦在懷孕期間一般需要補充葉酸[15-17],缺乏可引起早產(chǎn)[18-19]、流產(chǎn)[20]、妊娠期糖尿病[21]等不良妊娠反應。過量補充葉酸同樣會引起并發(fā)癥[22],影響人體對鋅的吸收,下一代易代謝異常[23]、患自閉癥[24-25]。因其具有特殊的功能,市場上出現(xiàn)很多添加葉酸的食品,其中最普遍的是嬰幼兒配方乳粉。檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量是否符合國家標準是保障食品安全的重要工作。

目前,葉酸檢測技術主要為微生物法、超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、光學生物傳感器法[26]。微生物法多用于測定低葉酸含量的食品;超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測范圍較小,僅可測定單一組分的葉酸含量;光學生物傳感器法被列入美國官方分析化學家協(xié)會(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)的推薦方法。國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)、歐盟和美國將微生物法作為葉酸檢測的首選方法和仲裁方法[27],我國在測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量使用微生物法。

我國現(xiàn)行標準中生物法檢測葉酸含量存在檢測周期長、操作過程繁瑣的缺點。其中測定用菌株需經(jīng)過提前培養(yǎng)、多次傳代、冰箱保存多個步驟,易引起菌株的污染、變異[28]。冷凍保存菌株直接使用的方式操作簡單方便,制備后即用即取可長期保存,在保證檢測結(jié)果準確的基礎上降低實驗人員的工作量[27]。目前針對葉酸檢測用凍存菌株研究較少,本文在GB 5009.211—2022標準的基礎上,通過驗證保護劑對菌株的使用效果制備定量菌株。為更加便捷快速檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量,本研究制備葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

MRS培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基,北京陸橋技術有限責任公司;無水乙醇、甲酸、乙腈,天津科密歐化學試劑有限公司;SRM 1869葉酸質(zhì)控樣品[含量范圍(223.9±8.6) μg/100 g],美國NIST。

鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosus(ATCC 7469),中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 儀器與設備

AdVantage Pro真空冷凍干燥機,美國SP Scientific公司;UV-2700紫外分光光度計,日本島津公司;MIR-254低溫恒溫培養(yǎng)箱,日本SANYO公司;ME204 電子天平,美國METTLER TOLEDO公司;3K15 臺式離心機,日本Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株制備及檢測

1.2.1.1 制備過程

將鼠李糖乳桿菌標準菌株接種于MRS培養(yǎng)基,36 ℃培養(yǎng)24 h;菌苔刮取到滅菌生理鹽水中,振蕩混勻,將麥氏濁度儀測得保護劑數(shù)據(jù)歸零,保護劑中滴加菌液,直至麥氏濁度為2.5 MCF;向西林瓶滴加50 μL 加入保護劑的菌懸液,放入真空冷凍干燥機。待樣品充分干燥后取出,密封壓蓋存放。

1.2.1.2 凍干基質(zhì)篩選

在真空冷凍干燥過程中,為了減少細胞損傷,人們通常會使用凍干保護劑。保護劑種類繁多,由于菌株本身特性不同因而對保護劑種類和使用量具有偏好性。本實驗分別配制 100、150、200 g/L質(zhì)量濃度的脫脂乳粉,對應不同質(zhì)量濃度的蔗糖(50、100、150、200 g/L)按照凍干工藝將試驗菌株進行冷凍干燥,測定存活率,比較不同濃度比例的保護劑效果。凍干存活率按公式(1)計算:

(1)

式中:R1,凍干存活率,%;a0,冷凍干燥前活菌數(shù),CFU/mL;a1,冷凍干燥后活菌數(shù),CFU/mL。

1.2.1.3 凍干工藝篩選

真空冷凍干燥技術是在真空狀態(tài)下,利用升華原理,使凍結(jié)的水分不經(jīng)過冰的融化直接以冰態(tài)升華為水蒸汽而除去的干燥法。由于冷凍干燥機對不同物質(zhì)干燥效果不同,現(xiàn)對凍干工藝進行篩選。將50 μL菌懸液滴入加有液氮的西林瓶中,放入冷凍干燥機,按照以下程序設置:

方法A:設置程序預凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-25 ℃ 360 min,真空度(Vac)130 mTorr,-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

方法B:設置程序預凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-30 ℃ 360 min,Vac 130 mTorr,-20 ℃ 1 200 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

方法C:設置程序預凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-35 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr -30 ℃ 360 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

方法D:設置程序預凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-25 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr;-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

1.2.1.4 計數(shù)方法

將未開啟的凍干菌株放置至室溫,開啟前用酒精擦拭鋁塑蓋和膠塞。放入10 mL無菌水中,稀釋到合適濃度,傾注適量TSA培養(yǎng)基,放置于36 ℃培養(yǎng)箱24 h,計數(shù)。

1.2.2 穩(wěn)定性研究

1.2.2.1 運輸條件模擬實驗

取葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株隨機分成2份,其中一份放入37 ℃培養(yǎng)箱,另一份放入25 ℃培養(yǎng)箱。分別在第0、1、3、5、7、14天計數(shù),并作3個平行實驗。

1.2.2.2 貯存條件模擬實驗

取葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株隨機分成2份,其中一份放置于4 ℃冰箱,另一份放置于-20 ℃冰箱,分別在貯存0、1、3、5、7、14、28 d計數(shù),并作3個平行實驗。復蘇率按公式(2)計算:

(2)

式中:R2,復蘇率,%;nx,第x天菌量,CFU/mL;n0,第0天菌量,CFU/mL。

1.2.3 均勻性研究

隨機抽取葉酸檢測鼠李糖乳桿菌定量菌株10瓶,每瓶中加入1 mL生理鹽水,溶解混勻,使用全自動微生物螺旋加樣系統(tǒng)在E50模式下涂布于TSA平板,每個樣品做2個平行。(36±1) ℃培養(yǎng)24 h。對結(jié)果進行統(tǒng)計分析,評價均勻性。

1.2.4 質(zhì)控樣品驗證

質(zhì)控樣品按照GB 5009.211—2022前處理,將貯存于-20 ℃環(huán)境中28 d葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株加1 mL無菌水,混勻,制得菌液加入培養(yǎng)基中混勻使用,對同一質(zhì)控樣品測試6次葉酸含量測試,測試檢驗效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干基質(zhì)篩選結(jié)果

由表1可知,按照質(zhì)量濃度150 g/L脫脂乳粉、100 g/L蔗糖比例的保護劑凍存效果最好,存活率為94%,可選為后續(xù)實驗凍干保護劑。

表1 脫脂乳粉和蔗糖保護劑凍干存活率Table 1 Lyophilized survival rate of skim milk powder and sucrose protectant

2.2 凍干工藝篩選結(jié)果

按照方法A、B、C、D依次凍存菌球,按照A、B、C方法凍存的菌球,形狀不規(guī)則,外表濕潤,顏色暗淡,不能滿足實驗要求,其中 A、B凍干的小球,因冷凍干燥時間不夠,水分不能完全析出,在室溫條件下有復溶現(xiàn)象,按照C方法凍存的小球中間為黏性。而按照方法D所凍菌球形狀為圓形,外表干燥且內(nèi)部為干粉,可以滿足實驗要求。通過對不同冷凍條件的篩選,最終確定了凍干工藝為:預凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-25 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr;-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

2.3 穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.3.1 運輸穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表2可知,在37 ℃環(huán)境中葉酸檢測鼠李糖乳桿菌定量菌株隨著貯存時間加長菌落數(shù)量有輕微變化,3次平行結(jié)果相差較小,14 d內(nèi)能保持穩(wěn)定。在25 ℃環(huán)境中葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株隨著貯存時間加長菌落數(shù)量變化更小,3次平行結(jié)果相差較小,14 d內(nèi)能保持良好穩(wěn)定性。比較2種溫度最終結(jié)果,25 ℃環(huán)境中保存比37 ℃環(huán)境中保存更接近最初菌落數(shù),所以高溫環(huán)境可采用泡沫箱加冰袋運輸,常溫環(huán)境可直接運輸。

表2 葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株模擬運輸 條件實驗結(jié)果(n=3)Table 2 Test results of simulated transport conditions for quantitative strains of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection(n=3)

2.3.2 貯存穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表3可知,-20 ℃環(huán)境下貯存28 d復蘇率為96.84%,樣品穩(wěn)定性良好,根據(jù)以往制備經(jīng)驗,在-20 ℃條件下可以保存長達18 個月;4 ℃環(huán)境下,貯存28 d復蘇率為89.47%,可以作為短期貯存條件。

表3 葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株模擬貯存 條件實驗結(jié)果(n=3)Table 3 Test results of simulated storage conditions for quantitative strains of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection (n=3)

2.4 均勻性檢測結(jié)果

對10瓶樣品進行檢測結(jié)果如表4所示,檢測結(jié)果相差較小。使用SPSS軟件,采用單因素方差分析方法,對樣品的均勻性進行檢驗,結(jié)果如表5所示,FINV(0.05,9,10)臨界值=3.02,根據(jù) SPSS 軟件計算的結(jié)果F=0.179

表4 十瓶葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株計數(shù)結(jié)果Table 4 Quantitative strain count results of 10 bottles of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection

表5 葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株均勻性試驗結(jié)果Table 5 Test results of quantitative homogeneity of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection

2.5 質(zhì)控樣品葉酸含量檢測結(jié)果

由表6可知,測同一質(zhì)控樣品6次結(jié)果均在含量范圍(223.9±8.6) μg/100 g內(nèi),平均值為225.11 μg/100 g,相對標準偏差為2.11%,說明葉酸檢測用鼠李糖乳桿菌定量菌株重復性良好,實驗結(jié)果可靠,可以滿足嬰幼兒乳粉中葉酸含量的測定需求。

表6質(zhì)控樣品葉酸含量檢測結(jié)果Table 6 Results of folate assay for quality control samples

3 結(jié)論

在我國食品安全國家標準中,微生物法是唯一的測定嬰幼兒乳粉中葉酸含量的方法。新版國標增加微孔板測定方法,培養(yǎng)體積按比例縮減,節(jié)省實驗品消耗,減少人員工作量,但并未對菌株的使用做進一步優(yōu)化?，F(xiàn)行標準中實驗菌株培養(yǎng)時間長,步驟繁瑣,極易造成菌株的污染、變異,影響檢測結(jié)果的準確性。對鼠李糖乳桿菌定量菌株進行運輸模擬實驗和貯存模擬實驗的結(jié)果顯示,隨著時間的延長菌落數(shù)量變化較小,可知其穩(wěn)定性良好;單因素方差分析方法結(jié)果F