透明質(zhì)酸與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復(fù)配拮抗幽門螺桿菌感染的臨床功效評價(jià)

王伯韜,張華月,崔樹茂,翟齊嘯,張?zhí)烀?/p>

1(華熙生物科技股份有限公司,山東 濟(jì)南,250101)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是少數(shù)能夠在人體胃部生存的細(xì)菌之一。作為一種致病菌,Hp的存在與慢性胃炎、消化性胃潰瘍等多種胃腸道疾病密切相關(guān)[1-3]。研究表明,根除Hp能夠顯著緩解Hp陽性患者的胃部疾病負(fù)擔(dān)[4]。Hp有著極高的傳染率及感染率。在全球范圍內(nèi),Hp的感染率超過了50%,而我國Hp的感染率高達(dá)55.8%,高于全球總體水平[5]。有研究表明,Hp感染能夠促進(jìn)胃癌的發(fā)生與發(fā)展[6],因此,世界衛(wèi)生組織在2010年將Hp歸類為Ⅰ類致癌物質(zhì)。目前,對于Hp感染國內(nèi)外專家都建議采取根除治療。對于Hp的根除治療方法,臨床上常使用質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPI)與抗生素的組合,但隨著抗生素的不斷使用,導(dǎo)致Hp的耐藥株出現(xiàn),使得Hp的根除率不斷降低,同時(shí),抗生素的使用還使得患者出現(xiàn)諸如惡心、腹瀉等副作用[7]。因此,急需探索具有拮抗Hp作用的非抗生素物質(zhì)。近年來,大量研究表明直接或者間接給予益生菌干預(yù)能夠提高Hp陽性患者的轉(zhuǎn)陰率,減輕抗生素治療帶來的副作用[8-9]。

透明質(zhì)酸(hyaluronan,HA)是一種線性糖胺聚糖,在人體內(nèi)廣泛存在,具有保濕、潤滑、抗氧化及抗炎等特性[10]。透明質(zhì)酸鈉作為透明質(zhì)酸的結(jié)合鹽,分別于2008年及2021年被批準(zhǔn)可以作為食品原料應(yīng)用于保健及普通食品中。有研究表明,HA參與機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)及組織再生,且這種作用的發(fā)揮與透明質(zhì)酸的分子質(zhì)量息息相關(guān)[11]。

前期研究證明,鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259具有拮抗Hp的作用[12]。本研究擬通過確定具有拮抗Hp效果的透明質(zhì)酸鈉的分子質(zhì)量,將其與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259進(jìn)行復(fù)配,探究復(fù)配組方在動(dòng)物及臨床上拮抗Hp的效果,以期開發(fā)出一款能夠干預(yù)治療Hp感染的復(fù)配產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與Hp SS1,江南大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡、雄性、C57BL/6品系小鼠,平均體重為(16.5±0.5) g,購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,飼養(yǎng)于江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.1.3 試劑

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI),青島海博公司;胎牛血清,南京諾唯贊公司;哥倫比亞培養(yǎng)基,英國OXOID公司;無菌脫纖維綿羊血,杭州新銳公司;PCR引物,上海生工生物工程公司;透明質(zhì)酸鈉,AbateHPTM透明質(zhì)酸益生菌粉,山東海御華熙生物醫(yī)藥有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CFX 實(shí)時(shí)熒光定量儀,美國伯樂(Bio-Rad)公司;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋,日本SANYO公司;i160三氣培養(yǎng)箱、LYNX4000大容量冷凍離心機(jī)、Multiscan Go多功能酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;BSC-1000ⅡA2 型生物安全柜,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究已經(jīng)過江蘇省血吸蟲病防治研究所倫理委員會(huì)審核(編號(hào):JlPD-2020071)。小鼠在實(shí)驗(yàn)正式開始前適應(yīng)1周。

1.3.1 不同分子質(zhì)量HA拮抗Hp感染的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)參考HONG等[13]的方法并稍做改進(jìn),60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將其隨機(jī)分為6組,每組10只。造模組及實(shí)驗(yàn)組小鼠隔天灌胃200 μL BHI重懸的Hp菌懸液(濃度為109CFU/mL)總共灌胃5次。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天灌胃200 μL用PBS溶解的不同分子質(zhì)量透明質(zhì)酸鈉(質(zhì)量濃度為3 mg/mL);空白組及造模組小鼠每天灌胃200 μL PBS。2次灌胃間隔1 h,實(shí)驗(yàn)持續(xù)9 d,具體實(shí)驗(yàn)方案如表1所示。

表1 不同分子質(zhì)量HA拮抗Hp感染實(shí)驗(yàn)方案Table 1 Experimental scheme of antagonistic effect of HA with different molecular weights on Hp infection

1.3.2 高分子質(zhì)量HA與乳桿菌復(fù)配拮抗Hp感染的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將其隨機(jī)分為3組,每組10只。造模組及實(shí)驗(yàn)組小鼠隔天灌胃200 μL BHI重懸的Hp菌懸液(濃度為109CFU/mL)總共灌胃5次。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天灌胃200 μL 用PBS溶解的高分子質(zhì)量透明質(zhì)酸鈉與乳桿菌復(fù)配溶液(其中高分子質(zhì)量透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度為3 mg/mL,乳桿菌菌懸液終濃度為109CFU/mL);空白組及造模組小鼠每天灌胃200 μL PBS。2次灌胃間隔1 h,實(shí)驗(yàn)持續(xù)9 d,具體實(shí)驗(yàn)方案如表2所示。

表2 HA-益生菌復(fù)配拮抗Hp感染實(shí)驗(yàn)方案Table 2 Experimental scheme of antagonistic effects of HA-probiotic compounds on Hp infection

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本采集及指標(biāo)測定

1.3.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本采集

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在最后一次灌胃后,禁食24 h,采用10 mg/mL的戊巴比妥鈉溶液對小鼠進(jìn)行腹腔注射,使其麻醉,后進(jìn)行小鼠眼球取血,最后輔以頸椎脫臼法使其死亡,立即解剖取出胃,沿胃大彎剪開,取完整的胃組織(包括胃竇、胃體等),一半用于病理學(xué)切片檢測,另一半進(jìn)行Hp定殖量檢測。

1.3.3.2 Hp感染小鼠胃部Hp定殖量測定

取2 mL培養(yǎng)好的Hp菌液,用PBS洗滌后,6 000×g離心5 min,重復(fù)3次。將Hp菌泥梯度稀釋后取100 μL涂板計(jì)數(shù),另外一部分使用TRIzol提取Hp RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用熒光定量SYBR Green法測定Ct值,Hp特異性引物參考閆宗寶等[14]的方法設(shè)計(jì),序列為:上游 TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC,下游 CATAGGATTTCACACCTGACTGACTAT,建立菌落數(shù)(CFU)與Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱量感染小鼠胃組織質(zhì)量,取200 mg收集到的小鼠胃部組織,用TRIzol法提取小鼠胃組織RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用熒光定量SYBR Green法測定Ct值,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對,計(jì)算小鼠胃內(nèi)Hp的定殖量。

1.3.3.3 Hp感染小鼠胃組織病理學(xué)切片觀察

感染小鼠胃部病理學(xué)切片參照劉陽[15]的方法操作,方法大致如下:小鼠胃部組織使用4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定24 h,經(jīng)過石蠟包埋,冷凍切片及蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining,HE染色)后,在倒置顯微鏡下觀察。

1.4 臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究已經(jīng)通過江蘇省鹽城市亭湖區(qū)人民醫(yī)院倫理管理委員會(huì)審核(編號(hào):ET2021085),并在中國臨床注冊中心進(jìn)行注冊(注冊號(hào):ChiCTR2100053710)。臨床試驗(yàn)方法參照張美怡[12]的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì),臨床試驗(yàn)共招募60名受試者,將受試者隨機(jī)分為3組,每組20人,分別為安慰劑組、透明質(zhì)酸組及復(fù)配組。安慰劑組給予安慰劑產(chǎn)品,透明質(zhì)酸組給予包含100 mg/條 100～150 wDa透明質(zhì)酸的產(chǎn)品,復(fù)配組給予AbateHPTM透明質(zhì)酸益生菌粉,菌粉包含100 mg/條 100～150 wDa透明質(zhì)酸及5×109CFU/條鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259。透明質(zhì)酸組與復(fù)配組產(chǎn)品除已標(biāo)出的成分外均與安慰劑成分相同。受試者早晚各攝入1條,服用4周。所有產(chǎn)品均為粉末狀,外觀及包裝均無差別。

1.4.1 臨床試驗(yàn)受試者納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

招募人群為在實(shí)驗(yàn)開始前經(jīng)過14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測為Hp陽性且無胃腸道病史的人群。在臨床試驗(yàn)開始前1個(gè)月內(nèi)服用過抗生素的受試者將被排除在外。

1.4.2 臨床試驗(yàn)指標(biāo)測定

招募人群為在實(shí)驗(yàn)開始前經(jīng)過14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測為Hp陽性且無胃腸道病史的人群。在臨床試驗(yàn)開始前1個(gè)月內(nèi)服用過抗生素的受試者將被排除在外。

1.4.2.114C呼氣檢測

受試者在實(shí)驗(yàn)開始前1 d及結(jié)束后1 d進(jìn)行14C呼氣檢測。

1.4.2.2 血常規(guī)及血生化指標(biāo)測定

受試者在研究開始前1 d及結(jié)束后1 d抽取空腹肘靜脈血,進(jìn)行血常規(guī)檢測及血液生化分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)差異性用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8 進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”,多組別間的差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩組之間差異性比較采用t檢驗(yàn),圖形的繪制通過 GraphPad Prism 8 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子質(zhì)量HA對感染小鼠胃部Hp定殖量的影響

Hp通過定殖在胃上皮細(xì)胞上發(fā)揮其致病作用。有研究表明,幽門螺桿菌定殖量與其致病程度呈正相關(guān)[16]。因此,Hp在小鼠胃內(nèi)定殖量的變化情況可以直接反映HA對Hp感染作用效果。如圖1所示,空白組小鼠胃內(nèi)Hp含量約為102CFU左右,而造模組小鼠胃內(nèi)Hp含量顯著高于空白組,在104CFU左右。經(jīng)過PPI處理后,小鼠胃內(nèi)Hp水平顯著下降。同時(shí),與造模組相比,中低分子質(zhì)量HA干預(yù)后,感染小鼠體內(nèi)Hp含量有輕微下降趨勢,但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異,而在高分子質(zhì)量HA干預(yù)后,感染小鼠胃內(nèi)Hp含量顯著降低,說明高分子質(zhì)量HA或可存在拮抗Hp的作用。

圖1 HA對胃部Hp定殖量的影響Fig.1 Effects of HAs on Hp Colonization in the stomach注:*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同。

2.2 不同分子質(zhì)量HA對感染小鼠胃部病理學(xué)切片的影響

為進(jìn)一步探究不同分子質(zhì)量HA拮抗Hp的作用,對感染小鼠胃部病理學(xué)情況進(jìn)行觀察。Hp感染后胃部的病理情況主要是通過胃部組織病理切片情況進(jìn)行評價(jià)。不同處理組小鼠胃黏膜HE染色后結(jié)果如圖2所示,感染Hp后小鼠胃黏膜固有層炎癥細(xì)胞浸潤顯著性增多。HENRIQUES等[17]利用Hp感染的C57BL/6小鼠評價(jià)不同規(guī)格乙酰化殼聚糖微球?qū)p感染的緩解效果,對感染小鼠胃組織病理學(xué)切片進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),在經(jīng)過Hp感染后,小鼠胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)紊亂,并出現(xiàn)可見的炎性細(xì)胞浸潤,這與本研究出現(xiàn)的病理結(jié)果相似。如圖2所示,低分子質(zhì)量HA沒有改善這一情況,而PPI組、中分子質(zhì)量和高分子質(zhì)量HA組小鼠胃黏膜與正常對照組類似,基本沒有炎癥細(xì)胞浸潤情況,這進(jìn)一步證明了中分子質(zhì)量和高分子質(zhì)量HA能夠?qū)p感染引起的炎癥反應(yīng)有一定的緩解效果。杭興偉等[18]的研究證明,透明質(zhì)酸能夠抑制炎性細(xì)胞的趨化及移動(dòng),表明透明質(zhì)酸具有緩解炎癥的作用,這與本文研究結(jié)果基本一致。

A-空白組;B-造模組;C-PPI干預(yù)組;D-低分子質(zhì)量HA組; E-中分子質(zhì)量HA組;F-高分子質(zhì)量HA組圖2 HA對小鼠胃黏膜的影響Fig.2 Effects of HAs on Gastric mucosa of mice

2.3 高分子質(zhì)量HA與乳桿菌復(fù)配對感染小鼠胃部Hp定殖量的影響

諸多研究證明,鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌及干酪乳桿菌等多種乳桿菌具有拮抗Hp的作用。張美怡[12]研究了多種乳桿菌在體外緩解幽門螺桿菌的作用,證明鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259在體外能夠拮抗Hp,存在臨床上拮抗幽門螺桿菌的潛能。前面的研究已經(jīng)證明,高分子質(zhì)量HA能夠降低Hp感染小鼠體內(nèi)Hp定殖量,減輕感染小鼠胃部炎癥。為了探究HA與乳桿菌的協(xié)同效果,將高分子質(zhì)量HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復(fù)配,利用Hp感染動(dòng)物模型探究復(fù)配組方對Hp的緩解作用。如圖3所示,造模組小鼠體內(nèi)Hp含量顯著高于空白組,在鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與高分子質(zhì)量HA干預(yù)后,感染小鼠體內(nèi)Hp含量得到了顯著降低。

圖3 HA-益生菌組合物對胃部Hp定殖量的影響Fig.3 Effects of HA-probiotic compounds on Hp Colonization in the stomach

A-空白組;B-造模組;C-復(fù)配組圖4 HA-益生菌組合物對小鼠胃黏膜的影響Fig.4 Effects of HA-probiotic compounds on Gastric mucosa of mice注:HE染色(200×)。

2.4 高分子質(zhì)量HA與乳桿菌復(fù)配對感染小鼠胃部病理學(xué)切片的影響

觀察乳桿菌與高分子質(zhì)量HA干預(yù)后Hp感染小鼠胃部組織切片。在經(jīng)過Hp感染后,小鼠胃部組織出現(xiàn)了明顯的黏膜脫落,與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,在經(jīng)過Hp感染后,小鼠胃組織中出現(xiàn)明顯的炎性浸潤,且這種炎性浸潤作用在經(jīng)過鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與高分子質(zhì)量HA復(fù)配組方干預(yù)后獲得了一定的緩解。因此,鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與高分子質(zhì)量HA復(fù)配能夠顯著降低Hp定殖量,緩解因Hp感染引發(fā)的胃部炎癥,具有較好拮抗Hp的潛力。

2.5 臨床試驗(yàn)受試者基本信息

基于上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,對具有較好表現(xiàn)的鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與高分子質(zhì)量HA復(fù)配組方(AbateHPTM)進(jìn)行臨床干預(yù),評價(jià)其臨床功效。實(shí)驗(yàn)共招募60名符合條件的受試者,最終有48人完成了本次研究。具體實(shí)驗(yàn)完成情況如圖5所示。

圖5 臨床試驗(yàn)完成情況Fig.5 Completion of clinical trials

完成實(shí)驗(yàn)的48名受試者的基本信息如表3所示。在完成實(shí)驗(yàn)的48名受試者中,各組之間的年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異性,具有可比性。

表3入組受試者基本信息Table 3 Basic information of the enrolled subjects

2.6 高分子質(zhì)量HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復(fù)配對受試者轉(zhuǎn)陰率及有效率的影響

臨床上經(jīng)常使用14C呼氣檢測的方法來診斷受試者是否存在Hp感染。有研究表明,呼氣試驗(yàn)可以反映受試者體內(nèi)Hp的密度[19],因此,在受試者在實(shí)驗(yàn)開始前一天及結(jié)束后一天進(jìn)行14C呼氣實(shí)驗(yàn)以檢測在經(jīng)過干預(yù)后受試者體內(nèi)Hp的變化情況。表4反映了HA及復(fù)配組方干預(yù)后受試者轉(zhuǎn)陰率的變化情況。在完成實(shí)驗(yàn)的48人中,安慰劑組的16人中有5名受試者轉(zhuǎn)為陰性,轉(zhuǎn)陰率為31.25%,而HA組的15人中,有8名受試者轉(zhuǎn)為陰性,轉(zhuǎn)陰率為53.33%,為安慰劑組的2倍,表明經(jīng)過HA干預(yù)可以降低Hp患者體內(nèi)Hp定殖密度。在復(fù)配組的17人中有11人轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?轉(zhuǎn)陰率為64.71%,略高于HA組,表明HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259聯(lián)合使用具有協(xié)同增效的效果。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,HA及復(fù)配組方均能夠降低Hp陽性患者體內(nèi)Hp的定殖密度,復(fù)配組方的拮抗效果略高于單攝入透明質(zhì)酸。HOLZ等[20]的一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)探究了具有Hp共聚能力的羅伊氏乳桿菌對Hp陽性患者的影響,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,在經(jīng)過羅伊氏乳桿菌干預(yù)后,受試者體內(nèi)Hp定殖量也表現(xiàn)出顯著降低。

表4 HA-益生菌對Hp根除率的影響Table 4 Effects of HA-probiotic compounds on eradication rates of Hp

為更加直觀地觀察各組干預(yù)對受試者體內(nèi)Hp變化的影響,定義受試者在干預(yù)前后14C呼氣值下降超過100為有效,對各組受試者進(jìn)行有效人數(shù)統(tǒng)計(jì),計(jì)算有效率。如表5所示,在經(jīng)過安慰劑干預(yù)后,16名受試者中有6名受試者在干預(yù)前后呼氣值下降超過100,有效率為37.50%,而在15名受試者的HA組及17名受試者的復(fù)配組中,分別有10名和13名受試者在干預(yù)前后呼氣值降低超過了100,有效率分別為66.67%和76.47%,表明HA及復(fù)配組方干預(yù)均能有效拮抗Hp感染,且復(fù)配組方的拮抗效果略高于單攝入透明質(zhì)酸。

2.7 高分子質(zhì)量HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復(fù)配對受試者血常規(guī)及血生化指標(biāo)的影響

為了進(jìn)一步測定HA及復(fù)配組干預(yù)對受試者基本生理狀態(tài)的影響,對受試者在干預(yù)前后進(jìn)行血常規(guī)及血液生化檢測。受試者在實(shí)驗(yàn)開始前一天及結(jié)束后一天抽取空腹肘靜脈血進(jìn)行血常規(guī)及肝臟、腎臟相關(guān)血液生化指標(biāo)檢測,檢測結(jié)果如圖6所示。在經(jīng)過HA或復(fù)配組方干預(yù)后,受試者白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板及血紅蛋白濃度等血常規(guī)基本指標(biāo)并未發(fā)生顯著變化,肝功能相關(guān)血液生化指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素及腎臟相關(guān)指標(biāo)尿素氮等也未發(fā)生明顯改變,說明HA及復(fù)配組方干預(yù)并不會(huì)對受試者肝臟及腎臟相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生明顯影響。MEHLING等[21]探究了羅伊氏乳桿菌DSM17648干預(yù)對Hp感染陽性患者的影響,結(jié)果表明經(jīng)過羅伊氏乳桿菌DSM17648干預(yù)并不會(huì)對Hp感染陽性患者血常規(guī)及血液生化指標(biāo)產(chǎn)生不利影響,這與本文的研究結(jié)果基本一致。

a-白細(xì)胞;b-紅細(xì)胞;c-血紅蛋白濃度;d-血小板;e-堿性磷酸酯酶;f-谷草轉(zhuǎn)氨酶;g-總膽紅素;h-谷胱甘肽還原酶;i-尿素氮圖6 干預(yù)對受試者血常規(guī)及血生化指標(biāo)的影響Fig.6 Effects of intervention on blood routine and blood biochemical indexes of subjects

3 結(jié)論

前期研究表明,鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259在體外具有拮抗幽門螺桿菌的作用,主要表現(xiàn)在能夠顯著抑制Hp生長以及抑制Hp與AGS細(xì)胞的黏附。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,單使用高分子質(zhì)量HA或者使用高分子質(zhì)量HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復(fù)配均能夠顯著降低感染小鼠體內(nèi)Hp定殖量,減輕小鼠因Hp感染引起的胃部炎癥。進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,HA及復(fù)配組方干預(yù)均提高了受試者Hp轉(zhuǎn)陰率及有效率,特別是在復(fù)配組方干預(yù)后,并且干預(yù)未發(fā)現(xiàn)對受試者基本生理狀態(tài)產(chǎn)生影響。