夏桑菊低聚糖對益生菌增殖作用及其酶解工藝優(yōu)化研究

黃志云 孫維廣* 黎爾納 萬安鳳 鄒宇曉 高建勝

1.廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司，廣東 廣州 510288；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610

中藥渣是中藥提取后的固體廢棄物，隨著中藥產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，中藥渣的排放量也日益上升，據(jù)統(tǒng)計，中藥渣的年排放量可達(dá)3000萬噸。在生產(chǎn)中該類廢棄物往往直接排放，造成資源浪費的同時，對生態(tài)環(huán)境有較大的破壞[1-3]。

夏桑菊顆粒源自清代著名溫病學(xué)家吳鞠通《溫病條辨》的經(jīng)典名方“桑菊飲”，主要由夏枯草、桑葉和野菊花配伍而成?，F(xiàn)代研究表明夏枯草含有三萜類、多糖類、黃酮類、甾體類與有機酸類化合物等成分，具有降血糖、降血壓、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗炎抗菌及抗病毒等藥理作用[4]。桑葉中含酚類及黃酮類、生物堿類、氨基酸、多糖和甾類化合物，具有降血糖、抗炎、抗菌、抗病毒、抗衰老及抗癌等生物活性[5]。野菊花含有揮發(fā)油、黃酮類、多糖類、有機酸類、氨基酸以及微量元素等化學(xué)成分，有抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤活性、抗氧化等生理活性[6]。由組方及其生理活性可知，夏桑菊藥渣在某意義來說也是一種“中藥抗生素”。

夏桑菊顆粒生產(chǎn)時，為了保證產(chǎn)品質(zhì)量均一穩(wěn)定，需要“水提”物質(zhì)進(jìn)行“醇沉”處理，醇沉后的上清液作為生產(chǎn)原料，醇沉物為廢棄物，但廢棄物中卻含有豐富的多糖、多酚和黃酮類物質(zhì)等成分。我司每年產(chǎn)生約幾千噸夏桑菊藥渣，傳統(tǒng)的填埋處理方式經(jīng)濟(jì)價值低，而且造成藥效成分浪費。本文擬采用生產(chǎn)夏桑菊顆粒過程中的“水提醇沉”物為原料，經(jīng)生物酶解處理后獲得夏桑菊低聚糖，考察其對益生菌的增殖作用，并優(yōu)化酶解工藝，為未來將夏桑菊藥渣開發(fā)成高價值的“減抗替抗”動物營養(yǎng)制劑提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 THZ-D型臺式恒溫振蕩器(江蘇省太倉市華美生化儀器廠)；HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 材料 夏桑菊醇沉渣由廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司提供，利用苯酚-硫酸法檢測其多糖濃度約為80 mg/mL。果膠酶(1000 U/mg)、纖維素酶(400 U/mg)、半纖維素酶(2 U/mg)、淀粉酶(4 U/mg)、葡聚糖酶(50 U/mg)、木聚糖酶(6000 U/mg)、甘露聚糖酶(50 U/mg)、糖化酶(100 U/mg)購于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum，GIM1.191)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides，GIM1.774)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，GIM1.411)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，ATCC53103)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis，ATCC15703)保藏于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所蠶桑南藥與微生物資源加工利用研究室。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖濃度的測定 稱取干燥至恒重的葡萄糖500 mg，取少量蒸餾水溶解，并定容到500 mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用苯酚-硫酸比色法，分別吸取 0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容到25 mL，得到不同濃度的葡萄糖稀釋液，分別取1.00 mL稀釋液于10 mL試管中，各加入質(zhì)量濃度為5%的苯酚溶液1 mL，再迅速加入濃硫酸5 mL，充分震蕩搖勻，室溫靜置冷卻30 min，在490 nm下測吸光值。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取適當(dāng)稀釋的夏桑菊多糖溶液 1 mL 于 10 mL 試管中，以1 mL蒸餾水作為空白對照，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行顯色，于490 nm處測定吸光值，并計算多糖含量。結(jié)果顯示，本試驗所用夏桑菊醇沉渣中多糖濃度為80 mg/mL。

2.2 不同生物酶酶解制備的夏桑菊低聚糖促益生菌生長活性的測定 夏桑菊低聚糖制備：往夏桑菊醇沉渣中分別添加8種生物酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、糖化酶)，使其酶活力達(dá)到1000 U/mL，50 ℃酶解3 h，得到生物酶解制備的夏桑菊低聚糖，滅酶(沸水浴10 min)后121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后于4 ℃儲存待用。

夏桑菊低聚糖促益生菌生長活性的測定：分別將夏桑菊低聚糖和商品化益生元(IMO、GOS)添加到MRS液體培養(yǎng)基，使其質(zhì)量終濃度達(dá)到10 mg/mL。向培養(yǎng)基中接種1%過夜培養(yǎng)的益生菌菌液，37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)過夜，按下公式計算增殖率。

益生菌增殖率=低聚糖與益生菌菌共培養(yǎng)后菌落數(shù)/空白對照組菌落數(shù)×100%

結(jié)果顯示，不同生物酶對多糖的降解效果不同。圖1-A中，利用半纖維素酶制備的夏桑菊低聚糖對植物乳桿菌的促增殖效果最好，增殖率為(156±9.8)%，其次為果膠酶，增殖率為(141±12.3)%，兩組與陰性對照組相比，差異顯著(P<0.05)。圖1-B中，利用木聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對腸膜明串珠菌的促增殖效果最好，增殖率為(168±13.8)%，其次為葡聚糖酶，增殖率為(153±14.3)%，兩組與陰性對照組相比，差異顯著(P<0.05)。圖1-C中，利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對干酪乳桿菌的促增殖效果最好，增殖率為(213±17.3)%，其次為果膠酶，增殖率為(189±15.7)%，兩組與陰性對照組相比，差異顯著(P<0.05)。圖1-D中，利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌的促增殖效果最好，增殖率為(265±14.5)%，其次為半纖維素酶，增殖率為(226±27.3)%，兩組與陰性對照組相比，差異顯著(P<0.05)；優(yōu)于未酶解的夏桑菊多糖(151±4.2)%和商品化益生元低聚異麥芽糖(173±8.3)%、低聚半乳糖(182±9.2)%。圖1-E中，利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對青春雙歧桿菌的促增殖效果最好，增殖率為(176±15.3)%；其次為果膠酶，增殖率為(169±14.3)%，兩組與陰性對照組相比，差異顯著(P<0.05)。

注：柱形圖中相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

綜上，8種不同酶酶解制備的夏桑菊低聚糖對5種益生菌都具有較好的促增殖作用，其中利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌的增殖效果最好，后續(xù)將以此菌為增殖效果為指標(biāo)，優(yōu)化葡聚糖酶生物酶解夏桑菊低聚糖工藝參數(shù)。

2.3 夏桑菊低聚糖濃度對其促鼠李糖乳桿菌生長活性的影響 將夏桑菊低聚糖添加到MRS液體培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量終濃度分別達(dá)到40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL。向培養(yǎng)基中接種1%過夜培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌菌液，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)過夜，計算增殖率。結(jié)果顯示，低聚糖質(zhì)量終濃度在2.5～40 mg/mL范圍內(nèi)，鼠李糖乳桿菌的增殖率隨濃度的增大呈先上升后平緩下降的趨勢，當(dāng)質(zhì)量終濃度為 10 mg/mL 時增殖率達(dá)到最大值(273±16.4)%，如圖2。

圖2 夏桑菊低聚糖濃度對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響圖

2.4 夏桑菊低聚糖生物酶解制備工藝的單因素優(yōu)化 以鼠李糖乳桿菌增殖率為指標(biāo)，添加低聚糖質(zhì)量終濃度為10 mg/mL，選擇不同酶添加量、酶解溫度、酶解時間，研究其對夏桑菊低聚糖酶解工藝的影響。實驗參數(shù)見表2。

表2 生物酶解工藝參數(shù)

2.4.1 不同酶添加量制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響 如圖3所示，葡聚糖酶添加量在500～2500 U/mL時制備的夏桑菊低聚糖，鼠李糖乳桿菌的增殖率呈先增后減的趨勢。酶添加量為1500 U/mL時，鼠李糖乳桿菌的增殖率達(dá)到了(320±17.2)%，而酶添加量大于 1500 U/mL 時，增殖率開始逐漸降低。

圖4 酶解溫度對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響

圖5 不同酶解時間對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響

2.4.2 不同酶解溫度制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響 葡聚糖酶添加量 1500 U/mL，夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌增殖隨著溫度變化先增后降，酶解溫度50 ℃時增殖率最高，為(329±15.6)%。

2.4.3 不同酶解時間制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響 酶解時間為2～6 h，增殖率先直線上升后慢速下降，并在4 h時達(dá)到最高值(364±16.4)%。綜上，從益生活性考慮，選取葡聚糖酶添加量1500 U/mL、酶解溫度50 ℃和酶解時間4 h為較優(yōu)酶解方案。

3 討論

生物酶解法在中藥提取中有廣泛應(yīng)用[7-10]。其原理為：通過選用一些恰當(dāng)?shù)拿割惻c藥用植物細(xì)胞使細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)降解破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，減小細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散的傳質(zhì)阻力，從傳質(zhì)角度促使有效成分提取率提高[11]。

在考察夏桑菊低聚糖濃度對其促鼠李糖乳桿菌生長活性的影響試驗中，當(dāng)?shù)途厶琴|(zhì)量終濃度在2.5～40 mg/mL范圍內(nèi)時，鼠李糖乳桿菌的增殖率隨濃度的增大呈先上升后平緩下降的趨勢，當(dāng)質(zhì)量終濃度為10 mg/mL時增殖率達(dá)到最大值，質(zhì)量終濃度繼續(xù)增大時，增殖率隨濃度增大而降低，可能是因為濃度過高，從而導(dǎo)致滲透壓過高，細(xì)胞破裂，增殖率降低。

在考察不同酶添加量制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響試驗中，葡聚糖酶添加量在500～2500 U/mL時制備的夏桑菊低聚糖，鼠李糖乳桿菌的增殖率呈先增后減的趨勢。酶添加量為1500 U/mL時，鼠李糖乳桿菌的增殖率達(dá)到最大值，而酶添加量大于1500 U/mL時，增殖率開始逐漸降低。這可能是因為低聚糖的結(jié)構(gòu)影響其活性作用的發(fā)揮，具有一定分子量的低聚糖才具有促生長活性，過度酶解的低聚糖小片段，其促增殖活性不佳[12]。

在考察不同酶解溫度制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響的試驗中，酶解溫度在30～70 ℃時制備的夏桑菊低聚糖，鼠李糖乳桿菌增殖率呈先增后減趨勢，溫度50℃時增殖率最大。因為酶的活性與反應(yīng)溫度有關(guān)，且存在最適溫度。制備的低聚糖對鼠李糖乳桿菌的促生長作用并不是隨著酶解溫度的升高而呈直線上升趨勢，而是在適宜溫度值時鼠李糖乳桿菌的生長活性存在較優(yōu)值。

在考察不同酶解時間制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌增殖率的影響試驗中，酶解時間為 2～6 h，增殖率先直線上升后慢速下降，并在4 h時達(dá)到最高值(364±16.4)%，這種情況可能是，隨時間的延長，葡聚糖酶與糖鏈作用的機會更完全，產(chǎn)生更多的活性低聚糖，促進(jìn)鼠李糖乳桿菌的生長繁殖；隨著酶解時間的繼續(xù)延長，酶解產(chǎn)物的組成發(fā)生改變，不利于鼠李糖乳桿菌的增殖。

實驗中，8種不同生物酶酶解制備的夏桑菊低聚糖對5種益生菌都具有較好的促增殖作用，其中利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對鼠李糖乳桿菌的增殖效果最好；從益生活性考慮，選取葡聚糖酶添加量1500 U/mL、酶解溫度50 ℃和酶解時間4 h為較優(yōu)酶解方案。綜上，研究提供的技術(shù)方案可為未來夏桑菊藥渣的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。