毛地黃組織培養(yǎng)與再生體系建立研究

馬夢宇 簡麗觀 李雪

摘要要：【目的】為建立毛地黃組織培養(yǎng)及再生體系?！痉椒ā恳悦攸S花梗為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，采用正交試驗(yàn)對不定芽增殖進(jìn)行優(yōu)化，利用單因素試驗(yàn)探究不同基本培養(yǎng)基對其生根的影響。【結(jié)果】適宜毛地黃不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+0.01 mg/L TDZ +2 mg/L 6-BA +0.02 mg/L NAA +30 g/L 蔗糖 +6 g/L瓊脂，增殖率達(dá)（511.11±7.74）%。適宜生根的培養(yǎng)基為1/2 MS +0.2 mg/L NAA +30 g/L 蔗糖 +6 g/L 瓊脂，生根率為（99.44 ±0.96）%，種植后的植株成活率超過95%?！窘Y(jié)論】該組織培養(yǎng)與再生體系具有取材方便、流程簡單的優(yōu)點(diǎn)，有效提高了組培效率，可應(yīng)用于毛地黃的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：毛地黃；花梗；組織培養(yǎng)；再生體系建立

中圖分類號(hào)：S682.19? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-5774（2023）03-0190-06

Study on Establishment of Tissue Culture and Regeneration System of Digitalis purpurea L.

Ma Mengyu， Jian Liguan， Li Xue*

（Quanmei Biotechnology Co.，Ltd.，Quanzhou，F(xiàn)ujian 362012，China）

Abstract：【Objective】The objective of this study is to establish a tissue culture and regeneration system of Digitalis purpurea L.【Method】Peduncles of Digitalis purpurea L. were used as explants for inducing adventitious bud formation. An orthogonal test was conducted to optimize the proliferation of the adventitious buds，and a single-factor test was utilized to explore the influence of different basic media on rooting. 【Result】The results indicated that the optimal medium for adventitious bud proliferation was MS medium supplemented with 0.01 mg/L TDZ，2 mg/L 6-BA，0.02 mg/L NAA，30 g/L sucrose，and 6 g/L agar，achieving a proliferation rate of 511.11±7.74%. The most suitable medium for rooting was 1/2 MS medium supplemented with 0.2 mg/L NAA，30 g/L sucrose and 6 g/L agar，with a rooting rate of 99.44±0.96%，and a post-transplanting survival rate exceeding 95%. 【Conclusion】This tissue culture and regeneration system has the advantages of convenient material collection and simple process，effectively improving tissue culture efficiency，and can be applied to the industrial production of Digitalis purpurea L.

Key words：Digitalis purpurea L.；Peduncle；Tissue culture；Establishment of regeneration system

毛地黃（Digitalis purpurea L.）又稱洋地黃、德國金鐘、自由鐘、山白菜，是一年生或多年生草本藥用植物，原產(chǎn)歐洲。據(jù)記載，毛地黃的根、葉入藥，有強(qiáng)心之效［1，2］，毛地黃及其提取物或制劑對心力衰竭、靂型克山病等有良好效果［3-6］；分子生物學(xué)研究表明地黃皂苷可提高水稻抗稻瘟菌感染能力，用于分離霉形體膜、異形胞等［7，8］。毛地黃也可作為觀賞植物，如盆栽密植毛地黃、大花毛地黃、重瓣毛地黃等備受市場歡迎［9-11］。

目前生產(chǎn)中種植的毛地黃多由種子發(fā)育而來，存在生產(chǎn)周期較長、發(fā)芽率低，大小不一致等問題，而采用組織培養(yǎng)法是有效加快繁殖速度的辦法。梁佼等研究了毛地黃優(yōu)良變異植株嫩莖愈傷組織的誘導(dǎo)、分化及無性系的建立［12］，倪德祥、惠月明和劉永宏等進(jìn)一步探究了毛地黃葉離體培養(yǎng)過程中激素、光質(zhì)及培養(yǎng)基對器官發(fā)生的影響［13-16］。目前已報(bào)道的研究中，毛地黃組織培養(yǎng)及再生體系建立大多經(jīng)過愈傷組織脫分化階段，本研究以花梗為外植體直接誘導(dǎo)不定芽進(jìn)而建立再生體系，為毛地黃的工廠化生產(chǎn)提供新途徑。

1材料與方法

1.1 無菌材料獲得

1.1.1 外植體來源

供試材料為1.5～2 a生毛地黃盆苗，購自漳州百花村，株高28～42 cm（不含花序），具3～5支花梗，且進(jìn)入開花期，每株約5～7朵花完全開放（圖1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體誘導(dǎo)

選取生長健壯、無病蟲害、開花具品種特性的毛地黃植株，取其新抽且未有花朵開放的花梗剪除花苞，切成2～3 cm節(jié)段（至少帶一個(gè)節(jié)）作為外植體。于燒杯中用流水沖洗25～30 min。在超凈工作臺(tái)中，先用75%酒精消毒30 s，再置于0.1% HgCl2溶液中浸泡消毒10～20 min，之后無菌水沖洗3～5次，無菌濾紙吸干水分后接種。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）+0.01 mg/L TDZ（苯基噻二唑基脲）+30 g/L蔗糖+6 g/L 瓊脂，pH值5.8，培養(yǎng)周期28 d。本試驗(yàn)的培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)基滅菌條件121℃，滅菌30 min，培養(yǎng)溫度25±1℃，LED燈光源，光照強(qiáng)度30～65 μmol /（m2·s），光照時(shí)長12 h/d，以下同。

1.2.2 增殖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以MS +30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，pH值5.8，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)（表1）探究TDZ、6-BA和NAA（萘乙酸）的不同濃度及其組合對毛地黃不定芽增殖影響。截取長勢基本一致毛地黃無菌莖段，1.5～2.0 cm（具生長點(diǎn)）為一個(gè)增殖單位，分別接種于9種不同處理的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每個(gè)處理接種50～90個(gè)增殖單位，重復(fù)3次。

1.2.3 生根培養(yǎng)

以0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為培養(yǎng)基，pH值5.8，分別在MS、1/2 MS、1/3 MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行單因素生根試驗(yàn)，28 d統(tǒng)計(jì)生根率。當(dāng)植株根長至2 cm及以上時(shí)進(jìn)行煉苗，之后移栽到基質(zhì)為泥炭蘚（0～10 mm）：珍珠巖=31的105目穴盤中，28 d統(tǒng)計(jì)移栽存活率［12］。

1.3 指標(biāo)測定

觀察并記錄不同處理組培苗的生長情況，并統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。增殖芽數(shù)（以側(cè)芽長度達(dá)到0.5 cm時(shí)記為增殖芽）、株高和葉片數(shù)等指標(biāo)。增殖率（%）=（培養(yǎng)后芽數(shù)-接種芽數(shù)）/接種芽數(shù)×100%；生根率（%）=生根株數(shù)/接種數(shù)×100%。存活率（%）=存活數(shù)/種植數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對毛地黃外植體誘導(dǎo)的影響

不同的外植體消毒時(shí)間對無菌材料的獲得效果見表2，結(jié)果表明0.1% HgCl2消毒15 min或20 min的無菌材料獲得率相對較高，存活外植體均誘導(dǎo)出不定芽（圖2），持續(xù)轉(zhuǎn)代4次后用于增殖試驗(yàn)。

2.2不同培養(yǎng)基組合對毛地黃不定芽增殖的影響

毛地黃在不同增殖培養(yǎng)基中的不定芽增殖效果見表3。分析結(jié)果表明，極差（R值）最大對應(yīng)的試驗(yàn)因素為B，并且B取第三水平時(shí)增殖率最高，不同因素對毛地黃組培苗增殖率影響的依次為6-BA濃度（因素B）>TDZ濃度（因素A）>NAA濃度（因素C）。

毛地黃主芽、側(cè)芽、主芽葉片數(shù)和長勢的分析結(jié)果表明（表4），不同因素對毛地黃這些生長指標(biāo)的影響不明顯。進(jìn)一步的方差分析結(jié)果如表5所示，6-BA對毛地黃組培苗的增殖影響顯著（P＜0.05）；而TDZ和NAA的影響均不顯著。比較各因素不同水平下增殖率的總和（K值）或平均值（k值）結(jié)果表明，各因素不同水平對毛地黃組培苗增殖率影響的最優(yōu)值排序分別為A2>A3>A1，B3>B2>B1，C2>C1>C3。增殖率的直觀分析結(jié)果表明：毛地黃增殖的最優(yōu)組合為A2B3C2，這與表3中增殖試驗(yàn)結(jié)果（最優(yōu)組合為A3B3C2）不一致。故進(jìn)行各因素優(yōu)水平驗(yàn)證試驗(yàn)。

取長勢基本一致的毛地黃不定芽接種于A2B3C2（MS+0.01 mg/L TDZ+2 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，pH值5.8）培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)效果驗(yàn)證，每個(gè)重復(fù)40株，3次重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果見表6，A2B3C2的增殖率為（511.11±7.74）%，長勢如圖3，優(yōu)于各正交試驗(yàn)處理組，為適宜毛地黃增殖培養(yǎng)基。

2.3 基本培養(yǎng)基對毛地黃生根與存活的影響

毛地黃生根與存活試驗(yàn)結(jié)果見表7，3種處理的毛地黃生根率均在90%以上。結(jié)合生根率、成活率及長勢評價(jià)結(jié)果，篩選到1/2 MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為最佳的毛地黃生根培養(yǎng)基，植株的根系多、長勢旺（圖4）。處理的組培苗移栽穴盤28 d后（圖5），進(jìn)行大田種植，4個(gè)月后陸續(xù)開花（圖6）。

3? 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以新抽花梗為毛地黃組培苗誘導(dǎo)的外植體，75%酒精消毒30 s加0.1%HgCl2消毒15 min或20 min時(shí)的無菌材料獲得率相對較高。正交試驗(yàn)9個(gè)增殖培養(yǎng)基組合均能讓毛地黃增殖，其中處理6（A2B3C1，0.01 mg/L TDZ + 2 mg/L 6-BA+0.01 mg/LNAA）和處理9（A3B3C2，0.02 mg/L TDZ + 2 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA）的增殖率達(dá)260%以上。倪德祥等［13］利用無菌葉片（含中脈）離體培養(yǎng)探究光質(zhì)與培養(yǎng)基對器官發(fā)生的方差分析表明，含6-BA培養(yǎng)基的效應(yīng)極顯著。惠月明在毛地黃組織培養(yǎng)中器官發(fā)生的激素調(diào)節(jié)研究發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度在1～5 mg/L 有利于芽的誘導(dǎo)［14］。本研究的正交分析結(jié)果亦表明，6-BA濃度對毛地黃生叢芽增殖影響顯著。

正交試驗(yàn)獲得優(yōu)水平組合為A2B3C2（0.01 mg/L TDZ +2 mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA），以MS為基本培養(yǎng)基的不定芽，A2B3C2組合增殖率可達(dá)（511.11 ± 7.74）%。綜合考量增殖率、主芽高度、主芽葉片數(shù)、側(cè)芽高度和長勢，A2B3C2組合為不定芽增殖適宜培養(yǎng)基；其增殖率略低于梁佼等［12］通過毛地黃優(yōu)良變異植株嫩莖愈傷誘導(dǎo)-分化不定芽-增殖所用培養(yǎng)基（MS + 0.2 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IAA）的增殖率（750%），這可能與外植體狀態(tài)和培養(yǎng)基所選用激素不同有關(guān)。

毛地黃生根較容易，其在基本培養(yǎng)基（MS、1/2 MS、1/3 MS）+0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+瓊脂6 g/L、pH值5.8培養(yǎng)基上的生根率平均在97%以上，株高隨著無機(jī)鹽濃度升高而升高。1/2 MS+ 0.2 mg/L NAA +20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂較其他處理略好，這與梁佼等［12］研究基本一致。因此，本實(shí)驗(yàn)直接利用毛地黃花梗誘導(dǎo)不定芽進(jìn)而建立組織培養(yǎng)與再生體系，具取材方便、流程簡單的優(yōu)點(diǎn)，有效提高了組培效率，可應(yīng)用于毛地黃的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

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（責(zé)任編輯：馮新）