胰島β細胞Metrnl基因敲除小鼠的鑒定及初步表型分析*

扈臘英， 黃亞莉， 劉露， 王貴芳， 常雪冰， 宋鈴榆， 周宇霞， 郭兵

（貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室，貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

糖尿?。╠iabetes mellitus）是一種全球范圍流行的代謝性疾病。該疾病以高血糖為特點，對人們的身體健康和病人的生活質量造成極大的危害［1］。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Faderation， IDF）的最新統(tǒng)計，2021年全球約有5.37億人患有糖尿病；到2030年，這一數(shù)字預計將達到6.43億；到2045年，世界上被診斷為糖尿病患者數(shù)據(jù)可能突破7.83億人［2］。

胰島β細胞衰竭和外周組織中的胰島素抵抗（insulin resistance， IR）是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM）的關鍵病理生理機制［3-8］。胰島β細胞是機體僅有的能夠分泌胰島素的內分泌細胞，對維護體內的葡萄糖代謝平衡具有關鍵的意義［9-10］。在T2DM發(fā)病過程中，胰島素抵抗導致外周組織和靶組織生理效應降低，此時，胰島β細胞發(fā)揮分泌胰島素的作用以維持糖代謝正常，但隨著胰島素抵抗的持續(xù)進行，β細胞代償性分泌的胰島素仍不能使血糖恢復到基礎水平，最終β細胞的過度分泌導致其功能減退，引起機體血糖升高［11-13］，從而引發(fā)為T2DM，但胰島β細胞功能障礙的機制遠未清楚。因此，廣泛開展β細胞功能障礙的機制研究，尋找胰島β細胞功能障礙的關鍵分子，是糖尿病研究領域的重要科學問題。

Metrnl （meteorin-like protein）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，由311個氨基酸構成［14-15］。最先是在脂肪組織中發(fā)現(xiàn)，故稱之為脂肪因子。主要表達于脂肪組織、粘膜組織、神經系統(tǒng)、皮膚及活化的巨噬細胞中，可通過脂肪組織、皮膚及粘膜進行分泌，屬于分泌蛋白［16-18］。已有研究報道，Metrnl通過STAT6調控白色脂肪向棕色脂肪轉化，改善肥胖引起的胰島素抵抗［19］。在肌肉組織中，Metrnl通過AMPK和PPARδ信號通路調控炎癥和改善胰島素抵抗［20］。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血清中Metrnl含量顯著下降［21-22］，且在糖尿病腎病中［23］，Metrnl能減輕糖尿病引起的腎小管損傷，減輕腎功能障礙。越來越多的研究表明，Metrnl在糖尿病疾病的進展中發(fā)揮者重要作用。課題組前期研究結果提示，培養(yǎng)基中加入Metrnl重組蛋白可以促進棕櫚酸作用下胰島β細胞中胰島素前體的蛋白表達，且能改善β細胞胰島素分泌功能。文獻報道，外源過表達Metrnl可以促進β細胞的增殖，抑制其凋亡，從而改善β細胞功能［24］。以上表明，Metrnl的全身效應或是單獨體外效應表明其可影響胰島功能，但Metrnl作為可經大部分組織分泌的蛋白，胰島β細胞中Metrnl的敲除是否真正影響整個機體功能，目前未見報道，有待本課題組后期在敲除小鼠上作進一步研究。因此，為了更加深入地了解Metrnl的功能，本課題組基于Cre-LoxP系統(tǒng)［25-27］，成功將胰島β細胞中的Metrnl基因敲除，以便進一步明確Metrnl在胰腺β細胞中的特定作用，為動物水平探索Metrnl在糖尿病中的發(fā)病機制提供研究基礎。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 條件性胰島β細胞特異性表達Cre重組工具鼠Ins2-Cre、Metrnlfloxp/+雜合鼠（合格證編號為T020700），購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。所有小鼠置于潔凈的層流動物房內，溫度控制在20~25 ℃，濕度控制在40%~70%，12h光照，晝夜交替。小鼠引進后于貴州醫(yī)科大學動物中心SPF級動物房進行繁育，所有動物研究實驗方案均經貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，文件編號為2000013。

1.2 主要試劑 鼠尾基因組DNA裂解液；蛋白酶K（10 mg/mL）；DNA提取酚試劑（Solarbio）；Agar瓊脂糖（Yeasen）。Metrnl抗體（Abcam）；insulin抗體（Servicebio）；免疫組化顯色試劑盒（Gene Tech）；Alexa FluorTM488標記的羊抗鼠IgG（Invitrogen）；含DAPI抗熒光衰減封片劑（Solarbio）；SYBR?Premix Ex-Taq?Ⅱ試劑盒（TaKaRa）；膠原酶V（Sigma）； Hanks平衡鹽溶液（Solarbio）；胰島素檢測試劑盒（IMD）；賽索飛生物科技有限公司為本次實驗提供了全部合成的引物。

1.3 主要儀器 實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad）；紫外成像系統(tǒng)儀（Thermo Fisher）；血糖儀（魚躍）；激光共聚焦顯微鏡及正置顯微鏡（Olympus）。

2 實驗方法

2.1 Metrnl-KO小鼠構建原理及繁殖流程 以Metrnl基因的第2~4外顯子作為敲除區(qū)域。該區(qū)域包含766 bp的編碼序列，敲除該區(qū)域將導致蛋白質功能的破壞（構建策略見圖1）。將基因型均為Metrnlfloxp/+的小鼠按一雄兩雌合籠交配，子代中基因型有雜合鼠（Metrnlfloxp/+）、純合鼠（Metrnlfloxp/floxp）、野生型（wild-type， WT），通過PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定，篩選獲得基因型為Metrnlfloxp/floxp的純合小鼠，將鑒定為純合子（Metrnlfloxp/floxp）的小鼠與工具鼠（Ins2-Cre）合籠雜交，子代中通過PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將基因型為Metrnlfloxp/+；Cre+的小鼠與Metrnlfloxp/floxp小鼠再雜交一代，后代中基因型為Metrnlfloxp/floxp；Cre+的小鼠，即為胰島β細胞特異性Metrnl基因敲除鼠。

Figure 1. Schematic diagram of the generation of islet β cell-specific Metrnl knockout mice.圖1 胰島β細胞Metrnl基因敲除小鼠構建示意圖

2.2 小鼠基因組DNA提取 在小鼠出生第4周齡時，取小鼠尾巴（2~3 mm長）置于高壓滅菌的1.5 mL EP管中，加入500 μL裂解液及5 μL蛋白酶K，用保鮮膜將EP管包裹好，然后放入55 ℃恒溫干燥箱中經過消化過夜。第2天按照組織基因組DNA提取說明書步驟進行提取。DNA保存于-20 ℃冰箱中備用。

2.3 PCR和瓊脂糖凝膠電泳鑒定 實驗所需基因型鑒定引物序列見表1。通過PCR實驗，可將目的片段進行循環(huán)擴增，目的基因和Ins2-Cre工具鼠擴增反應條件分別見表2、3。采用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，每孔7 μL，以DL2000作為分子量Maker，電泳條件為140~150 V、30~45 min。紫外成像后可觀察到帶有floxp位點的Metrnl純合小鼠基因組擴增產物長度為370 bp，野生型為268 bp，雜合小鼠產物長度為268 bp和370 bp；Ins2-Cre重組酶工具鼠產物長度為203 bp。紫外凝膠系統(tǒng)儀成像后標記數(shù)據(jù)及保存圖像。

表1 基因型鑒定引物信息Table 1. Primer information for genotyping

表2 目的基因序列擴增循環(huán)條件Table 2. Objective gene sequence amplification cycle conditions

表3 Ins2-Cre擴增循環(huán)條件Table 3. Ins2-Cre amplification cycle conditions

2.4 免疫組化染色觀察胰島組織中Metrnl敲除效果 將切片放在78 ℃恒溫箱中烤片30 min后于二甲苯Ⅰ和Ⅱ內分別放置15 min脫蠟，再分別放入100%二甲苯Ⅰ、100%二甲苯Ⅱ及90%、80%、70%乙醇內依次脫水各5 min后用PBS洗3次，每次5 min；切片置于枸櫞酸鹽修復液中微波爐高火5 min轉至中火5 min修復，室溫冷卻后PBS清洗3次，每次5 min；過氧化氫室溫封閉阻斷內源性過氧化酶活性；PBS清洗，滴加Ⅰ抗（Metrnl抗體，1∶100）4 ℃孵育過夜；次日取出濕盒，室溫復溫30 min，滴加反應增強液，37 ℃孵育20 min；PBS清洗；滴加Ⅱ抗，37 ℃孵育20 min；PBS清洗后加DAB按1∶20顯色；蘇木素染色1min后采用，中性樹膠封片，鏡下觀察染色結果。

2.5 RT-qPCR檢測敲除鼠胰島組織中Metrnl、Ins-1和Ins-2的mRNA水平 小鼠鼠尾進行基因型鑒定以后，將目的基因鼠（Metrnlfloxp/floxp；Cre+）和同窩對照鼠（Metrnlfloxp/floxp）麻醉處死，按照上述方法分離出單個完整胰島于1.5 mL無酶EP管中，加入800 μL的Trizol試劑，勻漿器研磨組織后12 000 r/min離心15 min，取上層無色水相加入同體積的異丙醇后充分混勻，冰上靜置10 min后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，得到沉淀以后用75%乙醇洗滌2次，室溫放置15 min左右利于風干，接著加入20 μL無菌無酶水，-80 ℃保存?zhèn)溆?。實驗所需RT-qPCR引物信息見表4。

表4 RT-qPCR引物信息Table 4. Primer Information for RT-qPCR

2.6 免疫熒光染色觀察胰島組織中insulin蛋白表達情況 切片放在78 ℃恒溫箱中烤片30 min后于二甲苯Ⅰ和Ⅱ內分別放置15 min脫蠟，再分別放入100%二甲苯Ⅰ、100%二甲苯Ⅱ及90%、80%、70%乙醇內依次脫水各5 min后用PBS清洗；接著用1%-Triton打孔10 min；PBS清洗；4 ℃孵育Ⅰ抗（insulin抗體，1∶800）過夜，PBS洗5 min×3次；第2天取出濕盒，室溫復溫30 min后，37 ℃避光孵育熒光Ⅱ抗（1∶200）1 h，PBS洗3次，每次5 min；擦干片子，抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）封片后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結果。

2.7 小鼠胰島分離 選用8~10周齡雄性小鼠，麻醉后固定四肢成仰臥位，乙醇全身消毒，打開腹腔和胸腔，分開腸管，暴露胰腺組織以及胰管，使用小型動脈夾固定并封閉胰管與腸道交匯處。將濃度為0.5 g/L的Sigma膠原蛋白酶溶解在含7.5 mmol/L CaCl2的HBSS液中，每只小鼠注射4 mL左右，將頭皮針注射進胰腺管道，緩慢地將整個胰島鼓起，使其充滿膠原蛋白酶，然后將整個胰腺摘下，放入高壓滅菌的50 mL EP管中，并加入3 mL的Sigma膠原蛋白酶溶液，放入38 ℃水浴中消化10 min，消化過程中，將PE管輕輕振蕩2~4次，以確保消化過程的順利進行。消化完成后胰腺組織會呈現(xiàn)細小的顆粒狀，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，篩網過濾后低速離心，并使用新的RPMI-1640培養(yǎng)液清洗獲得的胰島組織，使用量程為10 μL移液槍在體式顯微境下反復挑取單個完整胰島。

2.8 腹腔注射葡萄糖耐量和胰島素耐量實驗（intraperitoneal glucose and insulin tolerance tests， IPGTT and IPITT） 小鼠禁食12 h后進行IPGTT，腹腔注射1.5 g/kg的葡萄糖，在葡萄糖注射0、15、30、60、90、120 min時測定血糖；48 h后按照0.5 U/kg劑量注射胰島素溶液，進行IPITT，以便評估小鼠對胰島素的耐受性。

2.9 葡萄糖刺激的胰島素分泌（glucose-stimulated insulin secretion， GSIS）實驗 按上述方法分離小鼠胰島后，每組10個胰島，實驗重復3次。胰島培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640新鮮培養(yǎng)液24 h，隨后將胰島培養(yǎng)在含2.8 mmol/L葡萄糖的KRBH緩沖溶液中平衡1 h，然后用16.7 mmol/L葡萄糖的KRBH緩沖液2 mL刺激胰島素分泌，37 ℃孵育1 h，取一部分緩沖液，使用胰島素超敏ELISA試劑盒測定胰島素含量，并裂解胰島，測定胰島素和總蛋白含量。

3 統(tǒng)計學處理

利用GraphPad Prism 8.3軟件開展統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。以均數(shù)±標準差（mean±SD）的形式顯示數(shù)據(jù)結果，并通過t檢驗來評價兩組之間的差異。實驗至少重復3次。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 胰島β細胞特異性Metrnl基因敲除小鼠基因型的鑒定

鼠尾基因組DNA進行PCR擴增后，經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，紫外成像儀拍照記錄圖像?；蛐蜑镸etrnlfloxp/+和Metrnlfloxp/floxp的條帶大小分別是268 bp和370 bp，Metrnl純合子為370 bp，其中268 bp為WT，見圖2A。將Metrnlfloxp/floxp小鼠與Ins-Cre工具鼠交配繁殖，篩選出子代基因型為Metrnlfloxp/+；Cre+的小鼠，該小鼠帶有大小為268 bp和370 bp的雜合條帶，且重組酶大小為203 bp，見圖2B。再將基因型為Metrnlfloxp/floxp的純合鼠與Metrnlfloxp/+；Cre+小鼠雌雄合籠雜交，如圖3所示，后代中基因型為Metrnlfloxp/floxp；Cre+的小鼠即為條件性胰島β細胞Metrnl基因敲除小鼠模型，目的小鼠基因型條帶大小為370 bp且?guī)в写笮?03 bp的重組酶。

Figure 2. The PCR genotyping results of mice. A： 3 and 6 are Metrnl homozygous mice， and 1， 2， 4 and 5 are heterozygous mice；B： 1， 3， 5， 6， 7 and 8 are Metrnlfloxp/+；Cre+ mice， and 2 and 4 are Metrnlfloxp/+；Cre- mice.圖2 小鼠基因型PCR鑒定結果

Figure 3. Genotyping of the target Metrnlfloxp/floxp；Cre+ mice. 1， 2 and 3 are the target mice. The band LoxP site is 370 bp and the expressed recombinase is 203 bp.圖3 胰島β細胞特異性Metrnl基因敲除小鼠基因型的鑒定

2 Metrnl基因敲除效果驗證及初步表型分析

2.1 RT-qPCR和免疫組化驗證小鼠胰島組織中Metrnl敲除效果 基因型鑒定后，將目的基因小鼠（Metrnlfloxp/floxp；Cre+）和同窩對照小鼠（Metrnlfloxp/floxp）麻醉處死，打開腹腔和胸腔，按照上述方法分離出單個完整胰島，根據(jù)RNA提取步驟進行操作，提取出總RNA后逆轉錄為cDNA，再按照qPCR步驟驗證Metrnl基因敲除效果。qPCR結果可見Metrnl-KO小鼠胰島中Metrnl的轉錄水平明顯低于對照鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖4A；免疫組化結果顯示，Metrnl-KO小鼠胰島中Metrnl蛋白表達與對照鼠相比差異有統(tǒng)計學意義，并且與qPCR結果相一致，見圖4B。

Figure 4. The Metrnl gene knockout was verified by RT-qPCR and IHC. A： the islets of mice were isolated， total RNA was extracted， and the mRNA level of Metrnl in the islets was verified by RT-qPCR （n=4）； B： Metrnl protein expression and quantitative analysis in islets by IHC （n=3）. Mean±SD. *P<0.05， **P<0.01 vs Metrnlfloxp/floxp.圖4 RT-qPCR和免疫組化驗證Metrnl基因敲除效果

2.2 Metrnl-KO小鼠糖耐量受損同時對胰島素敏感性降低 小鼠8周齡時，其空腹血糖與對照鼠相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但兩組之間體重沒有顯著差異（圖5A）。小鼠禁食12 h后，腹腔注射葡萄糖后小鼠血糖變化如圖5B所示，小鼠血糖在葡萄糖注射15 min時達到最大值，且Metrnl-KO組小鼠血糖下降較對照組緩慢，計算曲線下面積大于對照鼠，差異顯著（P<0.01），表明KO組小鼠對葡萄糖耐量受損較對照鼠嚴重。小鼠注射胰島素后血糖變化如圖5C所示，對照鼠血糖在60 min時達到最低，120 min恢復到注射前血糖水平，而KO組血糖下降明顯慢于對照鼠，通過計算曲線下面積發(fā)現(xiàn)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

Figure 5. Knockout of Metrnl gene resulted in impaired glucose tolerance and decreased insulin sensitivity. A： fasting blood glucose level and body weight of 8-week-old mice； B： blood glucose level and area under the curve （AUC） during intraperitoneal glucose tolerance test （IPGTT） at 15， 30， 60， 90 and 120 min； C： blood glucose level and AUC during intraperitoneal insulin tolerance test （IPITT） at 15， 30， 60， 90 and 120 min. Mean±SD. n=5. *P<0.05， **P<0.01 vs Metrnlfloxp/floxp.圖5 Metrnl-KO小鼠出現(xiàn)葡萄糖耐量和胰島素耐量受損

2.3 敲除鼠胰島組織中insulin蛋白及Ins-1、Ins-2 mRNA水平降低 HE染色可見，對照小鼠胰島形態(tài)飽滿，但Metrnl-KO小鼠胰島疏散，二者在形態(tài)上存在差別（圖6A）；免疫熒光染色結果可見，KO組胰島素蛋白表達水平低于對照鼠（圖6A）；RT-qPCR結果也顯示，KO組小鼠胰島素相關基因的mRNA水平明顯低于對照鼠（圖6B）。

Figure 6. The mice with Metrnl gene knockout showed lower insulin protein expression and insulin-related gene mRNA levels in islet tissues. A： HE staining， immunofluorescence staining and quantitative analysis of insulin （green） in islets of the mice； B：the mRNA levels of Ins-1 and Ins-2 in islets detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs Metrnlfloxp/floxp.圖6 Metrnl-KO小鼠胰島素蛋白表達及胰島素相關基因轉錄水平降低

2.4Metrnl敲除引起高糖刺激下胰島β細胞胰島素分泌減少 GSIS實驗結果顯示，從Metrnl-KO小鼠分離出來的胰島，經高濃度葡萄糖（16.7 mmol/L）刺激胰島后胰島素分泌減少（P<0.05）；與對照組相比，Metrnl-KO小鼠的胰島中胰島素含量減少，見圖7。

Figure 7. Metrnl deletion in β cells disrupted insulin secretion. A： insulin secretion of batches of 10 isolated mouse islets treated with low （2.8 mmol/L） or high （16.7 mmol/L） glucose was assessed by ELISA； B： insulin content in islets was assessed by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs Metrnlfloxp/floxp.圖7 β細胞特異性Metrnl缺失破壞胰島素分泌

討論

Metrnl是一種分泌蛋白，主要表達在骨骼肌和心?。?8-29］，其次是白色脂肪和褐色脂肪組織。Metrnl基因位于小鼠11號染色體和人類17號染色體上［30］。經過生物信息學分析，Metrnl蛋白前體在小鼠、大鼠和人類中均由311個氨基酸組成，第1~45位氨基酸為信號肽區(qū)域，該前體經剪切后，形成含266個氨基酸的成熟蛋白［15］。研究證實，脂肪組織中Metrnl的過表達會上調PPARγ的蛋白表達水平，進而抑制脂肪組織炎癥的發(fā)生，從而促進脂肪細胞分化，引起脂質代謝的激活［31］，最終緩解胰島素抵抗。可見，Metrnl作為一種分泌蛋白，緩解胰島素抵抗的效果甚好。研究發(fā)現(xiàn)，在高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠，當脂肪組織特異性敲除Metrnl后，與對照組相比，敲除鼠糖耐量和胰島素耐量曲線下面積明顯大于對照組［32］。

我們從實驗室引進LoxP雜合小鼠至繁殖10個月，共獲得目的小鼠18只，對照小鼠15只。其中，目的小鼠基因型為Metrnlfloxp/floxp；Cre+，同窩對照小鼠基因型為Metrnlfloxp/floxp。通過免疫組化和RT-qPCR實驗驗證Metrnl敲除效果，結果均提示胰島β細胞特異性Metrnl敲除鼠構建成功。我們課題組前期實驗結果顯示，Metrnl在db/db糖尿病小鼠胰島組織中表達下降，且β細胞中加入Metrnl重組蛋白可增加高糖刺激下的胰島素分泌，表明Metrnl在保護胰島β細胞功能方面發(fā)揮重要作用，但具體機制未見報道。因此，為了進一步去探索Metrnl是否真正改善胰島β細胞功能，我們建立了胰島β細胞Metrnl基因敲除小鼠，在小鼠8周齡時開展了IPGTT和IPITT，初步表型分析結果顯示，在0~60 min期間Metrnlfloxp/floxp；Cre+小鼠血糖水平的曲線下面積升高。免疫熒光染色結果顯示，KO小鼠胰島素表達較對照鼠有差異，且Ins-1和Ins-2的mRNA水平與對照鼠相比差異顯著，表明Metrnl的缺失在一定程度上會導致葡萄糖耐受不良以及對胰島素的敏感性降低?；诖瞬糠直硇徒Y果，我們認為在后期高脂肪飲食喂養(yǎng)時，Metrnl的敲除可能導致胰島β細胞的功能障礙，進而會嚴重惡化糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

Metrnl是一種分泌蛋白，不僅表達于胰島，其他組織（如肌肉、脂肪、腎等）也存在表達。胰島β細胞中敲除該基因后胰島素分泌是否存在代償作用？為了解決這個問題，我們將Metrnl-KO鼠和對照鼠進行胰島分離，結果顯示，Metrnl-KO小鼠的胰島在低糖水平和高糖水平下胰島素分泌均減少，且Metrnl-KO小鼠的胰島中胰島素含量降低。此部分結果表明，β細胞Metrnl的敲除影響胰島的胰島素分泌功能，但具體機制還不清楚，后期課題組將會開展更深入的研究。

本課題成功構建及驗證了Metrnl基因胰島β細胞特異性敲除小鼠模型并進行初步的表型分析，但對Metrnl-KO小鼠胰島β細胞的功能研究還不夠深入。因此，后期課題組將通過高脂飼養(yǎng)Metrnl-KO小鼠，實時記錄小鼠血糖及體重變化，提取原代胰島β細胞后，進一步開展形態(tài)學觀察和GSIS實驗，探究該基因的功能，從而為Metrnl基因與胰島β細胞功能之間深入研究奠定基礎。

既往研究初步顯示胰島β細胞中的Metrnl在維持β細胞功能和正常血糖方面發(fā)揮著重要作用。然而現(xiàn)階段，人們對Metrnl的蛋白質結構、作用機制和受體等方面尚不明確，Metrnl的研究勢必將成為分泌蛋白領域的一個新熱點，尤其是Metrnl在胰島β細胞中具體功能的深入研究更為重要。因此，本研究采用Cre-LoxP系統(tǒng)成功構建了胰島β細胞Metrnl基因條件敲除小鼠，為2型糖尿病發(fā)病機制的研究提供了較為理想的動物模型，從而為臨床研究提供有力的支持。