青藤堿對(duì)缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)的甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞“干性”的影響及機(jī)制研究*

綦彬， 范浩， 王博， 袁燕， 毛偉明△

（1長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 黃岡 434023；2黃岡市中心醫(yī)院，湖北 黃岡 438000；3長(zhǎng)江大學(xué)，湖北 荊州 434023）

甲狀腺癌（thyroid cancer， TC）是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，近幾十年來全球發(fā)病率持續(xù)上升［1］。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma， PTC）是TC最常見的病理類型，約占80%~85%，經(jīng)過常規(guī)手術(shù)治療和放射性碘治療后，大多數(shù)PTC患者預(yù)后良好，但仍有20%~30%的患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是TC相關(guān)死亡的主要原因［2-4］。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells， CSCs）是存在于腫瘤中具有自我更新和異質(zhì)性分化能力的側(cè)群細(xì)胞，其在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、增殖和復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮作用［3］。缺氧/低氧（hypoxia， Hyp）是CSCs形成和維持的關(guān)鍵因素，Hyp微環(huán)境可以維持癌細(xì)胞的未分化狀態(tài)，提高其克隆率［5］。目前，已有研究學(xué)者在TC實(shí)體腫瘤和細(xì)胞系中分選和鑒定出具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞側(cè)群［6-7］，并證實(shí)Hyp可促進(jìn)TC細(xì)胞中“干性”側(cè)群細(xì)胞數(shù)量的增加［8］，提示CSCs可能是導(dǎo)致PTC患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因。因此，靶向CSCs可能是一種有前途的PTC治療策略。

青藤堿（sinomenine， SME）是一種從青藤的根和莖中分離出來的芐基四氫異喹啉型生物堿，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、降低血糖等多種功效，被廣泛的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾?。?-11］。研究表明，SME在多種癌癥中均有抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)耐藥性、抗血管生成等［11］。有研究報(bào)道，SME可以抑制乳腺癌干細(xì)胞的“干性”［12］，并且通過調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和CSCs“干性”抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移［13］。另有研究報(bào)道，SME可下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)［14］，提示SME可能在Hyp條件下通過調(diào)控HIF-1α表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞“干性”。然而，SME對(duì)PTC細(xì)胞“干性”的影響及作用機(jī)制還有待研究。本研究以人PTC細(xì)胞系TPC-1為研究對(duì)象，探討SME對(duì)Hyp微環(huán)境誘導(dǎo)的PTC細(xì)胞“干性”的影響及其機(jī)制，以期為PTC的治療提供潛在新藥物。

材料和方法

1 細(xì)胞和主要試劑

TPC-1細(xì)胞購自American Type Culture Collection（ATCC）。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液和DMEM/F12培養(yǎng)液購自Gibco；RIPA裂解液、MTT試劑、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG Ⅱ抗和Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）熒光Ⅱ抗購自上海碧云天生物科技公司；小泛素相關(guān)修飾蛋白（small ubiquitin-related modifier， SUMO）特異性蛋白酶1（SUMO-specific protease-1，SENP-1）基因過表達(dá)載體及質(zhì)粒由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)并合成；Lipofectamine 3000試劑購于Invitrogen；SENP-1抗體、SUMO1抗體和HIF-1α單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；GAPDH抗體購自Abcam；EpiQuik? In Vivo Protein Sumoylation Assay Ultra Kit購自Epigentek。

2 主要儀器

超凈工作臺(tái)（Hfsafe-1500）購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；多功能酶標(biāo)儀（SYNERGY）購自BioTek；倒置顯微鏡（BM2100）購自南京江南永新光有限公司；流式細(xì)胞儀（Accuri C6）購自BD；暗盒（II型-X射線）購自中山蔚藍(lán)醫(yī)療器械有限公司。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) TPC-1細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)需求分別置于常氧和Hyp條件下培養(yǎng)，其中常氧培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、21%O2，Hyp培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、1% O2。

3.2 MTT實(shí)驗(yàn) 將TPC-1細(xì)胞以每孔4×103個(gè)接種到96孔板上，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，更換含有不同濃度SME的DMEM培養(yǎng)液，置于常氧條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μL MTT，孵育4 h，棄去孔內(nèi)液體，并加入150 μL DMSO溶解甲臜，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）。

3.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 （1）將TPC-1細(xì)胞分為對(duì)照（control， CON）組、Hyp組、Hyp+0.25 mmol/L SME組、Hyp+0.5 mmol/L SME組和Hyp+1 mmol/L SME組，其中CON組細(xì)胞置于常氧條件下培養(yǎng)48 h，Hyp組細(xì)胞置于Hyp條件下培養(yǎng)48 h，Hyp+0.25、0.5和1 mmol/L SME組分別加入相應(yīng)濃度SME后置于Hyp條件下培養(yǎng)48 h。（2）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TPC-1細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，于常氧條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)到70%時(shí)，將細(xì)胞分為blank組、空載質(zhì)粒（vector）組和SENP-1基因過表達(dá)（oe-SENP-1）組。參照Lipofectamine 3000試劑盒說明書將oe-SENP-1及其陰性對(duì)照vector轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞并采用下述qRTPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中SENP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。再將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分為Hyp組、Hyp+SME組、Hyp+oe-SENP-1組和Hyp+SME+oe-SENP-1組，其中SME干預(yù)濃度為1 mmol/L，均置于Hyp條件下培養(yǎng)48 h。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞亞群 收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106/100 μL，取100 μL細(xì)胞懸液，設(shè)陰性對(duì)照（negative control， NC）組，分別依次加入20 μL FITC標(biāo)記的CD44抗體和PE標(biāo)記的CD24抗體，4 ℃避光孵育30 min，離心棄上清，預(yù)冷PBS洗滌2次，再加入500 μL PBS重懸，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析CD44+/CD24-細(xì)胞亞群所占比例。

3.5 qRT-PCR檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Nanog的上游引物序列為5′-ACCTATGCCTGTGATTTGTGG-3′，下游引物序列為5′-AGTGGGTTGTTTGCCTTTGG-3′；八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4， OCT4）的上游引物序列為5′-TCCACTTTGTATAGCCGCTGG-3′，下游引物序列為5′-TGCATACACACAAACACAGCAA-3′；SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2（SRY-box transcription factor 2，SOX2）的上游引物序列為5′-TCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG-3′，下游引物序列為5′-CGCCGCCGATGATTGTTATTA-3′；SENP-1的上游引物序列為5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，下游引物序列為5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAGGCA-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3.6 腫瘤細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TPC-1細(xì)胞，用添加干細(xì)胞刺激因子（包括10 μg/L B27、20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和20 μg/L表皮生長(zhǎng)因子）的無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種于低吸附6孔板中，采用不同濃度SME處理。培養(yǎng)10 d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成球情況，并統(tǒng)計(jì)每孔中成球數(shù)。

3.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，采用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，離心取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白樣品，SDS-PAGE分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌3次，加入Ⅰ抗（SENP-1、SUMO1和HIF-1α抗體，1∶800；GAPDH抗體，1∶1 000），4 ℃過夜孵育。次日，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔、小鼠IgGⅡ抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。TBST洗滌3次，滴加顯影液，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。以GAPDH為內(nèi)參照，通過ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

3.8 免疫熒光染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TPC-1細(xì)胞，以3×105個(gè)細(xì)胞/孔密度接種至內(nèi)置有無菌蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。培養(yǎng)48 h后，1× PBS洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1% NP-40透化5 min，再經(jīng)5%山羊血清封閉1 h，滴加HIF-1α單克隆抗體（1∶100）孵育1 h，1× PBS洗滌細(xì)胞3次，滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）熒光Ⅱ抗（1∶500）避光孵育1 h，隨后滴加DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染5 min。取出蓋玻片，滴加防淬滅劑，置于熒光顯微鏡下拍照觀察。

3.9 SUMO化水平檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，使用核蛋白提取試劑提取核蛋白，隨后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。按EpiQuik? In Vivo Protein Sumoylation Assay Ultra Kit說明書操作，每組取10 μg核蛋白檢測(cè)，最后用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各組吸光度（A）。SUMO化水平（%）=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析或兩因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 青藤堿對(duì)Hyp微環(huán)境下TPC-1細(xì)胞“干性”的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常氧條件下，不同濃度（0、0.25、0.5、1、2、4和8 mmol/L）SME處理后，TPC-1細(xì)胞活力逐漸降低（P<0.01），見圖1A。為了避免因細(xì)胞活力降低影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇0.25、0.5和1 mmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中SME的干預(yù)濃度。qRTPCR結(jié)果顯示，與CON組比較，Hyp組細(xì)胞中Nanog、OCT4和SOX2的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；與Hyp組比較，SME干預(yù)后細(xì)胞中Nanog、OCT4和SOX2的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），且具有濃度依賴性，見圖1B。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與CON組比較，Hyp組CD44+/CD24-細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01）；與Hyp組比較，SME干預(yù)后CD44+/CD24-細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.01），且具有濃度依賴性，見圖1C。腫瘤細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與CON組比較，Hyp組腫瘤干細(xì)胞成球個(gè)數(shù)顯著增加（P<0.01），成球體積變大；與Hyp組比較，SME干預(yù)后腫瘤干細(xì)胞成球個(gè)數(shù)均顯著減少（P<0.01），成球體積變小，且具有濃度依賴性，見圖2。

Figure 2. Pellet formation of tumor stem cells in each group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control （CON） group，##P<0.01 vs hypoxia（Hyp） group.圖2 各組腫瘤干細(xì)胞成球情況

2 青藤堿對(duì)Hyp微環(huán)境下TPC-1細(xì)胞中HIF-1α蛋白SUMO化的影響

Western blot結(jié)果顯示，與CON組比較，Hyp組細(xì)胞中SENP1和HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而SUMO1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；與Hyp組比較，SME干預(yù)后細(xì)胞中SENP1和HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而SUMO1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），且具有濃度依賴性，見圖3A。試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與CON組比較，Hyp組細(xì)胞中HIF-1α蛋白SUMO化水平顯著降低（P<0.01）；與Hyp組比較，SME干預(yù)后HIF-1α蛋白SUMO化水平均顯著增加（P<0.01），且具有濃度依賴性，見圖3B。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組比較，Hyp組中TPC-1細(xì)胞中HIF-1α蛋白綠色熒光增強(qiáng)，且主要定位于細(xì)胞核中；與Hyp組比較，SME干預(yù)后各組TPC-1細(xì)胞中HIF-1α蛋白綠色熒光逐漸減弱，并且HIF-1α蛋白由細(xì)胞核逐漸向胞漿中轉(zhuǎn)位，且具有濃度依賴性。見圖4。

Figure 3. The protein levels of SENP1， SUMO1 and HIF-1α （A） and the SUMO level of HIF-1α protein （B） in TPC-1 cells of each group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control （CON） group； ##P<0.01 vs hypoxia （Hyp） group.圖3 各組TPC-1細(xì)胞中SENP1、SUMO1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平及HIF-1α蛋白SUMO化水平

Figure 4. Distribution of HIF-1α protein in TPC-1 cells of each group （×400）.圖4 各組TPC-1細(xì)胞中HIF-1α蛋白分布情況

3 過表達(dá)SENP-1逆轉(zhuǎn)青藤堿Hyp微環(huán)境下對(duì)TPC-1細(xì)胞“干性”的抑制作用

構(gòu)建SENP-1基因過表達(dá)的TPC-1細(xì)胞株，qRTPCR和Western blot結(jié)果顯示，與blank組和vector組比較，oe-SENP-1組細(xì)胞中SENP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），見圖5。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與Hyp組比較，Hyp+oe-SENP-1組CD44+/CD24-細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01）；與Hyp+SME組比較，Hyp+SME+oe-SENP-1組CD44+/CD24-細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01），見圖6。qRT-PCR結(jié)果顯示，與Hyp組比較，Hyp+oe-SENP-1組細(xì)胞中Nanog、OCT4和SOX2的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）；與Hyp+SME組比較，Hyp+SME+oe-SENP-1組細(xì)胞中Nanog、OCT4和SOX2的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），見圖7。

Figure 5. The mRNA （A） and protein （B） expression levels of SENP-1 in TPC-1 cells of each group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs blank group.圖5 各組TPC-1細(xì)胞中SENP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平

Figure 6. Proportion of CD44+/CD24- cells in TPC-1 cells of each group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs hypoxia（Hyp） group； ##P<0.01 vs Hyp+sinomenine （SME） group.圖6 各組TPC-1細(xì)胞中CD44+/CD24-細(xì)胞比例

Figure 7. The mRNA expression levels of Nanog， OCT4 and SOX2 in TPC-1 cells of each group. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs hypoxia（Hyp） group； ##P<0.01 vs Hyp+sinomenine （SME） group.圖7 各組TPC-1細(xì)胞中Nanog、OCT4、SOX2的mRNA表達(dá)水平

4 青藤堿通過調(diào)控HIF-1α蛋白去SUMO化抑制Hyp微環(huán)境下TPC-1細(xì)胞“干性”

Western blot結(jié)果顯示，與Hyp組比較，Hyp+SME組細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而Hyp+oe-SENP-1組細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；與Hyp+SME組比較，Hyp+SME+oe-SENP-1組細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平又顯著升高，見圖8A。試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與Hyp組比較，Hyp+SME組細(xì)胞中HIF-1α蛋白SUMO化水平顯著升高（P<0.01），而Hyp+oe-SENP-1組細(xì)胞中HIF-1α蛋白SUMO化水平顯著降低（P<0.01）；與Hyp+SME組比較，Hyp+SME+oe-SENP-1組HIF-1α蛋白SUMO化水平又顯著降低（P<0.01），見圖8B。

Figure 8. The protein level of HIF-1α （A） and the SUMO level of HIF-1α protein（B） in TPC-1 cells of each group.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs hypoxia （Hyp） group；##P<0.01 vs Hyp+sinomenine （SME） group.圖8 各組TPC-1細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平及HIF-1α蛋白SUMO化水平

討論

TC由不同種類的腫瘤細(xì)胞組成，包括小部分未分化的細(xì)胞，這些細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞特性，如無限增殖潛力和分化能力［15］。放射碘療法和化療等治療TC手段的靶向目標(biāo)主要是代謝活躍、快速分裂的成熟TC細(xì)胞，而不是CSCs［15］。此外，有研究報(bào)道稱，Hyp可促進(jìn)TC細(xì)胞CSCs數(shù)量的增加，提示CSCs可能是導(dǎo)致PTC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因［8］。因此，靶向治療CSCs對(duì)降低PTC復(fù)發(fā)率顯得愈發(fā)重要。SME是一種從中藥青藤中提取的生物堿單體，已被證實(shí)可以對(duì)肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種癌癥起到抗腫瘤作用［11］。然而，SME對(duì)PTC細(xì)胞的影響有待研究。本研究顯示，在常氧條件下SME可以抑制TPC-1細(xì)胞增殖，并且具有濃度依賴性。有研究報(bào)道，SME可以抑制乳腺癌干細(xì)胞“干性”，并且可以抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移［13］。至于SME是否影響PTC細(xì)胞“干性”需進(jìn)一步研究。

干細(xì)胞生態(tài)位是一個(gè)復(fù)雜的、異型的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞外基質(zhì)、鄰近的生態(tài)位細(xì)胞、分泌的可溶性信號(hào)因子、物理信號(hào)和環(huán)境信號(hào)［16］。Hyp微環(huán)境是促進(jìn)CSCs在腫瘤中持續(xù)存在的重要干細(xì)胞生態(tài)位，而且是導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的主要原因［17-18］。研究報(bào)道，CSCs的標(biāo)志物如CD44、Nanog、OCT4和SOX2表達(dá)已被用于識(shí)別TC中的CSCs［19］。本研究顯示，Hyp條件下TPC-1細(xì)胞CD44+/CD24-亞群比例比在常氧條件下明顯升高，同時(shí)細(xì)胞中Nanog、OCT4、SOX2 mRNA表達(dá)水平顯著升高，而Hyp條件下的TPC-1細(xì)胞比在常氧條件下形成更多的腫瘤干細(xì)胞球，且體積更大。結(jié)果提示，Hyp條件下TPC-1細(xì)胞的“干性”特征明顯增強(qiáng)。

隨著TC病情進(jìn)展，其可能受到Hyp應(yīng)激，導(dǎo)致Hyp信號(hào)通路激活［15］。HIF是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的主要因子，由氧敏感的α亞基和穩(wěn)定的β亞基組成，其作為多個(gè)基因靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，主要涉及細(xì)胞周期調(diào)控、厭氧代謝、細(xì)胞內(nèi)pH維持和血管生成，可以使腫瘤細(xì)胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境［15-16］。有研究表明，TC中HIF-1α的過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［15］。SUMO化是一種重要的翻譯后蛋白質(zhì)修飾，促進(jìn)蛋白降解，其參與多種細(xì)胞過程，如轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［20］。SUMO化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，很容易被一個(gè)特定的SENPs家族逆轉(zhuǎn)，這個(gè)過程稱為去SUMO化，在這個(gè)過程中，SENPs將SUMO綴合物從綴合蛋白中移除［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，Hyp條件下TPC-1細(xì)胞SENP1和HIF-1α蛋白表達(dá)水平較常氧條件下明顯升高，而SUMO1蛋白表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)細(xì)胞中HIF-1α蛋白SUMO化水平顯著降低。進(jìn)一步檢測(cè)HIF-1α蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布情況，發(fā)現(xiàn)Hyp條件下的TPC-1細(xì)胞中HIF-1α蛋白主要位于細(xì)胞核內(nèi)。結(jié)果提示，Hyp條件下TPC-1細(xì)胞中SENP-1蛋白表達(dá)水平升高，導(dǎo)致HIF-1α蛋白去SUMO化，使HIF-1α蛋白不被降解，并促進(jìn)HIF-1α蛋白向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在Hyp條件下SME可以降低制TPC-1細(xì)胞中SENP-1蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)HIF-1α蛋白SUMO化，使其降解，抑制其進(jìn)入細(xì)胞核，且有濃度依賴性。

通過干預(yù)HIF-1α蛋白SUMO化過程，進(jìn)一步觀察SME對(duì)TPC-1細(xì)胞“干性”的影響。研究報(bào)道，SENP-1通過促進(jìn)HIF-1α蛋白的去SUMO化，從而穩(wěn)定HIF-1α蛋白不被降解，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，并且促進(jìn)癌癥“干性”［20-21］。本研究構(gòu)建SENP-1基因過表達(dá)細(xì)胞，進(jìn)一步確認(rèn)SME可以通過抑制Hyp條件下HIF-1α蛋白的去SUMO化，降低HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制TPC-1細(xì)胞“干性”。結(jié)果顯示，在Hyp條件下，SENP-1過表達(dá)可增強(qiáng)TPC-1細(xì)胞的“干性”，降低HIF-1α蛋白SUMO化水平，升高HIF-1α蛋白表達(dá)水平；且SENP-1過表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)SME對(duì)TPC-1細(xì)胞“干性”的抑制作用，上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)水平，并降低HIF-1α蛋白SUMO化水平。

綜上所述，SME可以通過抑制Hyp條件下HIF-1α蛋白的去SUMO化，降低HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制TPC-1細(xì)胞“干性”。這可以為今后PTC的治療提供理論依據(jù)。當(dāng)然，本研究難免存在不足，如未在動(dòng)物水平驗(yàn)證SME對(duì)TC細(xì)胞干性的影響，因此計(jì)劃后期在動(dòng)物水平展開進(jìn)一步驗(yàn)證。