lncRNA-TUG1靶向Zeste同源物增強子2對缺氧心肌細胞的影響*

常晨， 許玉莉， 任艷玲， 李金軼， 蘇強，2△

（1桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 541000；2廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

心肌梗死（myocardial infarction， MI）是全球心血管疾病發(fā)病和死亡的主要原因。盡管心肌再灌注治療已普遍開展，但冠狀動脈血流恢復后不可避免的產(chǎn)生再灌注損傷，這不僅會加劇缺血部位損傷，還會牽連先前未受累的正常心肌組織［1］。氧化應激以及炎癥反應被認為是MI誘導心肌細胞損傷的主要因素［2］。Zeste同源物增強子2（enhancer of Zeste homolog 2， EZH2）是一種組蛋白甲基移換酶，介導血管內(nèi)皮細胞的形成［3］。此外，抑制EZH2可促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）的表達［4］。研究顯示過表達長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA）-牛磺酸上調(diào)基因1（taurine up-regulated gene 1， TUG1）可能是缺氧心肌細胞損傷的重要原因［5］。其中涉及的機制部分歸因于eNOS和BDNF的蛋白表達水平降低，并可能進一步通過影響炎癥反應和線粒體生物合成，參與心肌細胞損傷［6］。此外，我們前期研究［6］顯示沉默TUG1有益于緩解MI后心功能損傷。然而，lncRNATUG1是否通過EZH2途徑影響eNOS和BDNF的表達以及緩解缺氧心肌細胞中線粒體功能紊亂和炎癥反應有待證實。因此，本研究構(gòu)建HL-1細胞缺氧模型進行探究驗證，進一步探索缺氧誘導的心肌細胞中l(wèi)ncRNA-TUG1對EZH2以及eNOS和BDNF的影響。此外，我們還探討了沉默TUG1的表達對線粒體合成功能和炎癥反應的影響，這為MI的治療提供參考資料。

材料和方法

1 細胞系及試劑

HL-1心肌細胞系購自湖南豐暉生物科技有限公司。肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CKMB）、心肌鈣蛋白I（cardiac troponin I， cTnI）、肌紅蛋白（myoglobin， MYO）、白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）ELISA試劑盒購自Cusabio；EZH2抗體（21800-1-AP）購自Proteintech；GAPDH抗體（ab22555）、histone H3抗體（ab1791）和兔IgG抗體（ab172730）購自Abcam；HRP標記的Ⅱ抗（A0216）購自Beyotime；SYBR?Premix Ex Taq、PrimeScriptTMRT試劑盒和總RNA提取試劑盒購自TaKaRa；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶購自HyClone；CCK-8試劑盒購自Beyotime；質(zhì)粒中量抽提試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司；ChIP試劑盒購自Millipore。所用引物由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，序列見表1。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組處理 HL-1細胞用高糖DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素），并置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。構(gòu)建siTUG1和對照質(zhì)粒siNC并分別轉(zhuǎn)染至HL-1細胞內(nèi)，隨機分成常氧（normoxia）組、缺氧（hypoxia）組、hypoxia+siNC組和hypoxia+siTUG1組。將normoxia組置于常氧條件（37 ℃、5% CO2），其余組置于缺氧條件（1% O2、5% CO2、94% N2）下培養(yǎng)24 h［7］。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染實驗 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整密度至2×107/L，接種于96孔板中（每孔各100 μL）。細胞貼壁后轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染方法如下：（1）稀釋質(zhì)粒：用50 μL的Opti-MEM稀釋200 μmol/L的siRNA，混勻后于室溫孵育5 min；（2）稀釋Lipo3000：用50 μL Opti-MEM稀釋10 μL Lipo3000，混勻并室溫孵育5 min。將（1）與（2）混勻并于室溫孵育20 min，加入24孔板中（每孔各50 μL）后并置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后分裝用于后續(xù)實驗。

2.3 CCK-8實驗 將對數(shù)生長期的HL-1細胞，以2×107/L密度接種于96孔板（每組6個復孔，每孔100 μL）。細胞貼壁后轉(zhuǎn)染siNC和siTUG1。根據(jù)分組，將hypoxia組、hypoxia+siNC組和hypoxia+siTUG1組置于缺氧條件下培養(yǎng)。待24 h后，向培養(yǎng)液中加入20 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀中450 nm處測定吸光度（A）值［8］。

2.4 ChIP實驗 采用ChIP試劑盒，通過酶消化將細胞交聯(lián)染色質(zhì)超聲破碎后于4 ℃、16 099.2×g離心10 min，除去不溶解的沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中分為50 μL一份。將超聲后的50 μL的樣本置于冰上，加入450 μL稀釋液（含2.25 μL蛋白酶抑制劑），混勻后移取5 μL上清液為內(nèi)參照“Input”。以IgG為陰性對照。分別加入不同抗體和20 μL混勻的蛋白A磁珠后于4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。使用磁力架將蛋白A磁珠沉淀下來后洗滌并去除上清。進一步洗脫蛋白質(zhì)-DNA復合物和反交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA復合物為單獨的DNA，加入100 μL ChIP清洗緩沖液，62 ℃振蕩孵育2 h后再于95 ℃孵育10 min［9］。然后將樣品置于室溫冷卻，將提取的DNA純化和RT-qPCR檢測。

2.5 RT-qPCR實驗 Trizol試劑盒提取總RNA后按照PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照SYBR?Premix Ex Taq試劑盒檢測PCR擴增產(chǎn)物，復孔檢測后根據(jù)2-ΔΔCt法進行比較［6］。

2.6 Western blot實驗 提取細胞蛋白，測定蛋白濃度。上樣行電泳并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉結(jié)束后于4 ℃加入Ⅰ抗過夜孵育；次日用TBST洗膜后于室溫加入Ⅱ抗孵育2 h，待再次洗膜后進行化學發(fā)光法顯色，在化學發(fā)光成像儀下拍照分析。

2.7 ELISA實驗 取各組細胞培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說明書檢測心肌損傷標志物cTnI、CKMB、MYO及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。96孔板中加入待測樣本及標準品，于37 ℃恒溫孵育，加入生物素標記的抗體孵育后加入HRP標記的抗生物素蛋白孵育。洗滌后加入TMB顯色底物溶液于37 ℃避光顯色，加入終止液終止反應，在450 nm波長處測定A值［6］。

3 統(tǒng)計學處理

每組實驗至少重復3次，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。采用SPSS 24.0軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 9.5作圖。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 lncRNA-TUG1在HL-1細胞系各分組中表達

如圖1所示，缺氧可誘導HL-1心肌細胞lncRNA-TUG1表達顯著升高（P<0.05）。此外，與hypoxia組和hypoxia+siNC組相比，hypoxia+siTUG1組lncRNA-TUG1表達顯著降低（P<0.05）。

Figure 1. RT-qPCR measurement of the expression of lncRNATUG1 in the cells of different groups. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖1 RT-qPCR檢測lncRNA-TUG1在各組細胞中的表達

2 lncRNA-TUG1通過EZH2途徑影響B(tài)DNF和eNOS的表達

ChIP分析顯示，沉默TUG1的表達可進一步抑制EZH2與eNOS和BDNF啟動子區(qū)域的結(jié)合（P<0.05），見圖2。

Figure 2. Effects of lncRNA-TUG1 on the interaction of EZH2 with the promoter regions of eNOS （A） and BDNF （B）. IgG was used as a negative control and H3 as a positive control. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖2 lncRNA-TUG1靶向EZH2與eNOS和BDNF啟動子區(qū)域間的相互作用

3 沉默TUG1表達緩解缺氧對HL-1細胞活力的抑制

與normoxia組相比，hypoxia組和hypoxia+siNC組細胞活力明顯降低（P<0.05）；相較于hypoxia組和hypoxia+siNC組，hypoxia+siTUG1組細胞活力得到顯著改善（P<0.05），見圖3。

Figure 3. Evaluation of cardiomyocyte viability by CCK-8 assay.Mean±SEM. n=6. **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖3 CCK-8分析心肌細胞活力

4 沉默TUG1表達降低缺氧誘導的HL-1細胞心肌損傷標志物的表達水平

與normoxia組相比，hypoxia組和hypoxia+siNC組CKMB、cTnI和MYO均顯著升高（P<0.05），而沉默TUG1表達能夠部分逆轉(zhuǎn)上述指標，見圖4。

Figure 4. Measurement of markers of myocardial injury by ELISA. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖4 ELISA檢測心肌損傷標志物

5 沉默TUG1表達促進缺氧誘導的HL-1細胞線粒體生物合成

與normoxia組相比，hypoxia組和hypoxia+siNC組線粒體生物合成相關轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1， NRF1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1， PGC-1）和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）的表達水平顯著降低（P<0.05）；與hypoxia組和hypoxia+siNC組相比，hypoxia+siTUG1組NRF1、PGC-1和TFAM蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），見圖5A。RT-qPCR結(jié)果同樣顯示，沉默TUG1后NRF1、PGC-1和TFAM的mRNA水平均顯著回升（P<0.05），見圖5B~D。

Figure 5. The expression of mitochondrial biosynthesis-related transcriptional regulator genes was detected by Western blot and RT-qPCR. A： Western blot showing the expression of mitochondrial biosynthesis-related proteins； B， C and D： the mRNA expression of mitochondrial biosynthesis-related genes. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖5 Western blot和RT-qPCR檢測線粒體生物合成相關轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因

6 沉默TUG1表達抑制缺氧誘導的HL-1細胞炎癥反應

RT-qPCR結(jié)果顯示，與normoxia組相比，hypoxia組和hypoxia+siNC組IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達顯著升高（P<0.05）；與hypoxia組和hypoxia+siNC組相比，hypoxia+siTUG1組IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達受到顯著抑制（P<0.05），見圖6A~C。ELISA結(jié)果顯示，沉默TUG1能顯著抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放（P<0.05），見圖6D~F。

Figure 6. RT-qPCR and ELISA for inflammatory factors. RT-qPCR showing the mRNA expression of inflammatory factors： IL-1β（A）， IL-6 （B） and TNF-α （C）； ELISA for inflammatory factors： IL-1β （D）， IL-6 （E） and TNF-α （F）. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖6 RT-qPCR和ELISA檢測炎癥因子

討論

TUG1位于人染色體22q12.2，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是長度為7.1 kb的lncRNA［10］。lncRNA-TUG1被認為是心血管疾病預后不良的生物標志物［11］。lncRNA-TUG1在缺氧心肌細胞中過表達，并可能通過刺激ROS的產(chǎn)生，加重心肌細胞損傷［12］。此外，先前研究［6］顯示在小鼠MI模型中沉默TUG1可進一步通過抗炎發(fā)揮心肌保護作用。部分可能歸因于沉默TUG1表達后進一步上調(diào)了eNOS和BDNF的水平［6］。然而，其中具體機制尚不明確。本研究構(gòu)建HL-1細胞缺氧模型，通過沉默TUG1表達，進一步探索缺氧誘導的心肌細胞中l(wèi)ncRNA-TUG1對EZH2以及eNOS和BDNF的作用。此外，我們還探討了沉默TUG1的表達對缺氧心肌細胞的線粒體合成功能和炎癥反應的影響。

本研究結(jié)果顯示沉默TUG1的表達部分逆轉(zhuǎn)了缺氧對心肌細胞活力的抑制。已有研究指出過表達lncRNA-TUG1可能靶向EZH2參與多種腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移［13］。此外，Miti?等［14］在小鼠肢體缺血模型中觀察到抑制EZH2的表達后可能進一步促進了eNOS和BDNF的表達。本研究結(jié)果顯示沉默TUG1表達可能抑制EZH2與eNOS、BDNF啟動子區(qū)域的結(jié)合。EZH2被認為是巨噬細胞激活和自身免疫性炎癥的重要調(diào)節(jié)因子［15］。eNOS是調(diào)節(jié)心血管穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，介導血管內(nèi)皮NO的合成［16］。缺血可誘導血管內(nèi)皮細胞中NO合成限速酶eNOS的激活，促進NO生成發(fā)揮舒張血管的作用［17］。此外，在膿毒性心肌病的小鼠模型中觀察到BDNF可通過刺激eNOS進而抑制氧化應激和細胞凋亡發(fā)揮心肌保護作用［18］。我們先前研究［6］顯示沉默TUG1后，小鼠心肌組織中eNOS和BDNF的表達上調(diào)。此外，部分研究［19-20］表明eNOS和BDNF表達水平的增高可以降低動脈粥樣硬化模型中炎癥因子的表達。本研究結(jié)果顯示沉默TUG1表達可抑制EZH2與BDNF和eNOS啟動子區(qū)域的結(jié)合，這可能是沉默TUG1降低缺氧心肌細胞炎癥的潛在機制。心肌細胞損傷心臟維持正常功能所需的ATP超過95%源自線粒體的氧化磷酸化［21］。PGC-1α可通過NRF1和TFAM來誘導線粒體生物發(fā)生［22］。沉默TUG1可進一步上調(diào)miR-26a緩解LPS誘導的線粒體損傷及炎癥反應［23］。同樣，本研究結(jié)果顯示沉默TUG1可進一步促進缺氧心肌細胞線粒體生物合成相關轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白NRF1、PGC-1和TFAM的表達。這說明沉默TUG1表達對缺氧誘導的HL-1細胞線粒體生物合成具有保護作用。

綜上所述，lncRNA-TUG1可能通過EZH2途徑參與線粒體功能紊亂和炎癥反應的過程。當lncRNATUG1表達降低時，其與EZH2的結(jié)合減弱，進而影響EZH2與eNOS和BDNF啟動子區(qū)的結(jié)合。因此，沉默TUG1可能通過EZH2途徑影響eNOS和BDNF的表達并緩解缺氧誘導的HL-1細胞炎癥反應。此外，沉默TUG1可上調(diào)線粒體合成相關蛋白NRF1、PGC-1和TFAM的表達，促進線粒體生物合成。總之，沉默TUG1可能通過EZH2途徑減輕缺氧心肌細胞的線粒體功能紊亂和炎癥反應。