小鼠血漿中黃卡瓦胡椒素B 的HPLC-MS/MS 定量分析方法建立與藥代動(dòng)力學(xué)特征研究

吳啟鑫趙小亮焦玥羅明珠王怡婷李晶哲王靖怡馬琰巖李濤劉長振*

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

卡瓦胡椒（Piper methysticum）是一種原產(chǎn)于南太平洋地區(qū)的藥食同源植物，屬胡椒科，入藥部位主要為根及根莖。 在當(dāng)?shù)?，卡瓦胡椒作為一種失眠、焦慮和更年期癥狀的自然療法，現(xiàn)臨床多用于鎮(zhèn)靜催眠、抗痙攣、局部麻醉、抗真菌等方面［1-2］。近年，其相關(guān)制劑已作為非處方藥或食品添加劑進(jìn)入歐美國家，我國亦有相關(guān)報(bào)道［2］。 黃卡瓦胡椒素B（Flavokawain B，F(xiàn)KB）是從卡瓦胡椒中分離出來的一種天然甲氧基化查耳酮，具有抗炎［3-4］、抗癌［5-6］、鎮(zhèn)痛［7］、抗血管生成［8-9］和免疫調(diào)節(jié)等多種治療作用。 FKB 在治療惡性腫瘤方面表現(xiàn)出色，尤其是胃癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌，其開發(fā)前景令人矚目，引起了全球的廣泛關(guān)注［5，10-14］。 另外，F(xiàn)KB 有潛在的肝毒性報(bào)道［9，15］。 但截至目前，對FKB 的體內(nèi)過程了解尚不充分，為闡明FKB 的藥代動(dòng)力學(xué)特征，本研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCMS/MS）建立血藥濃度定量分析方法，并進(jìn)一步比較了靜脈給藥、腹腔注射和灌胃給藥后血漿中FKB的藥代動(dòng)力學(xué)特征和生物利用度數(shù)據(jù)，這將為FKB藥理機(jī)制、安全性研究和進(jìn)一步開發(fā)提供方法和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

168 只SPF 級雄性KM 小鼠，7 ～8 周齡，體重（31.0 ± 1.5）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK（京）2019-0008】。 在晝夜交替照明、恒溫（23 ～ 25℃）、恒濕（49% ～ 51%）環(huán)境中喂養(yǎng)3 d，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境，自由飲食飲水。 實(shí)驗(yàn)前禁食12～16 h，自由飲水。 所有動(dòng)物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所【SYXK（京）2021-0017】，實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（ERCCACMS21-2106-08）。

1.1.2 主要試劑與儀器

木犀草素（批號：RDD-00702005014）、黃卡瓦胡椒素B（批號：RDD-H-02802301004）購于成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，純度均大于98%；二甲基亞砜（Sigma 公司，批號：103209528），羧甲基纖維素鈉（國藥集團(tuán)，批號：20120330），Tween80（MCE 公司，批號：HYS000006634），PEG-300（MCE 公司，批號：HYW000084018）；甲醇、乙腈（LC/MS 級，北京迪馬公司），甲酸（LC/MS 級，美國Sigma 公司），甲酸銨（LC/MS 級，美國Sigma 公司），其他試劑均為分析純。

Targin VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；Milli-Q Integral 5 超純水制備儀（美國Millipore 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Rotanta 460R 高速冷凍離心機(jī)（德國Hettich 公司）。 HPLC-MS/MS 系統(tǒng)（美國AB Sciex 公司），包括ExionLC-20AC 高效液相色譜儀、Ion DriveTMTurbo V 離子源、Sciex6500＋三重四極桿檢測器、Analyst 1.7 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和MutiQuant 3.0.3 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 藥品配制

（1）尾靜脈注射組和腹腔注射組：稱取適量的FKB，加入所需藥液體積的4%二甲基亞砜，充分振蕩使藥物完全溶解，再加入所需藥液體積的40%PEG-300 和5% Tween80，最后加入剩余體積的生理鹽水，振蕩并超聲處理60 s，配制成4 mg/mL、8 mg/mL、12 mg/mL 的FKB 溶液。

（2）灌胃組：稱取適量的FKB，加入4%二甲基亞砜和5% Tween80，混合后溶于0.5%羧甲基纖維素鈉，振蕩并超處理聲60 s，最終配制成40 mg/mL、80 mg/mL、120 mg/mL 的FKB 溶液。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

7 周齡雄性KM 小鼠，隨機(jī)分成7 個(gè)組：（1）尾靜脈注射組（i．v．20 mg/kg）、（2）低劑量腹腔注射組（i．p．20 mg/kg）、（3）中劑量腹腔注射組（i．p．40 mg/kg）、（4）高劑量腹腔注射組（i．p．60 mg/kg）、（5）低劑量灌胃組（i．g．200 mg/kg）、（6）中劑量灌胃組（i．g．400 mg/kg）、（7）高劑量灌胃組（i．g．600 mg/kg），每個(gè)組由24 只小鼠組成11 個(gè)取血時(shí)間點(diǎn)（每只小鼠3 個(gè)取血時(shí)間點(diǎn)），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行6 只小鼠。 實(shí)驗(yàn)于小鼠給藥后0、5、30 min 及1、2、4、6、8、12、16、24 h，于眼底靜脈叢取血100 μL，迅速裝入EDTA·Na2抗凝管中，在4℃4362 r/min 條件下離心15 min，棄沉淀，取上層血漿裝于新Ep 管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品溶液配制

（1）對照品溶液配制：精密稱取FKB 對照品約10 mg，倒入5 mL 容量瓶中，加入甲醇，超聲5 min助溶，將溶液稀釋至刻度，搖勻即得。 所配制貯備液濃度為2 mg/mL，逐級稀釋后得到1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、61.5、125.0、250.0、500.0、1000.0、2000.0 和4000.0 ng/mL 濃度的對照品系列溶液，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密稱取木犀草素對照品約10 mg，倒入5 mL 容量瓶中，后加入甲醇，超聲5 min 助溶，將溶液稀釋至刻度，搖勻即得內(nèi)標(biāo)母液，-80℃冰箱中備用。 臨用前用甲醇將內(nèi)標(biāo)母液稀釋成10 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

（3）質(zhì)量控制（QC）樣品的配制：取低、中、高3 個(gè)濃度的對照品溶液，加入一定量的空白血漿充分混合，搖勻即得低濃度質(zhì)控（LQC，0.5 ng/mL）、中濃度質(zhì)控（MQC，20 ng/mL）和高濃度質(zhì)控（HQC，600 ng/mL）樣品，置于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血漿樣品的處理

血漿樣品在室溫下融化后，充分混勻，精密量取50 μL，置于0.6 mL 干凈離心管中，精密加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和140 μL 乙腈，6000 r/min 渦旋混合5 min，4℃13 795 r/min 離心10 min，取上清液，4℃13 795 r/min 再次離心10 min，取上清待測。

1.2.5 HPLC-MS/MS 條件

（1）色譜條件：色譜柱為XSelect＠HSS T3 色譜柱（2.5 μm，2.1 × 50 mm，美國Waters 公司）；流動(dòng)相為A（水，含0.1%甲酸） ∶B（乙腈-異丙醇［50 ∶50］），梯度洗脫程序如下：0 ～ 4.0 min，20% ～100% B；4.0 ～6.0 min，100% B ～100% B；6.0 ～6.1 min，100% B ～20% B；6.1 ～8.0 min，20% B～20% B。 柱溫為35℃；樣品室溫度為4℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

（2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），氣簾氣（N2）為40 psi，碰撞氣（N2）為9 psi，噴霧電壓為＋5500 V，霧化溫度為550℃，霧化氣（GS1，N2）和輔助氣（GS2，N2）均為55 psi。 實(shí)驗(yàn)采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式正離子掃描，F(xiàn)KB 和內(nèi)標(biāo)木犀草素離子對及相應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量、保留時(shí)間等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 黃卡瓦胡椒素B 和內(nèi)標(biāo)木犀草素優(yōu)化后的液相色譜質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized liquid chromatography-mass spectrometry parameters of Flavokawain B and internal standard luteolin

1.2.6 方法學(xué)的建立與驗(yàn)證

（1）選擇性：隨機(jī)取6 只小鼠空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)（等體積純水替代）外，按“1.2.4”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析，并記錄相應(yīng)的色譜圖。通過色譜圖比較定量限（limit of quantification，LOQ）樣品、小鼠空白血漿樣品和小鼠給藥后血漿樣品，考察該方法的選擇性。

（2）線性范圍及定量限：取FKB 對照品系列溶液，分別隨機(jī)加入小鼠空白血漿，得到0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.1、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 和800.0 ng/mL 的模擬生物樣品，同樣按“1.2.4”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析。橫坐標(biāo)X 為血漿樣品中待測物的濃度，縱坐標(biāo)Y 為待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，1/X 為權(quán)重系數(shù)，回歸分析采用加權(quán)最小二乘法，最終得到各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍。 各成分的LOQ 經(jīng)信噪比S/N ＝10 計(jì)算，并以LOQ 作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)。

（3）基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率：取QC 和LOQ 樣品，每一濃度配制6 份，按“1.2.4”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析得到FKB 與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比值A(chǔ)；取用純水配制以上等濃度的樣品，進(jìn)樣分析得到FKB與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比值B；另隨機(jī)取空白血漿，按“1.2.4”項(xiàng)下方法操作，上述相應(yīng)等濃度的對照品和內(nèi)標(biāo)溶液分別加入于經(jīng)提取的上清液中，進(jìn)樣分析后可得FKB 與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比值C。A 與B 的比值即基質(zhì)效應(yīng)，A 與C 的比值即提取回收率。

（4）準(zhǔn)確度與精密度：LOQ 樣品和QC 樣品1 d之內(nèi)測定6 次，且連續(xù)3 d 檢測，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度。

（5）殘留：取定量上限樣品，按“1.2.4”項(xiàng)下方法操作，然后進(jìn)樣空白樣品；該循環(huán)連續(xù)操作3 次，之后統(tǒng)一分析各待測物的殘留。

（6）稀釋可靠性：配制6 份模擬生物樣品，約10倍QC 樣品濃度（6000 ng/mL），稀釋到600 ng/mL（使用空白血漿稀釋），如“1.2.4”的步驟操作，進(jìn)樣以分析，并計(jì)算稀釋后樣品的準(zhǔn)確度及精密度。

（7）穩(wěn)定性：配制3 份相同濃度的QC 樣本，按“1.2.4”步驟操作，考察室溫穩(wěn)定性是通過室溫放置0.5 h 和2 h；考察后期穩(wěn)定性是通過4℃條件下放置12 h 和24 h；考察凍融穩(wěn)定性是通過-80℃凍存，室溫融化，重復(fù)3 次；考察長期穩(wěn)定性是通過-80℃凍存1 個(gè)月。

取QC 樣品，每一濃度配制3 份，并按“1.2.4”項(xiàng)下方法操作，在4℃放置12 h 和24 h，考察后期穩(wěn)定性；在室溫下放置0.5 h 和2 h，考察室溫穩(wěn)定性；經(jīng)歷3 次凍融（-80℃凍存，室溫融化），考察凍融穩(wěn)定性；在-80℃條件下冷凍1 個(gè)月，考察長期穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)使用MutiQuant（版本：3. 0. 3，美國AB Sciex 公司）處理數(shù)據(jù)，Origin Pro 2016（版本：b9. 3.226，美國OriginLab 公司）和ChemBioDraw Ultra（版本：14. 0，美國PerkinElmer 公司）繪圖DAS 軟件（版本：3.0，上海博佳醫(yī)藥）的非房室模型計(jì)算藥代參數(shù)。 最大血藥濃度（Cmax）和達(dá)峰時(shí)間（Tmax）均為實(shí)測值，采用梯形法計(jì)算時(shí)間濃度曲線下面積（AUC），使用AUC0-t和相應(yīng)給藥劑量進(jìn)行多劑量線性關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜分析

選擇低分子質(zhì)量模式下進(jìn)行FKB 的質(zhì)譜分析，結(jié)果正離子模式監(jiān)測優(yōu)于負(fù)離子模式，在正離子模式下FKB 主要生成［M ＋H］＋峰。 對［M ＋H］＋峰的主要碎片離子進(jìn)行掃描分析，結(jié)果見圖1。

圖1 質(zhì)譜碎片及可能的裂解過程Figure 1 Product ion spectra and chemical structures with the fragmentation pattern

選擇豐度最高且穩(wěn)定性好的離子對（285.1/181.1）作為定量離子對用于FKB 的定量分析，另外選擇一對豐度高且穩(wěn)定性好的離子對（285.1/131.1）作為定性離子對用于FKB 的確認(rèn)。

由于FKB 尚無商業(yè)化的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物可供使用，本實(shí)驗(yàn)選擇的內(nèi)標(biāo)是黃酮類化合物木犀草素，在正離子模式下對木犀草素進(jìn)行離子掃描和離子對優(yōu)化，結(jié)果見圖1。 在MRM 模式下，F(xiàn)KB 和內(nèi)標(biāo)木犀草素的各離子對的保留時(shí)間、碰撞能量和去簇電壓等液相-質(zhì)譜參數(shù)結(jié)果見表1。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 殘留效應(yīng)

使用含高濃度FKB 的模擬生物樣品（800 ng/mL）及內(nèi)標(biāo)，考察XSelect＠HSS T3、XSelect＠HSS PFP 等不同色譜柱的殘留，結(jié)果XSelect＠HSS T3 色譜柱殘留最少；考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-異丙醇-水等不同洗脫體系下系統(tǒng)的殘留，結(jié)果乙腈-異丙醇-水洗脫條件下殘留最少，結(jié)果見圖2。 因此使用XSelect＠HSS T3 色譜柱以乙腈-異丙醇-水為洗脫相來進(jìn)行方法學(xué)的驗(yàn)證。

注：AⅠ，AⅡ：黃卡瓦胡椒素B（800 ng/mL）/內(nèi)標(biāo)（IS）在甲醇-水洗脫體系下殘留的離子流圖；BⅠ，BⅡ：黃卡瓦胡椒素B（800 ng/mL）/內(nèi)標(biāo)（IS）在乙腈-水洗脫體系下殘留的離子流圖；CⅠ，CⅡ：黃卡瓦胡椒素B（800 ng/mL）/內(nèi)標(biāo)（IS）在乙腈-異丙醇-水洗脫體系下殘留的離子流圖。圖2 不同洗脫體系下的殘留色譜圖Note. AⅠ，AⅡ. Extracted ion chromatogram of Flavokawain B （800 ng/mL） / internal standard（IS） in methanol-water elution system. BⅠ，BⅡ. Extracted ion chromatogram of Flavokawain B （800 ng/mL） / internal standard （IS） in acetonitrile-water elution system. CⅠ，CⅡ.Extracted ion chromatogram of Flavokawain B （800 ng/mL） / internal standard （IS） in acetonitrile isopropanol water elution system.Figure 2 Carry-over results under different elution systems

2.2.2 提取溶劑選擇

將含F(xiàn)KB 的模擬生物樣品（100 ng/mL）按“1.2.4”項(xiàng)下方法操作，考察FKB 和內(nèi)標(biāo)木犀草素在3 倍甲醇和3 倍乙腈提取條件下的提取率。 提取率結(jié)果表明3 倍乙腈（FKB 為97.08% ± 6.60%、IS為92.12% ± 4.24%）稍優(yōu)于3 倍甲醇（FKB 為84.70% ± 1.89%、IS 為96.83% ± 4.50%），因此采用3 倍乙腈作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)方法學(xué)驗(yàn)證。

2.3 方法學(xué)確證

2.3.1 方法的選擇性

如圖3 所示，待測成分峰形和分離效果較好，F(xiàn)KB 出峰時(shí)間約為4.06 min，內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間約為2.65 min，小鼠血漿和腦組織中的內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物等基本不干擾以上成分的檢出。

注：A，F(xiàn)：空白血漿樣品提取離子流圖；B，G：空白血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)（IS，木犀草素）和FKB（LOQ 濃度，0.2 ng/mL）的提取離子流圖；C，H：小鼠尾靜脈注射給藥0.083 h 后的血漿樣品提取離子流圖；D，I：小鼠腹腔注射給藥0.083 h 后的血漿樣品提取離子流圖；E，J：小鼠灌胃給藥0.083 h 后的血漿樣品提取離子流圖。圖3 血漿中黃卡瓦胡椒素B 和內(nèi)標(biāo)的MRM 色譜圖Note. A，F(xiàn). Extracted ion chromatogram of blank plasma sample. B，G. Blank plasma samples spiked with internal standard （IS，luteolin） and Flavokawain B （LOQ concentration，0.2 ng/mL）. C，H. Extracted ion chromatogram of plasma sample obtained 0.083 h after intravenous injection in mice. D，I. Extracted ion chromatogram of plasma sample obtained 0.083 h after intraperitoneal injection in mice. E，J. Extracted ion chromatogram of plasma sample obtained 0.083 h after intragastric administration in mice.Figure 3 Multiple reactions monitoring chromatogram of Flavokawain B and internal standard in plasma

2.3.2 線性范圍及定量限

血漿中FKB 典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y＝0.010X＋0.0033，相關(guān)系數(shù)r為0.9995，在0.2 ～800 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，經(jīng)信噪比S/N ＝10 計(jì)算的LOQ 為0.2 ng/mL。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

LOQ 樣品及各濃度QC 樣品的基質(zhì)效應(yīng)為88.68% ～ 102.04%，提取回收率在95.42% ～101.55%，表明樣品提取和分析方法良好。

2.3.4 準(zhǔn)確度與精密度

結(jié)果顯示，LOQ 相對誤差在- 4.45% ～12.50%，各濃度QC 樣品相對誤差在-8.50% ～9.70%；日內(nèi)和日間精密度LOQ 樣品的RSD 在13.00%以內(nèi)，各濃度QC 樣品的RSD 在10.00%以內(nèi)，表明分析方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定可行。

2.3.5 殘留與稀釋效應(yīng)

進(jìn)樣高濃度QC 樣品后，空白樣品的殘留均低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的0.03%，低于LOQ 樣品的11.03%；稀釋后樣品準(zhǔn)確度為2. 43% ～8. 62%，精密度為2. 48%，表明分析方法的殘留及稀釋可靠性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性

測定低、中、高濃度QC 樣品在不同處理?xiàng)l件的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FKB 在室溫放置2 h（回收率：92.89% ～109.20%），經(jīng)過3 次凍融（回收率：95.69% ～103.98%），-80℃條件下儲(chǔ)存1 個(gè)月（回收率：90.86% ～103.46%），及處理后的樣品在進(jìn)樣室內(nèi)放置24 h（回收率：109.04% ～111.70%），穩(wěn)定性基本良好。

2.4 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

小鼠在靜脈（20 mg/kg）、腹腔注射（20、40 和60 mg/kg）和灌胃（200、400 和600 mg/kg）給藥后未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，F(xiàn)KB 的平均藥時(shí)濃度曲線見圖4，計(jì)算的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。 FKB 在小鼠體內(nèi)吸收速度很快，各給藥組在第1 個(gè)采血時(shí)間點(diǎn)0.083 h 即為峰值；體內(nèi)滯留時(shí)間MRT0-t較短，為2.78 ～4.51 h；表觀分布容積較大，均高于243.63L/kg。 與尾靜脈注射和腹腔注射給藥（半衰期：4.89 ～9.70 h；清除率：22.25 ～44.23 L/（h·kg）相比，F(xiàn)KB 灌胃給藥體內(nèi)半衰期（1.71 ～2.78 h）明顯減??；清除率（1263.38 ～2001.95 L/（h·kg））明顯加快。 與靜脈給藥相比，腔腔注射FKB 的絕對生物利用度為46.31% ～62.06%，灌胃FKB 的絕對生物利用度僅為1.14% ～1.81%。 腹腔注射和灌胃給藥FKB 多劑量線性關(guān)系分析結(jié)果見圖5，可知小鼠在腹腔注射20 ～60 mg/kg 及灌胃200 ～600 mg/kg 給藥劑量范圍內(nèi)，藥代動(dòng)力學(xué)過程呈明顯的線性關(guān)系（Pearson’sr＞0.97）。

表2 小鼠尾靜脈注射、腹腔注射和灌胃黃卡瓦胡椒素B 后血漿中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n ＝6）Table 2 Pharmacokinetic parameters of plasma Flavokawain B in mice after intravenous injection，intraperitoneal injection，and intragastric administration （±s，n ＝6）

表2 小鼠尾靜脈注射、腹腔注射和灌胃黃卡瓦胡椒素B 后血漿中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n ＝6）Table 2 Pharmacokinetic parameters of plasma Flavokawain B in mice after intravenous injection，intraperitoneal injection，and intragastric administration （±s，n ＝6）

參數(shù)Parameter i．v．20（g/kg）i．p．20（mg/kg）i．p．40（mg/kg）i．p．60（mg/kg）i．g．200（mg/kg）i．g．400（mg/kg）i．g．600（mg/kg）AUC0-t（h·ng/mL）852.940529.320786.9601436.280154.490217.640292.130 AUC0-∞（h·ng/mL）898.820578.840898.5601437.080158.310341.190299.710 MRT0-t（h）4.5104.2203.2705.0903.7303.5802.780 MRT0-∞（h）6.0605.8306.3505.1003.99011.2503.090 t1/2z（h）7.6004.8908.3302.0401.8108.8402.180 Tmax（h）0.0830.0830.0830.0830.0830.0830.083 Vz/F （L/kg）244.060243.630534.920122.950329.0801495.880630.400 CLz/F L/（h·kg）22.25034.55044.52041.750126.340117.240200.200 C5 min or Cmax（ng/mL）503.860294.160532.460602.39062.29097.510211.440 F（%）-62.06046.13056.1301.8101.2801.140

注：A：小鼠尾靜脈注射給藥后黃卡瓦胡椒素B 的平均藥時(shí)濃度曲線；B：小鼠腹腔注射給藥后黃卡瓦胡椒素B 的平均藥時(shí)濃度曲線；C：小鼠灌胃給藥后黃卡瓦胡椒素B 的平均藥時(shí)濃度曲線；D：小鼠腹腔注射給藥后黃卡瓦胡椒素B 在0 ～4 h 的平均藥時(shí)濃度曲線局部放大圖；E：小鼠灌胃給藥后黃卡瓦胡椒素B 在0 ～4 h 的平均藥時(shí)濃度曲線局部放大圖。圖4 小鼠給藥后黃卡瓦胡椒素B 的平均藥時(shí)濃度曲線（xˉ±s，n ＝6）Note. A. Mean concentration-time curve of Flavokawain B after intravenous injection in mice. B. Mean concentration-time curve of Flavokawain B after intraperitoneal injection in mice. C. Mean concentration-time curve of Flavokawain B after intragastric administration in mice. D. Partially enlarged plot of the mean concentration-time curve of Flavokawain B from 0 ～4 h after intraperitoneal injection in mice； E. Partially enlarged view of the mean concentration-time curve of Flavokawain B in mice after intragastric administration from 0 ～4 h.Figure 4 Mean concentration-time curve of Flavokawain B in mice after administration（xˉ±s，n ＝6）

注：A：小鼠腹腔注射給藥后血漿中黃卡瓦胡椒素B 的AUC0-t 與給藥劑量間的線性關(guān)系；B：小鼠灌胃給藥后血漿中黃卡瓦胡椒素B 的AUC0-t與給藥劑量間的線性關(guān)系。圖5 小鼠給藥后血漿中黃卡瓦胡椒素B 的AUC0-t與給藥劑量間的線性關(guān)系（xˉ±s，n ＝6）Note. A. The linear relationship between AUC0-t and dosage of Flavokawain B in plasma after intraperitoneal injection in mice. B. The linear relationship between AUC0-t and dosage of Flavokawain B in plasma after intragastric administration in mice.Figure 5 Linear relationship between AUC0-t and the dosage of Flavokawain B in the plasma of mice after administration（xˉ±s，n ＝6）

3 討論

關(guān)于卡瓦胡椒相關(guān)制劑中FKB 的含量測定方法有多種，如HPLC-紫外光譜法、高效薄層色譜法、核磁共振波譜法和HPLC-MS 法等［16-19］，但FKB 在生物樣品中檢測方法的報(bào)道相對較少。 Kanumuri等［17］報(bào)道了健康志愿者血漿中FKB 的超高效液相（UHPLC）-MS 方法，Yang 等［20］報(bào)道了大鼠血漿中FKB 的UHPLC-MS 方法，以上檢測方法的血漿樣品來源分別為人和大鼠，定量限分別為0.25 ng/mL 和0.53 ng/mL，在小鼠血漿中FKB 的檢測方法尚未見報(bào)道。 為深入了解FKB 在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，本研究利用HPLC-MS/MS 建立靈敏、準(zhǔn)確度高的血藥濃度分析方法，并進(jìn)一步探討該方法在小鼠尾靜脈注射、腹腔注射和灌胃給藥不同劑量后血藥濃度分析的適用性，這將為后期FKB 在小鼠體內(nèi)藥理機(jī)制和安全性研究提供依據(jù)。 在前期實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)FKB 容易在色譜柱殘留，因此優(yōu)化了不同色譜柱和不同洗脫條件的殘留，提高了FKB 的檢測準(zhǔn)確度，同時(shí)還考察了樣品的稀釋效應(yīng)，控制定量上限，達(dá)到進(jìn)一步減少FKB 殘留的目的。 并且，通過色譜柱等液相條件和質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，本方法檢測FKB的LOQ 低至0.20 ng/mL，和上述方法相比有一定的提高。 本文建立的FKB 的HPLC-MS/MS 分析方法，經(jīng)驗(yàn)證符合中國藥典《生物樣品分析方法指導(dǎo)原則》的要求［21］，可同時(shí)滿足小鼠尾靜脈注射、腹腔注射和灌胃給藥不同劑量FKB 后血漿中藥物濃度的樣品檢測（0.34 ～1814.32 ng/mL），并完整繪制了各給藥途徑血漿中FKB 的藥時(shí)曲線，成功用于FKB 的藥代動(dòng)力學(xué)特征及生物利用度研究。

文獻(xiàn)報(bào)道FKB 小鼠灌胃劑量為500 mg/kg［22］，在此基礎(chǔ)上依據(jù)初步的急性毒性結(jié)果對劑量進(jìn)行了探索，F(xiàn)KB 的最終劑量范圍設(shè)計(jì)為腹腔注射20 ～60 mg/kg、灌胃200 ～600 mg/kg，尾靜脈注射為20 mg/kg。 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中小鼠狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。

小鼠灌胃和腹腔注射后，F(xiàn)KB 吸收速度很快，血藥濃度在給藥后第一個(gè)采血時(shí)間點(diǎn)5 min 即為峰值，通過PubChem 網(wǎng)站查詢FKB 的油水分配系數(shù)LogP 為3.8，說明FKB 的脂溶性高、滲透性高，這可能是其體內(nèi)迅速吸收的重要原因。 FKB 表觀分布容積（高于243.63 L/kg）遠(yuǎn)大于小鼠的體液體積（0.73 L/kg）［23］，說明FKB 在小鼠體內(nèi)的分布極為廣泛。 FKB 灌胃給藥的絕對生物利用度極差（1.38%），這與灌胃給藥的體內(nèi)消除半衰期較短及清除率較快有關(guān)。 文獻(xiàn)報(bào)道查爾酮等黃酮類成分代謝穩(wěn)定性差，口服后以原型形式吸收入血少，并且藥物極易受胃酸、消化酶和腸道菌群的影響［24-25］，亦能導(dǎo)致進(jìn)入體循環(huán)的藥量相對變少，這提示在后期FKB 的相關(guān)制劑開發(fā)過程中對生物利用度需要特別關(guān)注。 另外，在FKB 質(zhì)譜檢測的285.1/181.1 離子對通道上約2.69 min 處有一色譜峰（圖3H ～3J），并隨FKB 的濃度變化而呈規(guī)律性變化，推斷可能是FKBⅡ相代謝物，如FKB 的葡萄糖醛酸苷等進(jìn)一步電離而形成的。 關(guān)于FKB 體內(nèi)主要代謝物及相關(guān)活性的研究，課題組未來將進(jìn)一步探索。 FKB 腹腔注射給藥的絕對生物利用度為53.29%，相比灌胃給藥有很大提升，并且在20 ～60mg/kg 給藥劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性的藥代動(dòng)力學(xué)過程，這為使用腹腔給藥進(jìn)行FKB 相關(guān)藥理機(jī)制的探索提供了依據(jù)。

在研究中，發(fā)現(xiàn)受試藥物FKB 溶解度低（0.012 g/L，25℃），幾乎不溶于水，因而使用5% Tween80和4% DMSO 輔料助溶。 雖然Tween80 和DMSO 是科研常用的助溶劑，但我國近年臨床研究發(fā)現(xiàn)，不少品種中藥注射劑出現(xiàn)的嚴(yán)重不良反應(yīng)均與使用了Tween80 相關(guān)［26-27］。 此外，高劑量的DMSO 靜脈注射可能也會(huì)帶來副作用［28］。 因此，本研究中靜脈注射方式給藥在助溶劑用量上存在一定的不足之處。 在未來研究中，將嘗試通過化學(xué)修飾等手段增加FKB 溶解度或減少藥物起效濃度等方式來減少助溶劑的用量，進(jìn)而再次開展其藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)研究。 總之，本研究建立的HPLC/MS-MS 測定小鼠血漿中FKB 的方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于FKB在小鼠血漿中藥代動(dòng)力學(xué)特征和生物利用度研究，研究結(jié)果為FKB 相關(guān)制劑的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了新方法和數(shù)據(jù)參考。