強(qiáng)直性脊柱炎食蟹猴膝關(guān)節(jié)及腸道組織病理變化分析

黃玉葉，蔡艷貞，蔡春梅，祝合朋，丁煌冠，賈歡歡，肖文德，陳珺，李文德*，盧麗*

（1. 廣東藥科大學(xué)，廣州 511400；2. 廣東省實驗動物監(jiān)測所（廣東省實驗動物重點實驗室），廣州 510663；3. 廣州市第一人民醫(yī)院，廣州 510180）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）以中軸關(guān)節(jié)的疼痛、僵直為主要臨床特征，包括骶髂關(guān)節(jié)和脊柱，也會累及外周關(guān)節(jié)，尤其是伴隨出現(xiàn)的膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛。 目前AS 的病因病機(jī)尚未明確，除與已知的HLA-B27 的相關(guān)性外，近年來基質(zhì)金屬酶（matrix metalloproteinase，MMP）參與AS 發(fā)病的作用機(jī)理也逐漸引起關(guān)注［1］。 有報道稱，部分AS 患者最先發(fā)病于外周關(guān)節(jié)，例如膝關(guān)節(jié)，逐漸累及髖關(guān)節(jié)，甚至幾年后才出現(xiàn)脊柱的病變，年齡越小首發(fā)外周關(guān)節(jié)的概率越高。 由于對AS 外周關(guān)節(jié)病理變化及診斷方法的認(rèn)識不足，臨床上容易誤診為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎等，嚴(yán)重影響AS 早期的診斷和治療［2］。 通過研究AS 膝關(guān)節(jié)的病理變化及進(jìn)程，有助于更好地認(rèn)識AS 在外周關(guān)節(jié)的發(fā)生發(fā)展，減少誤診漏診的發(fā)生，并盡早治療疾病，具有重要的臨床實用價值及社會效益。

在AS 患者中，炎癥性腸病是常見的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，約70% AS 患者存在腸道黏膜炎癥，其中5%進(jìn)展為臨床炎癥性腸病［3］，與之對應(yīng)的是10% ～20%炎癥性腸病患者同時患有AS。 這提示AS 和炎癥性腸病具有相似的遺傳風(fēng)險因素和病因，在臨床遺傳和免疫學(xué)方面都有重疊，AS 患者腸道炎癥是否與脊柱發(fā)病相關(guān)也引起了關(guān)注。 近年來對腸道微生物的多項研究表明腸道菌群失調(diào)與AS 的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)，然而，尚不清楚這種微生物失調(diào)是炎癥的起因還是結(jié)果，而微生物失調(diào)是如何調(diào)節(jié)AS的免疫反應(yīng)也有待研究，因此使腸道-脊柱關(guān)節(jié)炎成為研究的新興領(lǐng)域［4］。 目前許多學(xué)者認(rèn)為，微生物感染是脊柱關(guān)節(jié)病或AS 疾病活動的誘發(fā)因素，也就是說，腸道可能是抗原暴露的第一個位置，隨后是關(guān)節(jié)內(nèi)致病機(jī)制的激活［5］。

構(gòu)建疾病動物模型是研究疾病發(fā)生機(jī)理以及防治策略的基礎(chǔ)，但對于病因不明的病種而言，缺乏病因相似的動物模型，是阻礙該病種基礎(chǔ)研究發(fā)展的瓶頸。 近年來對強(qiáng)直性脊柱炎病因病機(jī)的研究主要是在嚙齒類動物模型上進(jìn)行的，但與AS 患者臨床表現(xiàn)具有較大差異，在嚙齒類動物模型獲得的實驗結(jié)果，很難真正“落地”到臨床。 本實驗是在課題組已建立的自發(fā)性強(qiáng)直性脊柱炎食蟹猴模型上開展的，前期研究已明確了AS 食蟹猴脊柱病程進(jìn)展以及血液學(xué)、影像學(xué)及分子生物學(xué)方面的相關(guān)改變［6］，對該自發(fā)性疾病模型有夯實的研究背景數(shù)據(jù)。 本文將探討AS 食蟹猴膝關(guān)節(jié)及腸道病因及病程中主要病理變化，有助于更好地認(rèn)識AS 在外周關(guān)節(jié)及腸道炎癥的病程發(fā)展，為進(jìn)一步闡明AS 病程中復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

13 只普通級雌性食蟹猴，年齡（15.22 ± 3.00）歲，體重4.46 ± 1.93 kg 均購自廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司【SCXK（粵）2019-0027】。 飼養(yǎng)條件：群居飼養(yǎng)于廣東春盛生物研究院有限公司【SYXK（粵）2019-0152】，環(huán)境溫度18 ～26℃，相對濕度40% ～70%，定時定量飼養(yǎng)，自然采光。 課題組前期對20 000 只食蟹猴的篩查過程中發(fā)現(xiàn)并確立一個自發(fā)性AS 食蟹猴疾病模型種群，進(jìn)一步對這些出現(xiàn)關(guān)節(jié)異常的食蟹猴進(jìn)行了長達(dá)3 年的追蹤性檢查，通過比對血液學(xué)指標(biāo)檢查、影像學(xué)（X 線、MRI及CT）檢查、家族復(fù)發(fā)性分析、基因檢測及病理學(xué)分析，最終建立了非人靈長類自發(fā)性AS 實驗動物種群的病理資料庫，篩選并鑒定了57 只自發(fā)性強(qiáng)直性脊柱炎食蟹猴模型（雄性19 只，雌性38 只），其發(fā)病率為0.275%，與人相似［6］。 在57 只強(qiáng)直性脊柱炎食蟹猴中，外周關(guān)節(jié)炎發(fā)病率約為45.61%，發(fā)病率與強(qiáng)直性脊柱炎患者外周關(guān)節(jié)發(fā)病率接近。 基于實驗動物研究的“3R”原則，本研究中各組實驗動物的數(shù)量分別為：正常對照組3 只、AS 早期組3 只、AS 晚期組7 只。 所有操作均已通過廣東省實驗動物監(jiān)測所IACUC 的審查（IACUC2018002）。

1.1.2 主要試劑與儀器

MMP-3 一抗（武漢三鷹，中國）、H-41 一抗（Santa Cruz，美國）、兔/鼠通用型鏈霉親和素-HRP（江蘇康為世紀(jì)，中國）、透明質(zhì)酸酶（源葉，中國）；Mikasa HF400VA X 光機(jī)（Mikasa，日本）、石蠟包埋機(jī)（Leica，德國）、石蠟切片機(jī)（Leica，德國）；病理組織漂烘儀（Histoline laboratory，米蘭）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

對食蟹猴進(jìn)行體格檢查，使用測角儀初步篩查自發(fā)性AS 食蟹猴，評估動物脊柱曲率和膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)活動度（ROM），隨后進(jìn)行X 線檢查，判斷標(biāo)準(zhǔn)與臨床相同，本研究參照1984 年美國紐約修訂X線診斷分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級（mNY）：0 級：影像學(xué)檢查無病變，骨骼結(jié)構(gòu)正常；Ⅰ級：疑似骨關(guān)節(jié)硬化、糜爛；Ⅱ級：可見明顯的硬化和侵蝕，有輕微異常，但關(guān)節(jié)間隙不是很明顯；Ⅲ級：骨硬化和浸潤明顯，骨異常嚴(yán)重，關(guān)節(jié)間隙明顯改變，部分強(qiáng)直改變；Ⅳ級：大部分脊柱出現(xiàn)強(qiáng)直性改變或完全強(qiáng)直，表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常［7-8］。 結(jié)合細(xì)胞因子檢查和排除其他疾病影響，根據(jù)mNY 分級系統(tǒng)進(jìn)行雙盲評分，按不同等級將食蟹猴分為兩組，評分0 級為正常組（n＝3），評分Ⅱ級為AS 早期組（n＝3）、評分Ⅲ級及以上為AS 晚期組（n＝7），且本實驗所用AS 食蟹猴均伴發(fā)外周關(guān)節(jié)及腸道病變。

1.2.2 食蟹猴膝關(guān)節(jié)樣本的取材固定、脫鈣與包埋

安樂死后，取食蟹猴膝關(guān)節(jié)放入4%多聚甲醛中常溫固定48 h 以上，固定完畢后流水沖洗9 h 以上去除多余固定液后用EDTA-2Na 脫鈣直至組織變得柔軟說明達(dá)到脫鈣終點，進(jìn)行常規(guī)脫水包埋，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 食蟹猴腸道樣本的取材固定與包埋

動物經(jīng)安樂死后取出不同的腸段，包括小腸和大腸，將腸腔清洗干凈后放入4%多聚甲醛中常溫固定48 h 以上，固定完畢后流水沖洗9 h 以上去除多余固定液后分裝于包埋盒中，進(jìn)行常規(guī)脫水包埋，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 番紅-固綠染色法（safranine O-fast green stain，SO）

切片常規(guī)脫蠟至水后，蘇木素染色1 min，流水清洗后1%鹽酸乙醇分化15 s。 0.05%固綠染色5 min，1%乙酸酸化。 蒸餾水清洗后，0.5%番紅O染色液2 min。 脫水透明，封片。 通風(fēng)櫥過夜后拿至顯微鏡下觀察，根據(jù)需求，使用Olympus 倒置顯微鏡在不同倍鏡下進(jìn)行拍攝，每張切片均觀察了5 個視野，并對軟骨厚度和關(guān)節(jié)直徑進(jìn)行定量。

1.2.5 蘇木精-伊紅染色（HE 染色）

切片常規(guī)脫蠟至水后，蘇木素染色8 min，流水浸洗1 min 后浸入1%鹽酸乙醇分化3 ～8 s，肉眼觀察組織為淡紫色即可，流水沖洗返藍(lán)10 min，再浸入水性伊紅染色液染色3 min。 脫水透明，封片。 通風(fēng)櫥過夜后拿至顯微鏡下觀察，根據(jù)需求，使用Olympus 倒置顯微鏡在不同倍鏡下進(jìn)行拍攝，每張切片均觀察了5 個視野。

1.2.6 食蟹猴小腸絨毛長度和隱窩深度的測量

使用Olympus 倒置顯微鏡拍攝并測量從絨毛頂端至隱窩開口處的垂直距離為小腸絨毛長度，隱窩開口至隱窩基部的垂直距離為隱窩深度，每張切片均選取了5 個視野。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色

經(jīng)常規(guī)烤片、脫蠟獲水流程后，采用酶修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，5%BSA 封閉，滴加MMP-3（1 ∶100）一抗，4℃濕盒孵育過夜后回收，PBS 清洗后滴加二抗，置于濕盒避光孵育10 min，經(jīng)DAB 顯色、蘇木素復(fù)染后脫水、透明及封片，置于通風(fēng)櫥過夜后顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用GraphPad Prism 6 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較分析。 兩組獨立樣本比較采用t檢驗，P＜0.05 認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周膝關(guān)節(jié)X 線及大體標(biāo)本觀察

X 線檢查發(fā)現(xiàn)，正常組食蟹猴關(guān)節(jié)表面完整，未見明顯破損，AS 早期食蟹猴病變位置關(guān)節(jié)表面為鋸齒狀，軟骨損傷（藍(lán)色箭頭指示），AS 晚期關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨邊緣骨贅生成明顯（紅色箭頭指示）。 由膝關(guān)節(jié)的大體外觀可見，正常組食蟹猴股骨下段和脛骨上段關(guān)節(jié)軟骨透明，關(guān)節(jié)面光滑有光澤，呈藍(lán)白色，關(guān)節(jié)邊緣整齊。 AS 早期組食蟹猴股骨下段和脛骨上段軟骨層變薄，表面粗糙，色澤暗淡，偶見軟骨缺損潰瘍面，暴露軟骨下骨，彈性差。 AS 晚期組食蟹猴股骨下段和脛骨上段周圍骨贅明顯，關(guān)節(jié)間隙狹窄，關(guān)節(jié)軟骨層結(jié)構(gòu)基本完全丟失（見圖1）。

注：藍(lán)色箭頭：軟骨破損位置；紅色箭頭：骨贅形成位置。圖1 AS 食蟹猴膝關(guān)節(jié)X 線及標(biāo)本外觀Note. Blue arrow. Location of cartilage breakage. Red arrow. Location of bone fragment formation.Figure 1 AS cynomolgus monkey knee joint X-ray and specimen appearance

2.2 外周膝關(guān)節(jié)的病理變化

關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)及纖維構(gòu)成的透明軟骨。 膝關(guān)節(jié)軟骨主要分為透明軟骨層、鈣化軟骨層及軟骨下骨層。

2.2.1 股骨下端病理變化

食蟹猴股骨下段HE 染色發(fā)現(xiàn)，正常組股骨軟骨表面光滑平整，軟骨下骨未見增生血管（圖2A，2B）。 AS 食蟹猴軟骨基質(zhì)隨病情加重逐漸剝落，軟骨層變薄變性，表面纖維增生，可明顯觀察到成骨（圖2C，2D，2E），隨著病情加重可觀察到異位肥大軟骨細(xì)胞向軟骨下骨層方向進(jìn)展（圖2G，2H），大面積的纖維成骨導(dǎo)致松質(zhì)骨增多，并在鈣化軟骨層附近發(fā)現(xiàn)密集分布的血管（圖2F，2I）。

注：HB：異位骨；紅色虛線：透明軟骨邊界；藍(lán)色虛線：軟骨侵蝕空洞；綠色虛線：異位肥大軟骨團(tuán)；紅色箭頭：血管；藍(lán)色箭頭：炎癥細(xì)胞和骨髓樣細(xì)胞；黃色箭頭：纖維成骨。圖2 AS 食蟹猴股骨下段病理進(jìn)展（HE 染色）（n ＝3）Note. HB. Heterotopic bone. Red dashed line. Hyaline cartilage border. Blue dashed line. Cartilage erosion cavity. Green dashed line. Ectopic hypertrophic cartilage mass. Red arrow. Blood vessel. Blue arrow. Inflammatory cells and bone marrow-like cells. Yellow arrow. Fibro-osteogenesis.Figure 2 Pathological progression of the lower femur in AS cynomolgus monkeys （HE staining）（n ＝3）

2.2.2 脛骨上段病理變化

食蟹猴脛骨上段HE 染色發(fā)現(xiàn)，正常組脛骨上段軟骨表面完整，AS 食蟹猴組透明軟骨層纖維紊亂甚至中斷，異常增生，軟骨內(nèi)部可觀察到纖維成骨（圖3A，3B），鈣化軟骨層厚度明顯增加，隨著病情發(fā)展，可觀察到異位肥大軟骨細(xì)胞向成骨方向發(fā)展以及向纖維化方向分化（圖3C，3D），以及分布密集的血管（圖3E，3F）。

2.3 股骨下段表面軟骨厚度及直徑的變化

為了更好地觀察與評估關(guān)節(jié)表面軟骨層的變化，對食蟹猴股骨下段進(jìn)行SO 染色。 結(jié)果如圖4所示，正常對照組軟骨細(xì)胞排列有序，軟骨基質(zhì)層呈明顯桔紅色；AS 組軟骨基質(zhì)丟失，蛋白多糖含量減少，軟骨內(nèi)成骨明顯，纖維增生明顯，以炎性肉芽組織為主要特征（圖4A），在軟骨下骨區(qū)域可見縱向發(fā)展的大面積肥大軟骨細(xì)胞，往成骨方向進(jìn)展活躍（圖4B）。 隨著病程發(fā)展，AS 晚期動物股骨下段軟骨層完全被破壞，取而代之的是表面增生的纖維組織。 圖4C 為表面軟骨厚度及直徑的測量結(jié)果，AS 組股骨下段表面軟骨層的厚度顯著下降；關(guān)節(jié)直徑有逐漸上升趨勢，但無顯著性差異，提示AS 食蟹猴膝關(guān)節(jié)軟骨面被破壞的主要原因是軟骨內(nèi)骨化及纖維增生。

注：FH：纖維增生；黃色箭頭：纖維成骨；紅色線段：股骨表面軟骨的厚度；軟骨厚度在× 40 視野下進(jìn)行測量，關(guān)節(jié)直徑采用游標(biāo)卡尺測量；與正常組相比，*P ＜0.05。 （下圖同）圖4 AS 食蟹猴股骨下段表面軟骨厚度及直徑的變化（SO 染色）（n ＝3）Note. FH. Fibrous hyperplasia. Yellow arrow. Fibrous osteogenesis. Red line segment. Thickness of cartilage on the surface of the femur.Cartilage thickness was measured in × 40 field of view and joint diameter was measured using vernier calipers. Compared with normal group，*P ＜0.05. （The same in the following figures）Figure 4 Variation in cartilage thickness and diameter on the surface of the lower femur in AS cynomolgus monkeys （SO staining）（n ＝3）

2.4 股骨下段MMP-3 的表達(dá)變化

食蟹猴股骨下段MMP-3 的IHC 染色如圖5 所示，正常組表面軟骨細(xì)胞染色呈現(xiàn)弱陽性；生長板也觀察到陽性染色，血管平滑肌細(xì)胞染色為陰性。與正常組相比，AS 組軟骨表面和生長板中MMP-3的表達(dá)明顯增強(qiáng)，軟骨表面可見排列紊亂的陽性軟骨細(xì)胞和異位肥大軟骨細(xì)胞團(tuán)；軟骨表面纖維增生處血管中也檢測到較高的MMP-3。

注：HB：Heterotopic bone 異位骨；紅色虛線：生長板邊界；紅色箭頭：血管。圖5 AS 食蟹猴股骨下段MMP-3 的表達(dá)（IHC 染色）（n ＝3）Note. HB. Heterotopic bone ectopic bone. Red dashed line. Growth plate boundary. Red arrow. Blood vessels.Figure 5 Expression of MMP-3 in the lower femur of AS cynomolgus monkeys （IHC staining）（n ＝3）

2.5 外周腸道的組織學(xué)特征

食蟹猴外周小腸樣本的HE 染色發(fā)現(xiàn)，小腸絨毛出現(xiàn)嚴(yán)重絨毛萎縮、增粗，同時隱窩增生明顯。與正常組相比，AS 組十二指腸、空腸、回腸的絨毛長度顯著變短，隱窩深度顯著增大（見圖6），與目前臨床上AS 患者的病理特征一致［9］。

注：橘色：絨毛長度；紅色：隱窩深度。圖6 AS 食蟹猴小腸絨毛和隱窩的測量（HE 染色）（n ＝3）Note. Orange. Villi length. Red. Crypt depth.Figure 6 Measurement of small intestinal villi and crypt foci in AS cynomolgus monkeys （HE staining）（n ＝3）

2.6 腸道γδT 細(xì)胞數(shù)量的變化

γδT 細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，AS 組腸道粘膜腸腺處可觀察到大量的γδT 細(xì)胞。 γδT 細(xì)胞可參與IL-17 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。 實驗結(jié)果表明，AS 組只有空腸和回腸可見γδT 細(xì)胞陽性染色，結(jié)腸和盲腸中并未見（見圖7）。 這提示浸潤在空腸和回腸處的γδT 細(xì)胞可能透過受損的腸黏膜屏障和腸血管屏障，通過血液運輸或直接轉(zhuǎn)移到脊柱，引起脊柱局部的炎癥［10］。

圖7 AS 食蟹猴腸道γδT 細(xì)胞的IHC 染色（n ＝3）Figure 7 IHC staining of intestinal γδT cells in AS cynomolgus monkeys（n ＝3）

3 討論

AS 發(fā)病隱匿，部分首發(fā)于外周關(guān)節(jié)，而在目前的嚙齒類AS 模型中對外周關(guān)節(jié)的研究還較少，并且腸道免疫細(xì)胞浸潤與AS 的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)。 本研究以AS 食蟹猴膝關(guān)節(jié)和腸道樣本為對象，探討了外周膝關(guān)節(jié)病理進(jìn)展及腸道炎癥可能的發(fā)生機(jī)制。

本研究基于影像學(xué)和膝關(guān)節(jié)大體外觀的檢查結(jié)果，可以初步確定早期膝關(guān)節(jié)的病變主要以軟骨表面破損為主，晚期病變主要以軟骨表面的骨形成為主。 通過對膝關(guān)節(jié)股骨下段和脛骨上段形態(tài)學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)，隨著AS 病程進(jìn)展，膝關(guān)節(jié)從軟骨表面輕微纖維化、軟骨破損及成骨進(jìn)一步發(fā)展為軟骨退化，表面纖維成骨，異位肥大軟骨成骨，炎癥細(xì)胞侵襲以及血管增生。 經(jīng)組織學(xué)測量結(jié)果表明，AS 組食蟹猴股骨下段腫大，表面軟骨厚度顯著下降。 IHC結(jié)果顯示，AS 組股骨下段MMP-3 表達(dá)上調(diào)，這提示滑膜增生以及軟骨侵蝕和破壞是由于AS 食蟹猴中MMP-3 的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的。 這與AS 患者脊柱中MMP3 表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果一致［11］。 MMPs 則是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分，包括蛋白多糖和糖蛋白。 據(jù)報道，AS 關(guān)節(jié)滑液中MMP-3 水平升高，其血清水平與AS 疾病活動指數(shù)BASDAI 及AS 疾病功能指數(shù)BASFI 呈正相關(guān)；而血清MMP-3 水平無論在臨床患者治療前后MMP-3 的表達(dá)水平與ESR 和CRP 有很好的相關(guān)性，體現(xiàn)了MMP-3 與AS 患者疾病的活動性密切相關(guān)。 因此，MMP-3 可能是AS 的潛在診斷生物標(biāo)志物，甚至可以作為AS 患者結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)展的獨立預(yù)測因子［7，12-16］。 本研究從成骨相關(guān)研究AS 外周膝關(guān)節(jié)，增強(qiáng)了炎癥和骨進(jìn)展之間的潛在聯(lián)系，為日后治療外周關(guān)節(jié)疾病提供新的參考方向。

T 細(xì)胞抗原受體（TCR）有α、β、γ、δ 四種肽鏈。根據(jù)TCR 異二聚體的不同組成，可將其分為TCR αβ 和TCR γδ 兩種類型，特性和功能各不相同。 其中TCR γδ 細(xì)胞主要分布在黏膜和上皮組織中，而在人外周血中僅占T 細(xì)胞總數(shù)的1% ～5%，具有抗感染、識別和殺傷靶細(xì)胞的功能，又可被其識別的抗原激活，產(chǎn)生分泌IL-2、3、4、5，IFN-γ 和TNF-α 等多種細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體早期非特異性免疫防御功能，在研究一些慢性疾病的機(jī)制中受到關(guān)注。 本研究中，主要關(guān)注γδT細(xì)胞在患病動物中腸道組織的作用。 研究表明，IL-23 受體基因（IL-23R）與AS 的遺傳多態(tài)性有關(guān)［17］。AS 患者外周血中表達(dá)IL-23R 的γδT 細(xì)胞數(shù)量比正常人高出3 ～5 倍，AS 患者通過IL-23R 刺激γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，表現(xiàn)出Th17 樣免疫反應(yīng)。 γδT 細(xì)胞數(shù)量在患有回腸炎的SpA 患者的上皮和黏膜，以及在SpA 患者的炎癥關(guān)節(jié)中升高，這表明γδT 細(xì)胞可能在AS 的發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用［10，18-19］。因此，本研究通過檢測腸道中γδT 細(xì)胞的數(shù)量，顯示AS 食蟹猴空腸和回腸與炎癥相關(guān)的γδT 細(xì)胞數(shù)量增多，基于腸道組織學(xué)檢查表明AS 小腸均有一定程度的絨毛萎縮和隱窩增生。 本研究結(jié)果增加了AS“腸漏發(fā)病假說”的佐證證據(jù)［20］，即引發(fā)AS的抗原或炎癥細(xì)胞可能由于“腸漏”機(jī)制由腸道遷移至脊柱等患病部位，AS 患者中腸道來源的抗原呈遞細(xì)胞可能在驅(qū)動AS 患者的全身炎癥中起核心作用。 而γδT 在腸道組織中所扮演的角色是作為抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，還是在腸道組織中作為效應(yīng)細(xì)胞，直接識別和殺傷靶細(xì)胞則有待進(jìn)一步實驗探討。

腸道炎癥的發(fā)生是由于腸道免疫系統(tǒng)失去對正常菌群某些抗原的耐受而引起的，可以通過淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到骶髂關(guān)節(jié)和進(jìn)入體循環(huán)而引起系統(tǒng)性癥狀，如周圍關(guān)節(jié)、肌腱等的強(qiáng)直性改變。 已有研究表明，約有70%的強(qiáng)直性脊柱炎患者患有腸道炎癥疾病，其中有57% ～ 70%會發(fā)展為外周關(guān)節(jié)炎［21］，并且，腸道病變與AS 的病情及預(yù)后相關(guān)，腸道炎癥癥狀重的患者其關(guān)節(jié)炎癥狀也較重，治療腸道疾病也可以間接緩解關(guān)節(jié)病變［22］。 這說明在強(qiáng)直性脊柱炎病程發(fā)展中，外周關(guān)節(jié)的病變與腸道炎癥的發(fā)展密不可分。 據(jù)文獻(xiàn)報道，20% ～45%的AS患者首先有外周關(guān)節(jié)病變，數(shù)年后才出現(xiàn)腰背痛。外周關(guān)節(jié)腫、痛常較明顯，以膝關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)受累居多，肩、肘及手、足小關(guān)節(jié)偶有受累。

將外周膝關(guān)節(jié)發(fā)病及腸道炎癥與AS 關(guān)聯(lián)起來的歷史由來已久，三者在遺傳背景、發(fā)病機(jī)制及治療藥物上均有較大的重疊部分，然而，在外周膝關(guān)節(jié)及腸道炎癥的發(fā)病機(jī)制研究上仍存在局限性，因此，本研究通過對AS 食蟹猴的外周組織進(jìn)行病理組織研究，發(fā)現(xiàn)AS 食蟹猴膝關(guān)節(jié)病變主要是MMP-3 上調(diào)所致，腸道病變特征以γδT 細(xì)胞上調(diào)為主，而在其他嚙齒類動物AS 模型上仍以腸道菌群研究為主［23］，對腸道γδT 細(xì)胞的研究甚少，綜合對AS 食蟹猴腸道菌群變化的研究，發(fā)現(xiàn)本研究所用的自發(fā)性食蟹猴AS 模型與臨床上患者具有更高的相似性［9］，對日后研究AS 治療能提供新的實驗基礎(chǔ)和研究方向。