慢性阻塞性肺疾病合并慢性腎病大鼠模型建立與評價

范正媛李亞李素云李高峰李景梅

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥藥理（呼吸）實(shí)驗(yàn)室河南省呼吸病防治中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000；3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，鄭州 450000；4. 河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046）

慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種進(jìn)行性發(fā)展的慢性氣道疾病，由于氣道和（或）肺泡暴露于有害顆粒或氣體而導(dǎo)致不完全可逆的氣流受限和相應(yīng)的呼吸系統(tǒng)癥狀，已成為我國和全球第三大疾病死亡原因［1-2］。COPD 的病理生理變化不僅局限于氣道和肺部，更是一種累及全身，具有多種合并癥的系統(tǒng)性炎癥綜合征，其中慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）是COPD 常見的并發(fā)癥之一［3-4］，發(fā)病率6.5% ～26.2%［5］，老年COPD 患者發(fā)病率高達(dá)31%［6］。CKD 是一種慢性進(jìn)行性腎疾病，以腎結(jié)構(gòu)和功能改變?yōu)樘卣?，全球患病率超過10%，預(yù)計2040 年將成為全球第五大疾病死亡原因［7-8］，COPD 合并CKD可進(jìn)一步增加患者的住院時間、死亡風(fēng)險和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［9］。 然而目前有關(guān)COPD 合并CKD 的研究多集中于臨床流行病學(xué)調(diào)查，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究仍非常有限，因此本研究擬建立COPD 合并CKD 大鼠模型，為深入探討其發(fā)病機(jī)制、尋求有效治療方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

40 只6 ～8 周齡SPF 級SD 健康大鼠，體重180± 20 g，雌雄各半，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供【SCXK（京）2019-0010】。 飼養(yǎng)環(huán)境濕度為45% ～55%，維持25℃恒溫，每天12 h 光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF 級動物房【SYXK（豫） 2017 -0001】。 本研究由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過（YFYDW2021002）。

1.1.2 細(xì)菌

肺炎克雷伯桿菌（46117），購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.1.3 紅旗渠過濾嘴香煙

購自河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，焦油量10mg，煙氣一氧化碳含量12 mg，煙堿量1.0 mg。

1.1.4 藥物

腺嘌呤（V900471）購自美國Sigma 公司。

1.1.5 主要試劑與儀器

HE 染液（CR2203235）、PAS 染液（CR2206022）、Masson 染液（CR2203222）試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。 大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6，E-EL-R0015c）、 白細(xì)胞介素-1β （ IL-1β，E-ELR0012c）、白細(xì)胞介素-13（IL-13，E-EL-R0563c）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，E-EL-R2856c）試劑盒購自武漢Elabscience 公司；轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1，KE20010）試劑盒購自美國Proteintech 公司。

IVC-Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具（江蘇馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司）；FinePointeTM型PFT 測量系統(tǒng)及全身體積描記系統(tǒng)（美國BUXCO 公司）；URIT-1600型全自動尿液分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司）；C8000 全自動生化儀（美國雅培公司）；Donatello 型脫水機(jī)、Giotto 型染色機(jī)（意大利Diapath公司）；SpectraMax i3x 型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；RM2245 型切片機(jī)、DM6000B 光學(xué)顯微鏡、全自動樹脂處理機(jī)、全自動超薄切片機(jī)（德國Leica 公司）；EM-1400 型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；BS210S 電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理

將大鼠隨機(jī)分為對照組（Control 組）、慢性阻塞性肺疾病模型組（COPD 組）、慢性腎病模型組（CKD組）、COPD 合并CKD 模型組（COPD ＋CKD 組），每組各10 只。

1.2.2 COPD 模型的制備

1 ～8 周，將大鼠連接熏煙箱，使箱內(nèi)煙霧濃度達(dá)到3000 ± 500 ppm，熏吸暴露30 min，每天2 次，同時將濃度為6 × 108CFU/mL 的肺炎克雷伯桿菌液滴入大鼠鼻腔，每只0.1 mL，5 d 1 次。 Control 組給與等體積的生理鹽水滴鼻。

1.2.3 CKD 模型的制備

1 ～ 2 周不予處理，3 ～ 6 周給予大鼠含有2.5%腺嘌呤的CMC-Na 混懸液，250 mg/（kg·d）灌胃，7 ～8 周減為125 mg/（kg·d）灌胃。 Control 組給予等體積0.5% CMC-Na 溶液灌胃。

1.2.4 建立COPD 合并CKD 模型

采用香煙暴露聯(lián)合細(xì)菌感染合并腺嘌呤誘導(dǎo)的方法協(xié)同建立COPD 合并CKD 大鼠模型。 1 ～2周先給予香煙暴露聯(lián)合細(xì)菌感染，3 ～8 周在此基礎(chǔ)上進(jìn)行2.5%腺嘌呤灌胃。

1.2.5 留取血、尿、肺、腎組織標(biāo)本

造模結(jié)束后，收集大鼠24 h 尿液測定24 h 尿蛋白；經(jīng)腹主動脈取血，分離血清檢測腎功能及炎癥因子水平；處死動物后取肺、腎組織進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.6 肺功能檢測

以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠（60 mg/kg，腹腔注射）后，氣管插管檢測大鼠用力肺活量（FVC）、第0.1 秒用力呼氣容積（FEV0.1）及FEV0.1/FVC。

1.2.7 肺組織病理學(xué)觀察

將大鼠左右肺分離，結(jié)扎右主支氣管，左肺連灌流系統(tǒng)，用4%甲醛溶液灌注固定20 min，脫水，固定，石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE 染色，觀察大鼠肺泡、細(xì)支氣管、小血管的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.8 腎功能檢測

應(yīng)用全自動生化儀檢測大鼠血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平。

1.2.9 腎組織病理學(xué)觀察

將大鼠左腎去除包膜，取一部分組織切成1 mm3小塊，Gluta 固定液固定，經(jīng)脫水、滲透、包埋、聚合、切片、染色后進(jìn)行投射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化（電鏡圖片由河南中醫(yī)藥大學(xué)電鏡中心提供）。 將剩余腎組織橫切厚度為3 mm 的組織塊，固定、石蠟包埋、切片分別進(jìn)行HE、PAS 及Masson 染色，觀察大鼠腎基本病理形態(tài)、基底膜及間質(zhì)纖維化改變。

1.2.10 炎癥因子檢測

取大鼠血清，按試劑盒說明書，ELISA 法檢測血清炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-13 和TGF-β1 水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較使用單因素方差分析，方差齊使用最小顯著值法，方差不齊使用Dunnett’s T3 法，以P＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺功能情況

與Control 組相比，COPD 組大鼠肺功能值顯著降低（P＜0.01）。 CKD 組大鼠肺功能呈降低趨勢，但與Control 組相比無顯著性差異。 COPD ＋CKD組大鼠肺功能顯著低于Control 組（P＜0.01），且FEV0.1及FEV0.1/FVC 顯著低于COPD 組（P＜0.01）。 見表1。

表1 大鼠肺功能情況（±s，n ＝8 ～10）Table 1 Pulmonary function of rats（±s，n ＝8 ～10）

表1 大鼠肺功能情況（±s，n ＝8 ～10）Table 1 Pulmonary function of rats（±s，n ＝8 ～10）

注：與Control 組相比，aaP ＜0.01；與COPD 組相比，bbP ＜0.01。 （下表同）Note. Compared with Control group，aaP ＜0.01. Compared with COPD group，bbP ＜0.01. （The same in the following tables）

組別Groups用力肺活量（mL）FVC（mL）第0.1 秒用力呼氣容積（mL）FEV0.1（mL）FEV0.1/FVC（%）Control 組Control group8.19 ± 1.467.51 ± 1.0392.28 ± 3.79 COPD 組COPD group6.07 ± 0.44aa4.70 ± 0.14aa77.66 ± 5.13aa CKD 組CKD group8.05 ± 1.706.77 ± 1.0484.97 ± 5.14 COPD ＋CKD 組COPD ＋CKD group4.80 ± 0.71aa2.72 ± 0.76aabb57.36 ± 15.54aabb

2.2 大鼠肺組織病理變化

Control 組肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，氣道管周存在少量炎性細(xì)胞。 COPD 組肺泡壁斷裂，肺泡腔融合，出現(xiàn)肺大皰，肺泡腔內(nèi)及氣道管周炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)合肺功能情況說明成功構(gòu)建COPD 大鼠模型。 CKD 組肺泡結(jié)構(gòu)較完整，但與Control 組相比氣道及肺泡內(nèi)存在大量的炎性細(xì)胞。 COPD ＋CKD 組病理改變同COPD 組，且肺氣腫、炎細(xì)胞浸潤更明顯，可見紅細(xì)胞漏出。 見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理Figure 1 Lung pathology of rats

2.3 大鼠腎功能情況

與Control 組相比，COPD 組大鼠血Cr 及24 h尿蛋白定量顯著升高（P＜0.05）。 CKD 組及COPD＋CKD 組大鼠血Cr、BUN 及24 h 尿蛋白均顯著高于Control 組（P＜0.05），且COPD ＋CKD 組大鼠血Cr、BUN 及24 h 尿蛋白水平較COPD 組及CKD 組均顯著升高（P＜0.05）。 見表2。

表2 大鼠腎功能情況（±s，n ＝8 ～10）Table 2 Renal function of rats（±s，n ＝8 ～10）

表2 大鼠腎功能情況（±s，n ＝8 ～10）Table 2 Renal function of rats（±s，n ＝8 ～10）

注：與Control 組相比，aP ＜0.05；與CKD 組相比，cP ＜0.05，ccP ＜0.01。 （下表同）Note. Compared with Control group，aP ＜0.05. Compared with the CKD group，cP ＜0.05，ccP ＜0.01. （The same in the following tables）

組別Groups尿素氮（mmol/L）BUN（mmol/L）肌酐（μmol/L）Cr（μmol/L）24 h 尿蛋白定量（g/24 h）24 h urine protein（g/24 h）對照組Control group9.39 ± 1.7369.85 ± 29.2327.91 ± 6.22 COPD 組COPD group14.23 ± 1.02179.50 ± 27.36a70.59 ± 14.60aa CKD 組CKD group17.40 ± 2.44a299.60 ± 47.86aa166.70 ± 22.95aa COPD ＋CKD 組COPD ＋CKD group32.48 ± 7.33aabbcc577.20 ± 111.30aabbcc194.60 ± 26.52aabbc

2.4 大鼠腎組織病理變化

Control 組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見明顯異常。 CKD 組腎小球系膜增生，基底膜增厚，球囊腔擴(kuò)張，腎小管細(xì)胞脫落壞死，管腔擴(kuò)張，可見褐色結(jié)晶沉積，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，纖維組織增生，結(jié)合腎功能表現(xiàn)說明CKD 大鼠模型構(gòu)建成功。 COPD 組腎小球未見明顯異常，腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)染色不均，腎間質(zhì)有纖維組織增生。COPD ＋CKD 組病理改變同CKD 組，可見更明顯的腎小管擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化。 見圖2。

圖2 大鼠腎組織病理Figure 2 Renal pathology of rats

2.5 大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)改變

與Control 組相比，COPD 組大鼠腎小球足細(xì)胞部分足突融合，腎小管細(xì)胞間隙增大，線粒體脊減少。 CKD 組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞增生，毛細(xì)血管襻部分閉合，基底膜厚度不均，足細(xì)胞足突融合、微絨毛化，腎小管細(xì)胞破裂，線粒體融合崩解、脊模糊減少，溶酶體增多。 COPD ＋CKD 組超微結(jié)構(gòu)改變同CKD 組，且腎小管細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴沉積。 見圖3。

圖3 大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)Figure 3 Renal ultrastructure of rats

2.6 大鼠血清炎癥因子表達(dá)

如表3 所示，COPD 組、CKD 組及COPD ＋CKD組血清IL-6、IL-13 和IL-1β 水平均顯著高于Control組（P＜0.05）。 CKD 組及COPD ＋CKD 組血清TGF-β1 表達(dá)均較Control 組顯著升高（P＜0.01）。其中，COPD ＋CKD 組血清IL-6、IL-13、IL-1β 和TGF-β1 水平不僅高于COPD 組，也高于CKD 組（P＜0.01）。

表3 大鼠血清炎癥因子表達(dá)（±s，n ＝8 ～10）Table 3 Serum inflammatory factor expression of rats（±s，n ＝8 ～10）

表3 大鼠血清炎癥因子表達(dá)（±s，n ＝8 ～10）Table 3 Serum inflammatory factor expression of rats（±s，n ＝8 ～10）

組別Groups白介素-6（pg/mL）IL-6（pg/mL）白介素-13（pg/mL）IL-13（pg/mL）白介素-1β（pg/mL）IL-1β（pg/mL）轉(zhuǎn)化生長因子-β1（pg/mL）TGF-β1（pg/mL）對照組Control group63.06 ± 12.4722.80 ± 2.995.95 ± 3.704.62 ± 0.58 COPD 組COPD group103.40 ± 13.04aa35.32 ± 3.22a48.34 ± 20.82aa11.88 ± 1.69 CKD 組CKD group119.90 ± 10.93aa47.03 ± 3.45aa44.41 ± 15.42aa22.21 ± 7.83aa COPD ＋CKD 組COPD ＋CKD group176.30 ± 21.00aabbcc65.41 ± 15.61aabbcc91.58 ± 16.04aabbcc54.45 ± 8.98aabbcc

3 討論

越來越多的研究表明，CKD 是COPD 的重要合并癥之一，由于CKD 起病隱匿，早期常無明顯臨床癥狀，被發(fā)現(xiàn)時腎功能大多受損較重進(jìn)入終末期，除腎替代治療，尚無有效的措施以延緩腎功能惡化［10］，CKD 在COPD 合并癥醫(yī)療花費(fèi)支出中排在首位，也加大了COPD 的死亡風(fēng)險和治療難度［11-12］。因此，建立COPD 合并CKD 大鼠模型，對闡釋COPD 引發(fā)CKD 的分子機(jī)制，尋求新的治療手段至關(guān)重要。

COPD 大鼠模型分為單因素及復(fù)合因素誘導(dǎo)［13］，課題組前期建立的香煙暴露聯(lián)合細(xì)菌鼻腔滴注的復(fù)合方法，可成功構(gòu)建COPD 大鼠模型，較單因素誘導(dǎo)的COPD 模型更符合人類COPD 的病理生理特征，且造模時間更短［14］。 本研究采用COPD 診斷金標(biāo)準(zhǔn)的肺功能檢測結(jié)合肺病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)COPD大鼠模型制備成功［15］，且COPD ＋CKD 組肺功能指標(biāo)FEV0.1、FEV0.1/FVC 顯著低于COPD 組，肺組織肺氣腫及炎細(xì)胞浸潤更明顯。

近年來研究報道單一COPD 模型即可引發(fā)腎損傷。 張偉等［16］以改良煙熏加氣管滴注脂多糖法干預(yù)28 d 建立COPD 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)COPD 組大鼠尿Cys-C 表達(dá)顯著升高，腎病理表現(xiàn)可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹，超微結(jié)構(gòu)改變；Pabón 等［17］以單純香煙暴露6 個月建立COPD 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)慢性香煙暴露導(dǎo)致腎小球基底膜增厚、間質(zhì)膠原沉積和腎小管細(xì)胞脂質(zhì)沉積。 本研究結(jié)果與以上研究基本一致，COPD 組大鼠血Cr 及24 h 尿蛋白定量顯著升高，腎小球部分足突融合，腎小管細(xì)胞腫脹，線粒體脊減少，腎間質(zhì)膠原纖維增多。

CKD 的造模方法有手術(shù)干預(yù)、化學(xué)誘導(dǎo)等，考慮到手術(shù)操作死亡率較高、可用腎組織較少等因素，本研究采用腺嘌呤誘導(dǎo)建立CKD 大鼠模型［18］。腎功能指標(biāo)Cr、BUN、24 h 尿蛋白定量在CKD 的臨床診斷、療效判定、動物模型構(gòu)建中具有較為重要的地位［19］。 腺嘌呤可代謝生成難溶性的2，8-二羥基腺嘌呤，在腎小管中形成晶體，增加血清Cr 和BUN 水平，產(chǎn)生蛋白尿，并誘發(fā)腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，這與CKD 患者的臨床病理特征相似［20］，因此腺嘌呤誘導(dǎo)法被廣泛應(yīng)用于探索CKD 發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)的研究［21］。 本研究結(jié)合腎功能及腎組織病理變化證實(shí)CKD 大鼠模型復(fù)制成功，同時COPD ＋CKD 組腎功能指標(biāo)顯著高于CKD 組，腎小管擴(kuò)張及間質(zhì)纖維化更明顯，電鏡結(jié)果顯示腎小管細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴沉積。 以上結(jié)果均證實(shí)COPD 合并CKD 大鼠模型制備成功。

研究表明多種病理生理機(jī)制促進(jìn)COPD 與CKD 的關(guān)聯(lián)性，其中炎性因子誘發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)可能在COPD 合并CKD 中起到重要作用［22］。 氣道上皮作為天然免疫的第一道防線，受各種外界環(huán)境刺激的影響。 香煙煙霧中的有害成分、細(xì)菌等可刺激巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞高度活化，釋放IL-6、IL-1β 等多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，不僅導(dǎo)致肺組織破壞，產(chǎn)生肺氣腫、氣流受限等肺內(nèi)炎癥表現(xiàn)［23］，還可造成全身炎癥狀態(tài)，引發(fā)血管生成、內(nèi)源性生長因子TGF-β 等釋放、成纖維細(xì)胞募集，促進(jìn)腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化［24］。 據(jù)報道，CKD 患者體內(nèi)IL-6、IL-13、IL-1β 及TGF-β 水平升高，且炎癥狀態(tài)的加重與腎功能下降呈正相關(guān)［25-28］。 同時，腎損傷后由于炎癥介質(zhì)的清除不足，又可進(jìn)一步加重肺部疾病，研究報道CKD 小鼠肺組織炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化，氧化應(yīng)激水平升高［29］；腎缺血再灌注大鼠模型中，肺TNF-α 水平升高，誘發(fā)肺部炎癥損傷，形成肺腎串?dāng)_的惡性循環(huán)［30］。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)COPD、CKD、COPD ＋CKD 組血清炎癥因子水平均升高，聯(lián)合組升高最為顯著，高于單一模型組，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了炎癥反應(yīng)在COPD 合并CKD 中的關(guān)鍵作用。

綜上，通過對大鼠肺腎功能及組織病理學(xué)的檢測表明采用香煙煙霧暴露聯(lián)合細(xì)菌感染合并2.5%腺嘌呤誘導(dǎo)的方法可成功構(gòu)建COPD 合并CKD 的大鼠模型。 相較于單一模型，合并模型在肺、腎功能、組織形態(tài)學(xué)、炎癥指標(biāo)方面表現(xiàn)出明顯的差異，說明兩種造模方法聯(lián)合可進(jìn)一步促進(jìn)疾病進(jìn)展，與臨床相符合，可應(yīng)用于COPD 合并CKD 的基礎(chǔ)研究。 但由于目前對該合并模型的相關(guān)研究尚不充分，有待進(jìn)一步研究評估其穩(wěn)定性和代表性。