TMAO 對脾虛高脂血癥大鼠脂代謝的影響及香砂六君子湯的干預(yù)作用

冷雪，李陽

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，沈陽 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物醫(yī)學(xué)與科學(xué)學(xué)院，沈陽 110847）

血脂代謝異常是動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生的潛在獨(dú)立因素之一，隨著人們?nèi)粘ｏ嬍匙兓?，血脂異常的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢［1］。 中醫(yī)多認(rèn)為血脂代謝異常與脾失健運(yùn)膏脂轉(zhuǎn)輸障礙密切相關(guān)［2］，脾氣失運(yùn)，膏脂滯留體內(nèi)，聚化痰濁，痰濁又加劇脾運(yùn)失司，往復(fù)循環(huán)，致使膏脂內(nèi)攝而難化。 脾虛引起的血脂代謝異常通常引起肝脂質(zhì)沉積現(xiàn)象［3］，可見脾、血脂代謝、肝脂代謝之間存在一定關(guān)聯(lián)，研究脂代謝紊亂引起血脂代謝異常類疾病的作用機(jī)制具有重要意義。

氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO）［4-5］為腸道菌群產(chǎn)生的代謝物。 研究發(fā)現(xiàn)TMAO 水平與血脂代謝存在明顯相關(guān)性［6］，同時TMAO 可以作為多種心血管疾病發(fā)生的潛在關(guān)鍵生物標(biāo)志物［7］，關(guān)鍵受體-蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase Rlike ER kinase，PERK）為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，其可通過啟動未折疊蛋白反應(yīng)達(dá)到保護(hù)細(xì)胞損傷的作用［8］；叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，F(xiàn)oxO1）是FOX 家族FOXO 亞科中成員之一［9］，控制介導(dǎo)代謝調(diào)節(jié)的下游基因轉(zhuǎn)錄［10］；FOXO1 可調(diào)控下游固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2 （ sterol-regulatory element-binding protein-2，SREBP-2）［11］，SREBP-2 進(jìn)而可調(diào)控下游miR-33a［12］，同時miR-33a 參與下游三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1） 的調(diào)控，進(jìn)而FOXO1 可通過SREBP-2/miR-33a/ABCA1 信號軸影響肝脂代謝調(diào)控過程［13］；Chen 等［14］發(fā)現(xiàn)TMAO/PERK/FOXO1 信號軸可能與脂代謝調(diào)控密切相關(guān)，前期研究也發(fā)現(xiàn)TMAO 與肝甘油三酯形成有一定的關(guān)聯(lián)性［15］。 因此，通過預(yù)防和/或恢復(fù)TMAO 水平可能是預(yù)防肝和血脂代謝異常發(fā)生發(fā)展的有效策略。 健脾益氣降濁之名方香砂六君子湯可干預(yù)脾虛高脂血癥大鼠血脂代謝異常及肝代謝紊亂的作用［16］。 但是腸道菌群TMAO 如何影響血脂及肝脂代謝異常及香砂六君子湯是否通過調(diào)控腸道菌群代謝物TMAO進(jìn)行的干預(yù)機(jī)制還需要深層次探究。 本研究以TMAO 為主要切入點(diǎn)，探討其通過PERK/FOXO1軸調(diào)控SREBP-2/miR-33/ABCA1 信號通路影響肝脂代謝紊亂的作用機(jī)制，以及探討香砂六君子湯對干預(yù)脂代謝異常的機(jī)制是否與TMAO 有關(guān)，以期為中醫(yī)藥防治血脂代謝異常類疾病提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

50 只7 周齡SPF 級SD 雄性大鼠，體重180 ～220 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司【SCXK（遼）2020-0001】。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗室【SYXK（遼）2019-0004】進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)（恒溫22 ～25℃，恒濕40% ～60%，晝夜各半照明），飼料由小黍有泰（北京）生物科技有限公司提供。 實(shí)驗通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物倫理委員會審批（21000042022008）。

1.1.2 主要試劑與儀器

Anti-SREBP-2（Proteintech，28212-1-AP），Anti-ABCA1（Abcam，ab66217），DMB（3，3-二甲基-1-丁醇，上海麥克林，D832026），4%多聚甲醛、蘇木素染液、油紅O 染液（上海碧云天P0099、C0105S、C0158S），膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒，（南京建成20210806、20210809）；大鼠游離脂肪酸（FFA）ELISA 試劑盒（上海源桔，YJ566656）。

全自動生化分析儀（日立，7180 型，日本）、多功能全波長酶標(biāo)儀（SpectraMaxi3，MD，美國）；高性能組織脫水機(jī)（ASP 6025，Leica，日本）、數(shù)字掃描顯微成像系統(tǒng)（M8，Precipoint，德國）；實(shí)時熒光定量PCR 儀（7500，ABI，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實(shí)驗干預(yù)

50 只大鼠適應(yīng)1 周后，隨機(jī)分為5 組，分別為：①空白對照組（C 組）：普通飼料飼喂，正常飲水；②空白對照＋DMB 組（C ＋D 組）：普通飼料飼喂，飼養(yǎng)12 周后飲水中加入1% DMB（TMAO 抑制劑），飲用4 周；③脾虛高脂血癥組（PG 組）：采用高脂飼料＋脾虛復(fù)合造模方法［17］，造模12 周；④脾虛高脂血癥＋DMB 組（PG ＋DMB 組）：采用高脂飼料＋脾虛復(fù)合造模方法［17］，造模12 周，之后給予DMB（飲水中加入1% DMB），4 周；⑤脾虛高脂血癥＋香砂六君子湯組（PG ＋XS 組）：采用高脂飼料＋脾虛復(fù)合造模方法［17］，造模12 周，灌胃香砂六君子湯4周，據(jù)前期結(jié)果［15］取最高劑量每天11.34 g 生藥/kg，為本實(shí)驗給藥劑量，每組10 只。

1.2.2 取材

模型構(gòu)建及給藥干預(yù)完成后，腹主動脈采血，全血一部分靜置2 h 后離心20 min（3000 r/min）取上清為血清備用，一部分全血用抗凝管采血（3000r/min 離心20 min）取上清血漿，肝組織分別分裝固定于4%多聚甲醛中及凍存在-80℃冰箱中。

1.2.3 全自動生化儀檢測大鼠血清血脂變化

應(yīng)用全自動生物化學(xué)分析儀進(jìn)行大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量的檢測。

1.2.4 形態(tài)學(xué)染色法（HE 染色、油紅O 染色）觀察肝變化

取固定好的組織進(jìn)行石蠟切片，操作按照HE染色試劑盒進(jìn)行，光學(xué)顯微鏡10 × 40 倍鏡下拍照；固定好的肝組織用OCT 包埋上機(jī)進(jìn)行冰凍切片（6 μm），根據(jù)油紅O 染色試劑盒進(jìn)行操作，甘油明膠封片后，10 × 40 倍鏡下拍照。

1.2.5 ELISA 法及酶標(biāo)儀試劑盒法檢測肝TG、TC、FFA 含量

按照ELISA 試劑盒和酶標(biāo)儀試劑盒的操作要求，取離心后的肝組織上清液進(jìn)行操作，之后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算肝中FFA、TG、TC 水平。

1.2.6 LC-MS 法檢測血漿TMAO 水平

將樣本溶液、內(nèi)標(biāo)溶液、80%乙腈水溶液進(jìn)行混合沉淀；再取25 μL 空白血漿，作為空白基質(zhì)樣本，加入25 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和50 μL 80%乙腈水溶液進(jìn)行沉淀；將上述樣本分別渦旋混勻后，4℃離心30 min（3500 r/min），提取50 μL 上清液操作上機(jī)。

1.2.7 qRT-PCR 法檢測肝PERK、FOXO1、SREBP-2、ABCA1、miR-33 mRNA 表達(dá)水平

RNA 后提取后反轉(zhuǎn)錄成mRNA 之后進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參為GAPDH、U6，2-ΔΔCt法進(jìn)行最后統(tǒng)計分析，引物序列（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.8 Western Blot 檢測肝SREBP-2、ABCA1 蛋白含量

提取肝蛋白，蛋白定量（BCA 法）后依次進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、4℃過夜一抗孵育、TBST 洗滌、二抗1 h、TBST 洗滌、曝光操作等步驟，最后應(yīng)用Image Studio 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 19.0 統(tǒng)計結(jié)果數(shù)據(jù)，以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血脂變化

與C 組相比，PG 大鼠血清TC、TG、LDL-C 水平升高明顯，HDL-C 水平降低（P＜ 0.05 或P＜0.01），C ＋D 組無顯著變化；與PG 組相比，分別給予TMAO 抑制劑DMB 及灌胃香砂六君子湯后，PG＋D 組和PG ＋XS 組大鼠血清中的TG、LDL-C 水平明顯降低，HDL-C 水平升高（P＜0.01），各組TC 含量有降低趨勢無顯著性差異；與PG ＋D 組相比，PG＋XS 組除LDL-C 含量減少程度較低（P＜0.01），其余無變化（表2）。

表2 各組大鼠血脂水平（±s，mmol/L，n ＝6）Table 2 Serum lipid levels of rats in each group（±s，mmol/L，n ＝6）

表2 各組大鼠血脂水平（±s，mmol/L，n ＝6）Table 2 Serum lipid levels of rats in each group（±s，mmol/L，n ＝6）

注：與C 組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與PG 組相比，＃＃P ＜0.01；與PG ＋D 組相比，ΔΔP ＜0.01。 （下表同）Note. Compared with C group，*P ＜0.05，**P ＜0.01. Compared with PG group，＃＃P ＜0.01. Compared with PG ＋D group，ΔΔP ＜0.01. （The same in the following tables）

分組GroupsTCTGLDL-CHDL-C C 組C group1.62 ± 0.231.47 ± 0.140.34 ± 0.050.59 ± 0.07 C ＋D 組C ＋D group1.63 ± 0.351.35 ± 0.330.32 ± 0.060.54 ± 0.08 PG 組PG group2.00 ± 0.35*2.16 ± 0.17**0.51 ± 0.05**0.30 ± 0.05**PG ＋D 組PG ＋D group1.72 ± 0.280.58 ± 0.08＃＃0.35 ± 0.05＃＃0.45 ± 0.10＃＃PG ＋XS 組PG ＋XS group1.73 ± 0.300.67 ± 0.40＃＃0.44 ± 0.05＃＃ΔΔ0.52 ± 0.06＃＃

2.2 肝HE 染色

HE 染色可見，C 組及C ＋D 組肝細(xì)胞質(zhì)地均勻，無脂質(zhì)空泡出現(xiàn)；與C 組相比，PG 組出現(xiàn)肝空泡現(xiàn)象；與PG 組相比，PG ＋D 組及PG ＋XS 組大鼠肝組織內(nèi)細(xì)胞脂質(zhì)空泡數(shù)量顯著減少，細(xì)胞空隙有所恢復(fù)（圖1）。

圖1 各組大鼠肝HE 染色Figure 1 HE staining of liver of rats in each group

2.3 肝脂質(zhì)沉積情況

通過油紅O 染色進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)C 組、C ＋D 組大鼠肝無脂質(zhì)沉積；與C 組相比，PG 組大鼠肝紅色油滴出現(xiàn)，具有明顯的脂質(zhì)沉積現(xiàn)象；與PG 組相比，PG ＋D 組及PG ＋XS 組大鼠肝內(nèi)脂質(zhì)沉積現(xiàn)象有一定程度的減弱（圖2）。

圖2 各組大鼠肝脂質(zhì)沉積情況Figure 2 Liver lipid deposition of rats in each group

2.4 肝FFA、TG、TC 含量

與C 組相比，PG 組大鼠肝FFA、TG、TC 水平升高明顯（P＜0.01），C ＋D 組無顯著性差異；與PG組相比，給予TMAO 抑制劑DMB、香砂六君子湯分別干預(yù)后，PG ＋D 組及PG ＋XS 組大鼠FFA、TG、TC 水平降低明顯（P＜0.05，P＜0.01）；與PG ＋D組相比，PG ＋XS 組無顯著性差異（表3）。

表3 各組大鼠肝FFA、TG、TC 含量（±s，n ＝5）Table 3 Liver FFA，TG and TC contents of rats in each group（±s，n ＝5）

注：與PG 組相比，＃P ＜0.05。 （下表同）Note. Compared with PG group，＃P ＜0.05. （The same in the following tables）

分組GroupsFFA（μmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）C 組C group1442.11 ± 129.641.31 ± 0.0518.23 ± 3.12 C ＋D 組C ＋D group1466.08 ± 80.521.41 ± 0.1615.68 ± 1.18 PG 組PG group1754.82 ± 218.48**2.90 ± 1.18**24.80 ± 2.87**PG ＋D 組PG ＋D group1374.35 ± 64.19＃＃1.73 ± 0.17＃＃21.48 ± 3.25＃PG ＋XS 組PG ＋XS group1383.73 ± 115.19＃＃1.62 ± 0.22＃＃19.61 ± 2.27＃＃

2.5 血漿TMAO 含量及肝PERK、FOXO1 mRNA變化

如表4 所示，與C 組相比，PG 組大鼠血漿TMAO 水平、肝PERK、FOXO1 mRNA 表達(dá)水平升高顯著（P＜0.01），C ＋D 組并無顯著性差異；與PG組相比，PG ＋D 組和PG ＋XS 組大鼠肝血漿TMAO水平、肝PERK、FOXO1 mRNA 表達(dá)水平均降低明顯（P＜0.01）；與PG ＋D 組相比，PG ＋XS 組PERK mRNA 表達(dá)降低明顯（P＜0.01）。

表4 各組大鼠血漿中TMAO 及肝PERK、FOXO1 mRNA 變化（±s，n ＝3）Table 4 Plasma TMAO content and liver PERK and FOXO1 mRNA expression levels of rats in each group（±s，n ＝3）

表4 各組大鼠血漿中TMAO 及肝PERK、FOXO1 mRNA 變化（±s，n ＝3）Table 4 Plasma TMAO content and liver PERK and FOXO1 mRNA expression levels of rats in each group（±s，n ＝3）

分組GroupsTMAO（ng/L）PERKFOXO1 C 組C group344.86 ± 17.401.00 ± 0.021.00 ± 0.08 C ＋D 組C ＋D group328.38 ± 46.931.11 ± 0.161.06 ± 0.06 PG 組PG group721.52 ± 3.26**9.11 ± 0.50**2.22 ± 0.10**PG ＋D 組PG ＋D group194.78 ± 10.54＃＃3.17 ± 0.06＃＃1.49 ± 0.18＃＃PG ＋XS 組PG ＋XS group193.86 ± 3.33＃＃1.54 ± 0.02＃＃ΔΔ1.37 ± 0.25＃＃

2.6 肝中SREBP-2、miR-33a、ABCA1mRNA 變化

與C 組相比，PG 組大鼠肝SREBP-2、ABCA1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），miR-33a mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），C ＋D 對照組無顯著性差異；與PG 組比，PG ＋D 組大鼠肝SREBP-2 mRNA 表達(dá)升高（P＜ 0.05），miR-33a mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），ABCA1 mRNA 表達(dá)也升高但是無顯著性差異，PG ＋XS 組大鼠肝SREBP-2、ABCA1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），miR-33a mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）；與PG ＋D 組比，PG ＋XS 組SREBP-2、ABCA1mRNA 表達(dá)進(jìn)一步升高（P＜0.01），miR-33a mRNA表達(dá)有進(jìn)一步降低趨勢，但無顯著性差異（表5）。

表5 各組肝SREBP-2、miR-33a、ABCA1 mRNA 的表達(dá)水平（±s，n ＝3）Table 5 mRNA expression levels of SREBP-2，miR-33a and ABCA1 in liver of each group（±s，n ＝3）

表5 各組肝SREBP-2、miR-33a、ABCA1 mRNA 的表達(dá)水平（±s，n ＝3）Table 5 mRNA expression levels of SREBP-2，miR-33a and ABCA1 in liver of each group（±s，n ＝3）

分組GroupsSREBP-2miR-33aABCA1 C 組C group1.00 ± 0.021.08 ± 0.541.00 ± 0.07 C ＋D 組C ＋D group0.96 ± 0.071.11 ± 0.311.07 ± 0.11 PG 組PG group0.15 ± 0.02**7.23 ± 0.41**0.25 ± 0.02**PG ＋D 組PG ＋D group0.21 ± 0.02＃2.70 ± 0.39＃＃0.26 ± 0.01 PG ＋XS 組PG ＋XS group0.38 ± 0.02＃＃ΔΔ2.51 ± 0.14＃＃0.53 ± 0.03＃＃ΔΔ

2.7 肝SREBP-2、ABCA1 蛋白表達(dá)變化

如表6、圖3 所示，與C 組相比，PG 組大鼠肝SREBP-2、ABCA1 蛋白表達(dá)降低明顯（P＜0.01），C ＋D 對照組并無顯著性差異；與PG 組比，PG ＋D組SREBP-2、 ABCA1 蛋白表達(dá)升高明顯（P＜0.05），PG ＋XS 組SREBP-2、ABCA1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與PG ＋D 組比，PG ＋XS 組SREBP-2、ABCA1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖3 大鼠肝SREBP-2、ABCA1 蛋白表達(dá)變化Figure 3 Relative contents of SREBP-2 and ABCA1 protein expression in liver of rats in each group

表6 各組大鼠肝SREBP-2、ABCA1 蛋白表達(dá)相對含量（±s，n ＝3）Table 6 Relative contents of SREBP-2 and ABCA1 protein expression in liver of rats in each group（±s，n ＝3）

表6 各組大鼠肝SREBP-2、ABCA1 蛋白表達(dá)相對含量（±s，n ＝3）Table 6 Relative contents of SREBP-2 and ABCA1 protein expression in liver of rats in each group（±s，n ＝3）

注：與PG ＋D 組相比，ΔP ＜0.05。Note. Compared with PG ＋D group，ΔP ＜0.05.

分組GroupsSREBP-2ABCA1 C 組C group1.17 ± 0.131.09 ± 0.16 C ＋D 組C ＋D group1.29 ± 0.041.16 ± 0.11 PG 組PG group0.74 ± 0.11**0.57 ± 0.01**PG ＋D 組PG ＋D group0.92 ± 0.01＃0.84 ± 0.04＃＃PG ＋XS 組PG ＋XS group1.01 ± 0.21＃＃1.07 ± 0.07＃＃Δ

3 討論

脂代謝紊亂極易引起脂肪肝、動脈粥樣硬化、高脂血癥等疾病，也給患者帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［18］，因此調(diào)控血脂代謝是迫切之需。 《素問·經(jīng)脈別論篇》說：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾。 脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水津四布……”，可見脾運(yùn)化的重要性［19］。 “血脂”類似于中醫(yī)的“膏脂”［20］，脾的運(yùn)化功能也與血脂代謝、脂代謝等密切關(guān)聯(lián)，“脾失運(yùn)化，濁滯血脈”［21-22］?！峨s病源流犀燭·痰飲源流》云：“好食油面豬脂，以至脾氣不利，壅滯為痰?！笨梢姵Ｓ湍侊嬍常鹌⑻搶?dǎo)致運(yùn)化功能減弱，進(jìn)一步引起痰濁內(nèi)生，而大量的痰濁凝滯于肝脈，造成肝脂代謝紊亂。 近期研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可產(chǎn)生代謝物TMAO［23-24］。 目前研究顯示TMAO 與脂代謝紊亂引起ASCVD 的發(fā)生發(fā)展具有一定相關(guān)性，其參與了動脈粥樣硬化［25］、冠心?。?6］、糖尿?。?7］等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及相關(guān)并發(fā)癥的產(chǎn)生過程。 湯景輝等［28］發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ZDY04 可減輕TMAO 誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠體內(nèi)的動脈粥樣硬化，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)RCT 過程；此外發(fā)現(xiàn)TMAO 含量與斑塊的形成有相關(guān)性，并能抑制膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而導(dǎo)致脂代謝異常［29］；靳步等［30］發(fā)現(xiàn)TMAO 可通過影響微管蛋白聚合、T 小管重構(gòu)等促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生。 提示TMAO 水平變化與ASCVD 疾病的發(fā)展至關(guān)重要，TMAO 的調(diào)控是治療ASCVD 疾病的有效策略之一。 香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》，可對脾失健運(yùn)引起的膏脂代謝異常起到一定的干預(yù)作用［31-32］。 課題組前期發(fā)現(xiàn)香砂六君子湯對肝脂代謝異常具有一定的干預(yù)作用，具體機(jī)制還未明晰［16］。

本實(shí)驗造模方法遵循以往團(tuán)隊方法，在脾虛高脂血癥模型基礎(chǔ)上分別給予TMAO 抑制劑（DMB）、香砂六君子湯進(jìn)行干預(yù)，觀察TMAO 對脾失健運(yùn)引起膏脂轉(zhuǎn)輸障礙引起的肝脂質(zhì)沉積的影響及香砂六君子湯的干預(yù)機(jī)制研究。 本次發(fā)現(xiàn)PG 組大鼠血脂變化、形態(tài)學(xué)變化及血漿中TMAO 變化與團(tuán)隊前期結(jié)果一致［15］，同時大鼠肝TG、TC、FFA 水平明顯增加；給予DMB 對TMAO 進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)DMB 可以顯著抑制TMAO 的生成，此外TMAO 被抑制后，可緩解血脂代謝水平，同時改善了肝脂代謝紊亂現(xiàn)象。 研究發(fā)現(xiàn)給予香砂六君子湯可通過降低血漿TMAO 含量，進(jìn)而改善血脂代謝紊亂、肝脂代謝紊亂的現(xiàn)象，其效果類似于TMAO 抑制劑DMB。 體外實(shí)驗發(fā)現(xiàn)TMAO 對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程具有一定的干擾［33］；Saaoud 等［34］同樣發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激介質(zhì)PERK（TMAO 受體），會抑制TMAO 誘導(dǎo)的HAECs 激活。 叉頭框（forkhead box FOX）家族參與代謝的關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)錄因子［35］，研究顯示FOXO1 參與小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的調(diào)節(jié)［36］，同時也是調(diào)控心腦血管疾病的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)［37］，F(xiàn)OXO1 通路功能障礙易導(dǎo)致非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化等疾病［9］。 Chen 等［14］發(fā)現(xiàn)PERK 與TMAO 結(jié)合，通過激活PERK 分支，可進(jìn)一步誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子FOXO1，進(jìn)而影響血脂異常類疾病的發(fā)生發(fā)展，提示TMAO/PERK/FOXO1 信號軸可能與脂代謝調(diào)控密切相關(guān)。

本研究顯示，PG 組大鼠血漿TMAO 含量升高，通路軸上PERK、FOXO1 mRNA 及蛋白表達(dá)明顯增加，提示TMAO 可以啟動PERK/FOXO1 軸參與FOXO1 對下游脂代謝的調(diào)節(jié)；給予DMB 后可以顯著降低TMAO 的含量從而抑制下游PERK、FOXO1的表達(dá)；同樣給予香砂六君子湯后，可以通過抑制TMAO 來抑制TMAO/PERK/FOXO1 軸的表達(dá)。

FOXO1 可參與下游多種因子代謝調(diào)節(jié)，研究顯示固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2（SREBP-2）可以在轉(zhuǎn)錄水平上被FOXO1 調(diào)控［11］，SREBP-2 參與膽固醇代謝調(diào)控過程，通常特異性結(jié)合LDLR、HMGCR 等基因［38］，研究顯示電針可通過調(diào)控SCAP/SREBP-2 通路干預(yù)高脂血癥大鼠膽固醇代謝紊亂的現(xiàn)象［39］；此外小鼠巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積也與SREBP2 表達(dá)相關(guān)［40］；課題組前期發(fā)現(xiàn)脾虛高脂血癥大鼠肝脂質(zhì)沉積、血脂紊亂可能與miR122a/SREBP-2 通路有關(guān)［41］。 miRNAs 是一類非編碼RNA，參與機(jī)體內(nèi)多種代謝調(diào)控過程［42］。 miR-33a 由SREBP 基因內(nèi)含子編碼，參與肝脂代謝調(diào)控過程［12］。 研究發(fā)現(xiàn)miR-33a 可與SREBP-2 聯(lián)合提高細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，并加劇肝脂代謝紊亂［42］，可見miR-33a 與SREBPs 協(xié)同作用是促進(jìn)肝脂質(zhì)合成的關(guān)鍵步驟。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A（ABCA1）參與HDL 生成過程［43］，其可受到miR-33 的調(diào)控，miR-33a 水平降低可增加ABCA1 表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出［44］；小鼠體內(nèi)注射miR-33 腺病毒抑制ABCA1 表達(dá)，相反注射反義寡核苷酸miR-33 腺病毒的小鼠體內(nèi)ABCA1 表達(dá)增高，可見ABCA1 是miR-33 真正的靶標(biāo)基因［45］。

SREBP-2/miR-33a/ABCA1 三個關(guān)鍵基因，形成調(diào)控脂代謝的代謝通路，這對肝脂質(zhì)沉積的形成至關(guān)重要。 本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，在PG 組大鼠肝中SREBP-2、ABCA1 mRNA 及蛋白表達(dá)均不同程度降低，miR-33a mRNA 表達(dá)顯著上升；給予DMB 后可以進(jìn)一步促進(jìn)SREBP-2、ABCA1mRNA 及蛋白表達(dá)，抑制miR-33a mRNA 表達(dá)，同樣香砂六君子湯對SREBP-2/miR-33a/ABCA1 軸的調(diào)控作用與DMB 一致。 可見DMB 可以通過抑制TMAO 的表達(dá)從而影響TMAO/PERK/FOXO1 軸介導(dǎo)的下游SREBP-2/miR-33a/ABCA1 通路從而抑制肝脂代謝紊亂導(dǎo)致的脂質(zhì)沉積現(xiàn)象；香砂六君子湯也可通過抑制TMAO 的表達(dá)起到影響TMAO/PERK/FOXO1 軸介導(dǎo)的下游SREBP-2/miR-33a/ABCA1 通路作用，進(jìn)而干預(yù)脂代謝紊亂的作用，起到抑制大鼠肝脂質(zhì)沉積發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，TMAO 可能通過參與調(diào)控PERK/FOXO1 代謝軸，靶向下游的SREBP-2/miR-33a/ABCA1 信號通路，影響ABCA1 表達(dá)，進(jìn)而引起肝脂質(zhì)沉積；香砂六君子湯可通過抑制TMAO 的表達(dá)，調(diào)控PERK/FOXO1 代謝軸，影響下游SREBP-2/miR-33a/ABCA1 通路，進(jìn)而改善肝脂代謝紊亂現(xiàn)象。 但本研究也存在一定的局限性，香砂六君子湯是否通過干預(yù)腸道菌群來干預(yù)TMAO 的作用機(jī)制達(dá)到調(diào)控脂代謝紊亂的作用，仍需深入研究。