微小脲原體核糖體蛋白L23基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

馬 良，范顯峰，栗曉燕，薛紅杰，賈澤瑋，賈天軍

(河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口 075000)

微小脲原體核糖體蛋白L23基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

馬 良，范顯峰，栗曉燕，薛紅杰，賈澤瑋，賈天軍

(河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口 075000)

目的構(gòu)建微小脲原體核糖體蛋白L23基因原核表達(dá)載體并表達(dá)蛋白，為研究微小脲原體的生物學(xué)特性提供依據(jù)。方法根據(jù)NCBI上的微小脲原體核糖體蛋白L23基因序列設(shè)計(jì)引物，以微小脲原體基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增目的基因后進(jìn)行純化，利用限制性內(nèi)切酶BamH I和NotI對(duì)原核表達(dá)載體pGEX-6P-2和目的基因進(jìn)行雙酶切，并通過T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌后接種至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)形成的菌落進(jìn)行PCR篩選和質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物超聲裂解后經(jīng)GST Sepharose 4B純化，SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果經(jīng)PCR成功克隆出目的基因，全長(zhǎng)345 bp，使用pGEX-6P-2質(zhì)粒通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化有連接產(chǎn)物的大腸桿菌菌落進(jìn)行PCR篩選鑒定，陽(yáng)性菌落的PCR條帶大小為468 bp，與預(yù)期相符，對(duì)篩選出的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI中的基因序列完全一致，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，融合蛋白分子量質(zhì)約為36.6 kD，與預(yù)期一致。結(jié)論成功構(gòu)建了微小脲原體核糖體蛋白L23原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)融合蛋白的表達(dá)，為微小脲原體核糖體蛋白L23基因以及解脲脲原體的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

微小脲原體；原核表達(dá)；核糖體蛋白；解脲脲原體

解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum)屬于柔膜體綱支原體科脲原體屬，是人類泌尿生殖道一種常見的條件致病微生物。根據(jù)幾個(gè)高度保守基因的核苷酸序列、基因組大小等多個(gè)方面的差異，解脲脲原體可分為解脲脲原體(U.urealyticum)和微小脲原體(U.parvum)兩個(gè)物種[1]。微小脲原體可引起如非淋菌性尿道炎、前列腺炎、子宮頸炎和盆腔炎等疾病[2-3]，并可通過母嬰垂直傳播導(dǎo)致新生兒肺病、腦膜炎等多種疾病[4-5]。微小脲原體是除生殖支原體外最小的可獨(dú)立生存的微生物，且具有較獨(dú)特的能量代謝方式，95%的ATP均由尿素水解產(chǎn)生[6]。核糖體蛋白L23是50S核糖體亞基的重要組成部分，后者對(duì)微生物蛋白質(zhì)的合成具有重要意義[7-8]。微小脲原體核糖體蛋白L23的核苷酸與蛋白序列具有種屬特異性，我們擬克隆出此基因，并進(jìn)行其編碼蛋白的表達(dá)，為了解其生物學(xué)功能以及微小脲原體的預(yù)防與治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Primer STAR HS高保真酶、BamH I和NotI限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DL2000 DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Glutathione Sepharose TM 4B微珠購(gòu)自GE Healthcare公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker購(gòu)自NEB公司；微小脲原體菌株hebnu uu3、XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)NCBI上hebnu uu3株的50S核糖體蛋白L23基因核苷酸序列，利用Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物:5′-CGC-GGATCC-ATGGAATTAACAAGAGTTATTTT-3′;下游引物:5′-TTTTCCTTTT-GCGGCCGC-CTACTTTGCGTTTGCTGCTT-3′(下劃線部分為酶切位點(diǎn))。以微小脲原體基因組為模板，PCR反應(yīng)體系為100 μL：5×Primer STAR Buffer 20 μL，dNTP(2.5 mmol) 8 μL，上下游引物各4 μL，模板4 μL，Primer STAR高保真聚合酶1 μL，三蒸水59 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，利用酚-氯仿法純化，-20℃保存。

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)擴(kuò)增的目的基因和pGEX-6P-2載體質(zhì)粒分別進(jìn)行BamH I和NotI雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物再次進(jìn)行酚-氯仿法純化，使用T4連接酶進(jìn)行過夜連接。使用熱休克法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至XL1-blue感受態(tài)細(xì)菌中，將菌液涂布于含有氨芐西林(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。從培養(yǎng)基上挑取半個(gè)菌落作為模板，利用pGEX-6P-2質(zhì)粒通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析并記錄。將擴(kuò)增出目的片段的剩余半個(gè)菌落接種于含Amp的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，取3 mL菌液提取質(zhì)粒，提取步驟按試劑盒操作書，提取的質(zhì)粒送華大基因進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 原核載體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液加入含有Amp的TB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)約3 h至A值達(dá)0.8后加入IPTG 12 μL，30 ℃誘導(dǎo)通氣培養(yǎng)3 h，離心收集菌體后加入裂解液進(jìn)行超聲裂解，將裂解后的菌體離心，取上清后加入300 μL經(jīng)預(yù)處理的Glutathione Sepharose TM 4B beads，室溫翻轉(zhuǎn)吸附2 h，對(duì)吸附后的beads離心并棄去上清，PBS溶液清洗3次，加SDS上樣緩沖液后95 ℃變性5 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮蘭染色。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

對(duì)PCR擴(kuò)增得到的目的基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得與預(yù)期大小相符的條帶,分子量約為345 bp(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量 1.目的基因PCR擴(kuò)增條帶圖1 PCR擴(kuò)增基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量 1.目的基因菌落PCR擴(kuò)增條帶圖2 菌落PCR鑒定結(jié)果

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用pGEX-6P-2通用引物進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約468 bp位置處觀察到一條特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合(圖2)。

2.3 對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定

將重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與NCBI中微小脲原體hebnuuu3株的核糖體蛋白L23基因序列通過BLAST進(jìn)行比對(duì)，二者的同源性為100%,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)。

2.4 融合蛋白的表達(dá)與鑒定

表達(dá)的融合蛋白經(jīng)純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，顯示其分子質(zhì)量約為36.6 kD(部分降解的GST為29 kD)，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果比對(duì)圖

M.蛋白標(biāo)志物 1.目的蛋白SDS-PAGE條帶圖4 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

3 討 論

作為一種條件致病菌，微小脲原體可導(dǎo)致泌尿生殖系統(tǒng)的多種疾病，并與干眼癥、高氮血癥等疾病關(guān)聯(lián)[9-10]。微小脲原體沒有細(xì)胞壁，對(duì)β內(nèi)酰胺類藥物天然耐藥；因不存在葉酸代謝途徑，對(duì)磺胺類藥物也具有抵抗力[11]。目前針對(duì)微小脲原體的治療主要采用四環(huán)素類，大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類3種藥物。但由于抗生素濫用等原因，中國(guó)的微小脲原體菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類藥物的耐藥性日益嚴(yán)重[12-13]，需要引起重視。50S核糖體是多種抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等的藥物作用靶點(diǎn)，對(duì)核糖體蛋白的研究可能有助于對(duì)微小脲原體耐藥機(jī)制的理解。

原核細(xì)胞核糖體沉降系數(shù)為70S，由較小的30S和較大的50S亞基組成。30S亞基由一個(gè)16S rRNA和約21個(gè)蛋白組成，而50S亞基由兩個(gè)rRNA(5S rRNA和23S rRNA)和31個(gè)蛋白組成[14]。50S亞基可催化肽酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)，防止肽鏈水解，并通過折疊多肽鏈輔助蛋白質(zhì)的形成[7-8]。核糖體L23蛋白是50S亞基的重要組成部分。在大腸桿菌中，L23蛋白是維持其生長(zhǎng)的關(guān)鍵蛋白之一，信號(hào)識(shí)別顆粒在核糖體的肽出口處與L23蛋白結(jié)合[15]，進(jìn)而介導(dǎo)觸發(fā)因子(trigger factor,TF)和核糖體之間的交聯(lián)，而TF則是新生肽鏈結(jié)合的第一個(gè)分子伴侶，對(duì)于新生肽鏈的折疊以及成為功能蛋白具有重要作用[16]。還有研究表明，耶爾森菌屬的核糖體L23蛋白是引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎的重要免疫顯性抗原[17]。目前對(duì)微小脲原體核糖體L23蛋白的研究較少，通過BLASTP和SmartBLAST可以發(fā)現(xiàn)微小脲原體和解脲脲原體的蛋白序列同源性較高(≥97%)，但與其他細(xì)菌同源性較低(≤62%)，這可能與其獨(dú)特的物質(zhì)能量代謝有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了微小脲原體核糖體蛋白L23基因原核表達(dá)載體，并表達(dá)了GST融合蛋白，為微小脲原體的后續(xù)研究提供了依據(jù)。

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ConstructionandExpressionofProkaryoticExpressionVectorofRibosomalProteinL23GeneofUreaplasmaParvum

MALiang,FANXian-feng,LIXiao-yan,XUEHong-jie,JIAZe-wei,JIATian-jun

(College of Medical Laboratory,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

ObjectiveTo construct expression vector of ribosomal protein L23 gene ofUreaplasmaparvumand express its fusion protein,which may lay foundation for further exploiting in its biological characteristics.MethodsThe primers were designed according to the published NCBI gene sequence.The gene was amplified with PCR and purified.The target gene and vector PGEX-6P-2 were digested byBamH I andNotI,and then recombined with T4 DNA ligase.The recombinant plasmid was transformed into XL1-Blue bacteria,and the bacteria were inoculated into agar plates with LB medium and ampicillin.The colonies were identified by colony PCR and plasmid sequencing.The expression of GST fusion protein was induced by IPTG.The bacterial supersonic lysates were purified by GST Sepharose 4B and analyzed by SDS-PAGE.ResultsThe PCR product of ribosomal protein L23 gene ofUreaplasmaparvumwas about 345 bp in length.The recombinant plasmid was identified by colony PCR and the fragment of the PCR was 468 bp.The homology between sequenced results and the published sequence was 100%.The relative molecular mass of the fusion protein was about 36.6 kD which was consistent with the presumed protein.ConclusionThe prokaryotic expression vector was successfully constructed and the fusion protein was expressed inE.coli,which may be helpful for further study ofUreaplasmaparvum.

Ureaplasmaparvum;prokaryotic expression;ribosomal protein;Ureaplasmaurealyticum

來稿日期：2017-09-13

馬良(1987-)，男，河北廊坊人，河北北方學(xué)院碩士研究生，主要從事解脲脲原體相關(guān)研究。

賈天軍(1968-)，男，河北張家口人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事抗感染免疫相關(guān)研究。

Q 78

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.12.001

李薊龍英文編輯劉彥哲]