植原體基因組學研究進展

楊 毅， 車海彥， 曹學仁， 羅大全

(中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，農業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海南省熱帶農業(yè)有害生物監(jiān)測與控制重點實驗室，?？?571101)

專論與綜述

植原體基因組學研究進展

楊 毅， 車海彥， 曹學仁， 羅大全*

(中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，農業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海南省熱帶農業(yè)有害生物監(jiān)測與控制重點實驗室，?？?571101)

植原體(phytoplasma)是一類重要的植物病原細菌，可經葉蟬、飛虱等昆蟲介體傳播，感染1 000多種植物，產生叢枝、黃化、韌皮部黑斑壞死等癥狀，給農業(yè)、林業(yè)生產帶來巨大的損失。本文對植原體基因組學研究的歷史、現狀及當前植原體效應蛋白等方面的研究進展進行了綜述。

植原體； 基因組； 效應蛋白； 病原-寄主互作

植原體(phytoplasma)是一類植物病原原核生物，分類上隸屬于軟壁菌門(Tenericutes，又稱無壁菌門)柔膜菌綱(Mollicutes)植原體暫定屬[Candidatus(Ca.) genus Phytoplasma]。它可通過具刺吸式口器的葉蟬、飛虱、木虱、蝽等半翅目昆蟲感染一千多種植物。在被感染的植物中，植原體主要定殖于韌皮部的篩管細胞中，引起植物的病癥有叢枝、黃化、植株退化矮縮、花變葉、花綠化以及韌皮部黑斑壞死等(圖1)。在昆蟲介體中，植原體隨植物汁液被昆蟲取食后進入昆蟲腸道，再穿過腸壁細胞進入昆蟲的體液循環(huán)，最后主要在唾腺細胞中增殖。當昆蟲介體再次在植物的韌皮部取食時，植原體又隨著昆蟲回吐的唾液進入植物中，完成侵染循環(huán)[1]。植原體病害在世界各地廣泛分布，對糧食作物、經濟作物、林業(yè)及果樹生產帶來巨大的危害，我國發(fā)生的泡桐叢枝病、棗瘋病、小麥藍矮病、檳榔黃化病以及國外發(fā)生的葡萄黃化病、蘋果簇生病、椰子致死黃化病等都是由植原體引起。

植原體只能寄生在植物或昆蟲的活細胞內，迄今為止無法在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，很難進行生理生化特性、代謝需求、致病機理以及與寄主互作等方面的研究。獲得植原體的全基因組序列，是研究植原體這種難培養(yǎng)細菌的重要基礎，也一直是植原體研究的熱點與難點。

1 植原體的物理圖譜研究

早期的植原體基因組研究，測定了植原體基因組的G+C含量和染色體的大小，并構建了植原體染色體的物理圖譜。

G+C含量是基因組的一個重要特征，具有種屬特異性，也是柔膜菌綱細菌鑒定和分類的重要參數。柔膜菌綱細菌的G+C含量大多在24%～35%之間[2]。1989年，Kollar等用氯化銫密度梯度離心結合高效液相色譜(HPLC)方法研究發(fā)現，蘋果簇生植原體、長春花小葉植原體等基因組的G+C含量在23.0%～26.2%之間，同時在植原體的基因組中只檢測到了很少量的甲基化堿基[3]。同年，Sears等用相似的技術方法對晚櫻草(OenotherahookeriT. & G. strain Johansen)變葉病植原體基因組進行了研究，發(fā)現G+C含量小于30%，DNA復雜度相對較低，質粒有較高的拷貝數[4]。

圖1 植物感染植原體后的癥狀Fig.1 Typical symptoms associated with phytoplasma presence

測定技術和手段的進步對促進自然科學的發(fā)展有重要作用，1983年發(fā)明的脈沖場電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)是一種重要的分離大分子量DNA的電泳技術，遠遠突破了傳統(tǒng)瓊脂糖電泳只能分離不超過50 kb DNA片段的限制，使得分離的DNA片段大小上限達到了Mb級[5]。脈沖場電泳技術的發(fā)明，使得可以從整體上研究植原體的基因組。

1993年，Neimark等用脈沖場電泳方法，第一次從植物寄主中分離出完整的植原體染色體，研究發(fā)現植原體具有環(huán)形的染色體，大小為640～1 185 kb[6]。此后，Marcone等測定了12個主要植原體組中的共71個植原體的染色體，全面地對植原體的染色體大小進行了準確測定[7]。Marcone等的結果表明，翠菊黃化植原體組的植原體染色體大小在660～1 130 kb之間；僵化植原體組的植原體染色體在860～1 350 kb之間，其中STOLF 株系有已知最大的植原體染色體(1 350 kb)；西方X病植原體組的染色體大小在670～1 075 kb之間；百慕大草白葉植原體(Bermuda grass white leaf phytoplasma)有最小的染色體(約為530 kb)，不僅是柔膜菌綱中最小的染色體，而且是當時已知的細胞生物中最小的染色體；其余測定的植原體染色體都小于1 000 kb；試驗中還發(fā)現有的樣品中有不止一條植原體染色體帶存在的現象[7]。

用脈沖場電泳，同時結合內切酶酶切和Southern雜交技術，迄今為止共構建出5個植原體株系染色體的物理圖譜，分別為西方X病植原體(Western X-disease phytoplasma)、蘋果簇生植原體AT株系(apple proliferation phytoplasma strain AT)、甜薯小葉植原體V4株系(sweet potato little leaf phytoplasma strain V4)、歐洲核果黃化植原體GSFY1株系(European stone fruit yellows phytoplasma strain GSFY1)和葡萄金黃化植原體FD92株系(flavescence dorée phytoplasma strain FD92)，研究發(fā)現植原體都含有2個不連鎖的rRNA操縱子[8-12]。植原體染色體物理圖譜的獲得，進一步明確了植原體染色體的大小、結構和rRNA操縱子、tuf、fus、gid等基因在植原體染色體上的排列和位置，以及植原體基因組之間的差異和遺傳結構的多樣性。

2 植原體基因組研究

2.1 植原體基因組測序

由于植原體全基因組序列對于植原體研究的重要性，許多實驗室用不同的方法對植原體進行全基因組測序。

Liefting等用PFGE的方法純化西方X病植原體的染色體，構建了染色體片段的粘粒文庫(cosmid libraries)，測得了西方X病植原體基因組的部分序列[13]。Melamed等試圖從植原體的昆蟲介體中分離無寄主DNA污染的植原體基因組DNA[14]。Garcia-Chapa等用氯化銫密度梯度離心結合PCR的方法對梨衰退植原體的基因組進行了研究[15]。Cimerman等用抑制消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)研究了僵化植原體基因組[16]。Saccardo等用CTAB結合差速離心的方法提取植原體基因組，并用測序技術Illumina構建了植原體16SrIII組4個株系的基因組草圖[17]。Chung等用鳥槍法對花生叢枝植原體基因組進行了研究，構建的基因組草圖有13個染色體片段的重疊群，共562 kb，覆蓋了90%的染色體[18]。我國也啟動了小麥藍矮植原體和泡桐叢枝植原體全基因組測序研究，并取得了前期結果[19-20]。

2004年，日本Namba實驗室發(fā)表了首個植原體全基因組序列—洋蔥黃化植原體全基因組序列。這是過去十年中，植原體研究最重要的進展。迄今，共有4個植原體的全基因組序列被報道，分別為日本Namba實驗室報道的洋蔥黃化植原體M株系(CandidatusPhytoplasma asteris line onion yellows-mild，OY-M)[21]、美國Hogenhout實驗室報道的翠菊黃化植原體叢枝株系(aster yellows phytoplasma strain witches′ broom，AY-WB)[22]、澳大利亞Tran-Nguyen實驗室報道的澳大利亞植原體暫定種tuf-Australia I;rp-A(CandidatusPhytoplasma australiense subgrouptuf-Australia I;rp-A)[23]和德國Kube實驗室報道的蘋果簇生植原體(CandidatusPhytoplasma mali strain AT)[24]。

盡管現在測序技術十分成熟，獲得植原體的全基因組序列還是要克服很多困難，主要有以下原因。一、植原體是活細胞內專性寄生，不能體外培養(yǎng)，從寄主植物或昆蟲介體中提取的植原體基因組中總是有大量寄主DNA污染，很難獲得無污染的植原體DNA。二、某些植原體，尤其是寄生在木本植物中的植原體，通常含量較低，富集困難。測定蘋果簇生植原體基因組序列時，先把感染蘋果樹、梨樹和桃樹的蘋果簇生植原體通過菟絲子傳染到長春花和煙草中，使植原體在長春花和煙草中大量富集，再從長春花和煙草中提取植原體DNA[24]。三、雖然用PFGE方法可以較好地去除植原體DNA中寄主DNA的污染，但此方法操作復雜，且由于植原體沒有細胞壁，差速離心以及PFGE過程中很容易使菌體破裂DNA降解。用PFGE純化植原體DNA，需要此植原體株系在自然寄主中含量豐富或可以轉到其他植物中大量富集。Chung等進行花生叢枝植原體測序時，由于花生叢枝植原體在寄主長春花中含量很低，無法用PFGE進行純化[18]。四、植原體基因組富含AT堿基，在構建文庫時，寄主DNA比植原體DNA更容易克隆到載體里，很少的寄主DNA污染就會在文庫中產生大量的非植原體克隆[25]。五、大多植原體基因組中富含重復序列。重復序列更容易克隆到文庫中，這導致構建很大的文庫才能覆蓋全部植原體基因組[25]。大量的重復序列也給測序片段的拼接帶來困難。六、某些植原體基因組的G+C含量非常低，這就伴隨有大量的長同聚體和低復雜性的序列，導致用PCR方法填補拼接留下的空缺(gap)難以實現[18]。

2.2 植原體基因組的基本特征

比較分析已知的4個植原體基因組，有以下主要特征(表1)。植原體的染色體主要為環(huán)形，偶有線形染色體存在；G+C含量在21%～28%之間；600～800 kb的染色體上，約有70%的區(qū)域編碼蛋白，基因組共有500～800個基因；有31～35個tRNA；有2個rRNA操縱子；植原體與無膽甾原體屬的細菌一樣用UGA作為終止密碼子，而與植原體同屬柔膜菌綱的支原體等大多數細菌用UGA編碼色氨酸[21-24]。

植原體一般含有0～4個質粒(表1)，不同株系中質粒的拷貝數從1至2個到幾百個不等[26]。質粒上一般都有與質粒滾環(huán)復制相關的rep基因或danG基因以及ssb基因[22, 26-29]。質粒上的大多數基因都被預測為編碼分泌蛋白和膜蛋白[22, 27]，質粒上編碼的膜蛋白可能與昆蟲介體的傳播以及寄主特異性有關[30-31]，且質粒上的基因比染色體上的基因有更快的進化速度[32]。

2.3 植原體的生理生化及代謝特征

植原體有獨特的生理生化及代謝特征。通過對基因組序列的分析發(fā)現，植原體缺少參與氨基酸合成途徑、脂肪酸合成途徑、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)的許多基因，植原體很可能是依賴糖酵解途徑產生能量[21, 24]。柔膜菌綱的大多數細菌以及大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)等細菌，都有保守的磷酸戊糖途徑。細胞通過磷酸戊糖途徑合成的NADPH來獲得還原能力。磷酸戊糖途徑還提供核苷酸合成所必需的5-磷酸核糖。而在植原體的基因組中，找不到參與磷酸戊糖途徑的基因，植原體也缺少大多數合成核苷酸必需的基因[21, 24]。與植原體進化關系較遠的立克次氏體，也具有不完整的核苷酸合成途徑。立克次氏體與植原體都是寄生在細胞內，這些相同的基因丟失可能反映了趨同進化[21]。大多數細菌，都可以合成ATP，編碼ATP合成酶，且所有的ATP合成酶亞基基因都被認為是獨立復制的具細胞結構的生物必不可少的基因。而在植原體基因組中，8個ATP合成酶亞基基因都沒有發(fā)現[21, 23]。植原體有較多的編碼轉運蛋白的基因，一些還是多拷貝基因，可能植原體主要從寄主中吸收所需的代謝物質[21, 24]。以上代謝途徑和基因的缺失，可能是植原體長期寄生在營養(yǎng)豐富的細胞內，植原體的基因組產生了簡化進化[21]。

表1 植原體基因組的主要特征1)Table 1 General feature of phytoplasma genomes

1) 本表修改自Hogenhout等[25]。 This table is compiled based on Hogenhout et al., 2009[25].

2.4 PMU

盡管植原體基因組很小，但卻富含重復序列。重復序列中，多個特定基因組成的基因簇，稱為潛在移動元件(potential mobile unit, PMU)[21-24, 33]。植原體AY-WB株系的基因組中有7個PMU，其中1個PMU位于染色體195 949 bp至216 042 bp之間、包含21個ORF，稱為PMU1[22]。PMU1的一端是328 bp的插入序列(insertion sequences，ISs)和1個完整的轉座酶基因(tra5)，另一端是反向重復的327 bp ISs和1個不完整的tra5，被tra5 IS包在中間的序列有DNA引發(fā)酶基因(dnaG)、DNA解旋酶基因(dnaB)、胸苷激酶基因(tmk)、Zn依賴蛋白酶基因(hflB)、DNA結合蛋白HU基因(himA)、單鏈DNA結合蛋白基因(ssb)和?；痵igma因子(sigF)以及一些未知功能的基因[22]。在植原體AT株系中，預測有兩個PMU，其中一個與AY-WB株系的PMU1相似，但是缺少himA，且一側的tra5缺失，兩側的反向重復序列都缺失[24]。

PMU的序列特征和包含的基因表明，PMU可能以復制形式進行轉座，且參與基因組的重組和修復。與支原體相比，植原體缺少一些DNA重組和修復功能。植原體很可能通過PMU參與的重組增加變異，使植原體適應不同的植物和昆蟲寄主細胞環(huán)境[22]。

3 植原體的效應蛋白

由于植原體不能在體外培養(yǎng)，很難鑒定植原體的效應蛋白，植原體與植物寄主和昆蟲寄主的互作研究一直以來進展緩慢。獲得植原體全基因組序列信息以后，運用生物信息學方法，植原體的效應蛋白鑒定與分析研究進入了高速發(fā)展階段。對植原體效應蛋白的深入研究將有助于揭示植原體與寄主互作的分子機制，為植原體病害新的防控策略提供理論依據。

3.1 SAP11

Hogenhout實驗室用生物信息學軟件SignalP、TMHMM2.0、PSORT、PredictNLS、BPROM、Neural Network Promoter Prediction等對植原體AY-WB株系的全基因組進行了分析，在693個假定蛋白中鑒定出76個具有N端信號肽(N-terminal signal peptide, SP)的蛋白，這76個蛋白中有56個分泌到寄主細胞質中，命名為AY-WB分泌蛋白(secreted AY-WB proteins, SAP)，其中SAP11有1個N端信號肽和1個真核細胞核定位信號(nuclear localization signal, NLS)[34]。

Hogenhout實驗室研究發(fā)現，植原體AY-WB感染的植物中，可檢測到sap11基因轉錄，且SAP11蛋白定位于植物細胞核中并在細胞核中積累，突變了核定位信號的SAP11不在細胞核中積累[34]。這些結果表明，SAP11是植原體AY-WB編碼的一個定位于寄主植物細胞核的蛋白，可能是植原體與寄主植物互作的一個效應蛋白。進一步的研究發(fā)現，SAP11通過操縱植物發(fā)育和植物防御素的合成，有利于其昆蟲介體的繁殖[35]。

3.2 TENGU

Namba實驗室對植原體OY基因組的分泌蛋白進行了研究，在鑒定了30多個分泌蛋白的功能后發(fā)現了1個效應蛋白，將其命名為TENGU[36]。TENGU是一個只有4.5 ku、38個氨基酸的分泌蛋白，N端的11個氨基酸是TENGU的功能域[37]。

Namba等研究發(fā)現，轉tengu基因的煙草和擬南芥都表現出與感染植原體后相似的叢枝和矮化癥狀[36]。TENGU蛋白可從植物的韌皮部運輸到頂端分生組織，并通過抑制植物的生長素合成及信號調控途徑來影響植物發(fā)育[36]。對泡桐叢枝植原體的研究發(fā)現，泡桐叢枝植原體可顯著影響泡桐體內細胞分裂素和ABA的合成[38]。植原體可能通過擾亂植物體內的激素平衡，以此影響植物發(fā)育，產生叢枝、矮化等癥狀[36]。

3.3 SAP54

花變葉和綠化癥狀(圖1c)，是植原體病害的典型癥狀之一。已有研究發(fā)現，在植原體感染的植物中，參與花器官形成的多種基因調控失常，有關花器官發(fā)育關鍵基因的表達發(fā)生改變[39-40]。

MacLean等研究發(fā)現，植原體AY-WB的效應蛋白SAP54在擬南芥中超表達后，可改變擬南芥的花發(fā)育，使擬南芥產生花變葉癥狀，且只在韌皮部特異表達SAP54也產生同樣的癥狀[41]。

4 展望

全基因組序列是分子水平研究植物病原菌致病機理的重要基礎，對于植原體這類不能體外培養(yǎng)的病原菌來說，獲得全基因組序列尤為重要。由于植原體全基因組測序十分困難，迄今只有4種植原體株系的全基因組序列被測定。這4種植原體全基因組序列的發(fā)表，極大地推動了植原體致病機理的研究。在了解全基因組序列的基礎上，已進一步明確了植原體獨特的生理生化及代謝特征，鑒定出引起植物寄主叢枝、花變葉等植原體感染典型癥狀以及植原體與寄主互作的一些效應蛋白，但是這些效應蛋白與寄主互作的機理還有待進一步研究。

隨著更多種植原體株系全基因組序列的測定, 并在此基礎上進行的比較基因組學、轉錄組學以及功能基因組學研究，將會鑒定出更多的植原體效應蛋白，使我們深入了解植原體的致病機制、介體傳毒和病原寄主互作的機理，最終掌握植原體病害的發(fā)生流行規(guī)律，發(fā)展出新的植原體病害防控對策。

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Researchprogressinphytoplasmagenomes

Yang Yi, Che Haiyan, Cao Xueren, Luo Daquan

(InstituteofEnvironmentalandPlantProtection,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences;KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonTropicalCrops,MinistryofAgriculture,P.R.China;HainanKeyLaboratoryforMonitoringandControlofTropicalAgriculturalPests,Haikou571101,China)

Phytoplasmas are important bacterial plant pathogens transmitted by insects, such as leafhoppers and plant hoppers. Phytoplasmas can infect thousands of plants and also frequently induce witches’ broom(proliferation of stems, branches, and leaves), generalized yellowing and phloem necrosis, which can cause devastating yield losses. This review summarized the research history of phytoplasma genomes, current opinions and phytoplasma effectors.

phytoplasma; genome; effector; pathogen-host interaction

2014-01-18

：2014-05-13

國家自然科學基金(31201492)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(2012hzs1J001)

S 432.1

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.001

* 通信作者 Tel: 0898-66969235; E-mail: luodaquan@163.com