• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    類水滑石納米載體負載DNA質粒構建及植物基因遞送研究

    2023-12-02 22:57:51孫仲旭張漢超陳龍曾章華
    江蘇農業(yè)科學 2023年20期
    關鍵詞:納米材料

    孫仲旭 張漢超 陳龍 曾章華

    摘要:為克服外源基因在植物遺傳轉化中進入細胞過程復雜,轉染率低等問題,通過水熱法合成了一種粒徑較小、分散均一的類水滑石納米材料基因載體(layered double hydroxide nanosheets,簡稱LDHs)。通過傅里葉變換紅外光譜儀、透射電子顯微鏡、馬爾文納米粒度電位儀等對該硝酸根插層的類水滑石納米材料進行了表征,LDHs呈現較規(guī)則的六邊形層板結構、粒徑為20~80 nm,zeta電位是(39.8±2.5) mV,并借助瓊脂糖凝膠電泳試驗發(fā)現該材料可有效地和外源基因結合,當質粒與LDHs質量比為1 ∶3時可被完全負載,并保護核酸分子免受脫氧核糖核酸酶DNaseⅠ的消化水解作用。通過形成納米粒子-核酸復合體的方式,借助葉面無孔注射,將含有綠色熒光蛋白質粒DNA滲入到生長4周的野生型本氏煙草葉片中,4 d后可在激光共聚焦顯微鏡下清晰地觀察到目的信號。表明,類水滑石有望通過不借助外力的簡易方法將外源基因高效率地遞送入植物體從而實現完整的基因釋放及表達,展現出了此納米材料在植物納米基因載體方面的應用方面具備很大的潛力,對優(yōu)化外源基因遞送進入植物細胞進行遺傳轉化方面具有一定的指導意義。

    關鍵詞:類水滑石;基因載體;基因遞送;植物基因工程;納米材料

    中圖分類號:TB383;S184文獻標志碼:A

    文章編號:1002-1302(2023)20-0049-09

    植物基因工程是21世紀有關植物遺傳轉化和新品種培育的重要核心技術,是農業(yè)領域中的研究熱點和重要手段。在傳統(tǒng)的植物遺傳育種中,需要通過對多個植物世代進行多次雜交和篩選,以達到獲得具有目的性狀的植株品種。而植物基因工程通過與傳統(tǒng)育種技術相結合,借助一定的手段將體外分離的目的基因轉入植物細胞并表達,從而使目的植物獲得理想的性狀,例如抗病、抗蟲、抗逆等,有力地推動了轉基因農作物技術的發(fā)展[1]。然而相較于動物基因工程來說基因工程在植物上的研究相對較為滯后。主要的研究壁壘是植物細胞壁對于外界核酸分子的阻礙作用,為體外遺傳物質向細胞內的遞送轉運提供了一個額外的物理屏障。這也是基因工程工具在植物研究中實施和使用速度較慢的關鍵因素之一[2]。

    目前常用的植物外源基因遞送方式主要通過農桿菌轉化法、基因槍法以及花粉管通道等,轉化后可獲得理想的轉基因植株。但是目前常用的這幾種方法都存在各自的局限性,農桿菌轉化法是模仿或者利用天然的載體轉化系統(tǒng)形成,但是其受體物種有限,在單子葉植物中的轉化效果不理想,并且由于該基因轉化是通過T-DNA輸出、靶向和插入植物和基因組進行的[3],其所攜帶的外源分子僅限于DNA?;驑尫ㄊ且环N通用于植物遺傳轉化的物理方法,雖然可以克服農桿菌轉化法中所提到的宿主范圍和攜帶分子的限制,但該法轉化所需的外源分子量大并且對植物組織會造成比較嚴重的損傷[4]。借助植物花粉管來進行轉化的方法則會受到作物本身花期的限制。目前為止,植物轉基因技術仍然缺乏一種成熟的手段和媒介來將不同的體外分子在不借助外力的情況下靶向高效地輸送到植物物種中,并盡可能地降低對于目標植物組織的損傷程度。

    近年來,由于納米材料多種獨特的理化性質,納米技術在生物醫(yī)藥領域展現出了巨大的應用潛力[5]。例如,納米顆粒具有體積極小,良好的生物相容性以及可被多種官能團修飾等特性[6],可以作為遺傳轉化中的分子轉運載體,攜帶外界遺傳物質繞過生物體的多道屏障以解決遺傳物質的遞送問題,并提高植物基因工程的應用水平。目前納米顆粒已被驗證可于中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和人宮頸癌細胞(HeLa)等的亞細胞水平上進行定位和一系列的操作[7]。并且通過對材料進行一系列的修飾和功能化,可將不限于DNA、microRNA、siRNA的一系列生物分子以及各種蛋白有效運輸到生物細胞內發(fā)揮作用[8-10]。而相較于動物細胞中較為廣泛深入地研究,納米基因載體在植物中的研究由于納米顆粒的大小、表面所帶電荷以及表面屬性的不同及宿主本身所存在的物理屏障,使得植物體中的生物分子遞送相較于動物細胞轉化體系更具有挑戰(zhàn)性[11-13]。

    目前,已有文獻報道通過納米顆粒于外界基因結合通過直接轉化或者借助聚乙二醇(PEG)、磁場電場驅動、超聲波等外力的條件下將外源基因輸送到植物體中[14-15],在煙草種子及原生質體、擬南芥根、玉米以及水稻、小麥等組織或細胞中均成功實現了外源基因的表達[16-20]。在多種納米材料中,類水滑石納米顆粒因具有良好的生物相容性,并且制備相對簡單,同時基因的裝載量大,轉化效率高,相對穩(wěn)定,不易聚沉等特點為植物的遺傳轉化提供了一個新的思路和研究方向。2001年,Khan等通過借助類水滑石材料的理化特性,對多種藥物中的生物活性分子進行吸附證明藥物分子可以在體外釋放這一性質,為類水滑石材料作為生物分子的遞送載體奠定了基礎[21]。此外,Li等通過試驗證明類水滑石可以很好地對所負載的核酸分子起到保護作用,避開體內多種水解核酸酶的消化酶解作用,進而為外源基因高效遞送到細胞內發(fā)揮作用提供了可能[22]。而Mitter等借助類水滑石材料將雙鏈RNA分子運送到植物體內,對侵染作物的辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)同源基因沉默使得抗蟲效果得到顯著延長[23]。不少研究也表明,外源生物分子在無機械無外力輔助下也可通過納米材料跨越細胞壁以及質膜等壁壘來實現細胞內化。例如,Bao等利用類水滑石納米片作為植物跨膜運輸載體,成功將生物分子轉入完整植物細胞[24]。

    本研究通過高速剪切以及水浴攪拌加熱的方式,合成了粒徑為50 nm左右的層狀氫氧化物納米片,并研究其作為植物基因運載體的性能。通過編碼綠色熒光蛋白的pAN580質粒DNA來驗證其攜帶外源基因進入成熟植株體內的可能性,以期為納米基因載體在植物轉基因中的研究與應用提供新的材料和理論依據。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    所用的編碼綠色熒光蛋白(GFP)基因的質粒pAN580以及擬南芥、日本晴水稻 (Oryza sativa)、本氏煙草 (Nicotiana benthamiana)種子來自中國農業(yè)科學院生物技術研究所谷曉峰老師課題組,無內毒素質粒質粒提取純化試劑盒購自天根生化科技有限公司;Mg(NO3)2·6H2O、Al(NO3)3·9H2O、NaOH、CaCl2、LB培養(yǎng)基和DNA ladder購自于賽默飛世爾公司;FDA染料購自上海源葉生物科技有限公司;纖維素酶和離析酶購自日本Yakult公司,脫氧核糖核酸酶DNaseⅠ購自南京諾維贊生物科技股份有限公司,其他試劑均為國產分析純,購自北京索萊寶科技有限公司。

    1.2 試驗儀器

    高速冷凍離心機(Eppendorf公司,德國);瓊脂糖凝膠電泳水平電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD 公司,美國);搖床(Eppendorf Innova 42型,德國);冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM 6700F型,日本);透射電子顯微鏡(Hitachi公司,日本);傅里葉紅外光譜儀(Bruker Optics公司,Vertex70型,美國);X-射線衍射儀(Bruker公司,D8 Advance型,美國);馬爾文激光粒度儀(Malvern公司,Zetasizer Nano ZS型,英國);高速剪切機(HEVC公司,A25型,德國);超微量分光光度計(Thermo公司,Nanodrop 2000型,美國);激光共聚焦顯微鏡(Zeiss公司,LSM980型,美國)。

    1.3 類水滑石納米粒子的制備

    取1.6 g的NaOH溶于40 mL的去離子水中,配制溶液甲;稱取0.75 g的Al(NO3)3·9H2O與1.538 g的Mg(NO3)2·6H2O溶于10 mL去離子水中,使用渦旋混勻器混勻為溶液乙。在室溫下使用高速剪切機,開始剪切瞬間將配制的溶液乙加入溶液甲中,于B檔剪切 100 s,之后切換A檔繼續(xù)剪切20 s,得到納米材料原液。之后在室溫下將上述得到的材料原液在 8 000 r/min 轉速下離心10 min,棄上清液,用去離子水補充定容至初始體積后,將材料顆粒超聲分散均勻后以同樣條件離心,重復3次。然后將洗完補充至原體積的溶液置于80 ℃水浴鍋中加熱攪拌6 h,得到類水滑石納米粒子(layered double hydroxide nanosheets,簡稱LDHs),常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 材料表征

    取2 μL的制備好的LDHs材料溶液溶解于 4 mL 的去離子水中,均勻分散后,取4 μL分別滴加在晾干的硅片和銅網上,室溫下自然干燥后利用掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察該納米粒子的形態(tài)特征。

    首先將制備好的LDHs溶液置于 -80 ℃ 的超低溫冰箱冷凍24 h,利用冷凍干燥機將其制作為干粉備用,稱取2 mg的LDHs材料與30 mg的KBr粉末研磨混勻,均勻分散在磨具中壓片,在室溫下利用傅里葉變換紅外光譜儀對材料進行紅外光譜測試,其中掃描速度為32次/min,光譜范圍是4 000~400 cm-1。

    在電壓及電流分別為40 kV與40 mA的條件下,X-射線衍射儀在5°~50°范圍內掃描,對類水滑石納米顆粒的物相組成與晶型結構進行分析。

    將制備的LDHs材料使用去離子水稀釋50倍,然后取稀釋后的樣品1.3 mL加入比色皿中使用馬爾文激光粒度儀分析測試材料的粒度分布及zeta電位。

    1.5 質粒的擴增與純化

    將含有 pAN580 質粒的大腸桿菌 DH5α 于 LB 液體培養(yǎng)基(每升含10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl)中按照 1 ∶100 的體積比活化,在 37 ℃ 恒溫搖床中180 r/min培養(yǎng)過夜。按照質粒提取試劑盒說明書進行質粒提取,通過瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計鑒定質粒的大小、純度和濃度,將制備好的符合純度的質粒DNA保存在 -20 ℃ 中備用。

    1.6 LDHs與質粒DNA的結合及對DNA 的酶切保護

    為驗證納米材料對DNA的負載和保護能力,本試驗選用了5個梯度質量比的組合。先配制1 μg/μL的LDHs單分散納米粒子溶液,向上述納米粒子懸浮液中加入質粒溶液。按照一定質量比例(1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5)與1 μg/μL的質粒DNA結合,室溫放置30 min,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測納米粒子與DNA的結合情況。另外對LDHs-DNA復合物用DNaseⅠ于37 ℃消化10 min后,進行瓊脂糖凝膠電泳,驗證納米粒子對DNA的保護能力。

    1.7 煙草BY-2懸浮細胞的培養(yǎng)

    分別取10、25、50、100、200、500 μg的經 0.22 μm 濾膜過濾除菌后的LDHs納米粒子加入配制成功的BY-2細胞培養(yǎng)基中,其中該細胞培養(yǎng)基包含4.3 mg/mL的 (2,3-二油?;?丙基)-三甲胺、1 μg/mL的維生素B1、0.2 μg/mL的2,4-D、100 μg/mL 的Myo-inositol、0.255 g/L的KH2PO4以及3%質量比的蔗糖,均勻分散后于高壓滅菌鍋中121 ℃,滅菌20 min。然后取長勢均一的BY-2細胞在超凈工作臺中等量接種于已滅菌的各組培養(yǎng)基中,同樣的環(huán)境下在26 ℃、150 r/min恒溫搖床避光培養(yǎng)3~4 d。

    1.8 水稻葉鞘原生質體的制備

    在生長2周的日本晴水稻幼苗葉鞘中提取原生質體。即將水稻幼苗葉鞘切成 1 mm 的小段,放入酶解液中(每10 mL酶解液含 1.093 g甘露醇、0.1 g纖維素酶、0.08 g的半纖維素酶、0.1 g 的果膠酶、0.08 g 的離析酶和0.1 mol的MES溶液0.2 mol CaCl2溶液,0.4 mol KCl溶液)。然后置于28 ℃、80 r/min 的恒溫搖床中避光酶解4 h。其后將釋放出的原生質體用150目的篩子過濾到50 mL的離心管中,130 g離心5 min,并使用W5溶液洗滌2次,最后將純化的原生質體重新懸浮于W5溶液中待用。為保持細胞活力須現配現用。

    1.9 LDHs對植物的毒性試驗

    1.9.1 對水稻葉鞘原生質體的毒性試驗 取過濾除菌后的LDHs納米懸浮液經W5溶液離心洗滌3次備用,然后在超凈工作臺中將新鮮制備的水稻葉鞘原生質體與不同質量濃度梯度(0、25、50、100、300、500 μg/mL)的LDHs納米顆粒混合,之后置于試管中在26 ℃恒溫搖床上避光振蕩培養(yǎng),搖床轉速設置為40 r/min每組均含有2 mL W5 溶液,每個處理重復3次,每個重復觀察3個視野。

    1.9.2 對煙草BY-2細胞的毒性試驗

    取長勢均一的煙草BY-2細胞在超凈工作臺中加入到含有不同質量濃度(0、25、50、100、300、500 μg/mL)LDHs 納米顆粒的培養(yǎng)基中,并記錄初始質量。所有組均置于26 ℃恒溫搖床上130 r/min的轉速下進行避光培養(yǎng),并記錄細胞每日變化質量,每個處理重復3次。

    1.9.3 對擬南芥植株的毒性試驗

    用濃度為1.5%的NaClO溶液對擬南芥種子進行殺菌消毒 10 min,使用滅菌后的雙蒸水(ddH2O)洗滌次后接種于含有不同質量濃度(0、25、50、100、300、500 μg/mL)LDHs納米顆粒的固體培養(yǎng)基中,每個培養(yǎng)皿接種10粒飽滿的擬南芥種子。其中基礎的擬南芥植株培養(yǎng)基中包含2.2 mg/mL的 (2,3-二油?;?丙基)-三甲胺,3%質量比的蔗糖和10%的植物凝膠(植物組培級)。所有組均置于22 ℃,光照16 h,黑暗8 h的人工氣候箱中培養(yǎng),記錄種子萌發(fā)率,每個處理重復次。

    1.10 LDHs-DNA的完整植株轉化

    經筆者前期預試驗得知,LDHs納米片與pAN580質粒的最佳負載質量比為1 ∶3,按此比例取1 μg的質粒DNA與質量比為1 ∶3的LDHs納米顆?;旌希ㄟ^葉面無孔注射方式將此材料核酸復合物遞送到4周齡的本氏煙草葉片中,于24 ℃、光照 16 h、黑暗8 h的人工氣候箱中培養(yǎng),共培養(yǎng)4 d后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察處理葉片中綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況。每個處理重復3次,每個重復觀察3個視野。

    2 結果與分析

    2.1 LDHs的表征

    掃描電鏡(SEM)圖像顯示,經過高速剪切法所合成的材料是較為規(guī)則的六邊形層板結構,粒徑約為20~80 nm,且具與良好的分散性,符合類水滑石材料的基本特征;同時,透射電鏡(TEM)圖像中材料的層板結構明顯,進一步的驗證了上述結果。且相較于掃描電鏡圖像上納米片聚集無法分辨其單層結構來看,大部分的LDHs材料呈現出較為清晰透徹的圖像,這是因為筆者所在實驗室制備的LDHs材料較薄,具有典型的二級結構。如圖1-D、圖1-E所示,該材料的水合粒徑為(63.6±1.8) nm,zeta電位為(39.8±2.5) mV。同時其粒徑分布強度(PDI)為0.173(<0.300),表明制備的類水滑石材料分散性良好。

    2.2 LDHs的紅外光譜分析及XRD衍射圖譜分析

    對LDHs采用紅外光譜分析及X射線衍射分析確認類水滑石納米顆粒是否制備成功。從圖2-A可以看出,在3 498 cm-1處出現了氫氧化物層的特征寬帶,峰值在1 384 cm-1(水分子的彎曲振動)以及峰值在655 cm-1處的M—O—H拉伸振動均符合類水滑石的紅外光譜。從圖2-B可以看出,筆者所在實驗室制備的類水滑石具有明顯的片層結構。在2θ=11.256°、2θ=22.65°這2處出現了較強的衍射峰為α(003)、α(006)衍射峰,其中第1個峰的d值為 0.78 nm,接近報道的LDHs(0.81 nm),第2個峰的d值為0.39 nm[25]。根據謝樂公式,(003)衍射峰的半最大寬度(0.38°)對應c軸圖譜中的5.2 nm,所以每個LDHs納米粒子中具有6~7層輕氧化物。XRD的峰型規(guī)則,基本無雜峰出現,證明筆者所在實驗室制備的類水滑石納米材料具備規(guī)則的菱形(3R)模型。

    2.3 LDHs對DNA的負載和保護能力分析

    為了確定LDHs納米片對pAN580質粒DNA(1 μg/μL)的負載能力,采用了幾個梯度質量比的組合進行制備LDHs-DNA復合物,即DNA ∶LDHs質量比為1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5,同時設置2組對照分別是單質粒DNA組和單納米顆粒組,并進行瓊脂糖凝膠電泳。如圖 3-A所示,由于LDHs-DNA復合物的粒徑增大,因此不能通過凝膠孔隙而滯留在上樣孔中,在此處清晰可見有明顯熒光條帶。而隨著LDHs濃度的提高,所結合的質粒DNA增加,游離的DNA逐漸減少,上樣孔中的熒光強度逐漸增強直至全部質粒DNA被材料負載。結果表明LDHs可以有效負載DNA。當質粒DNA與LDHs的質量比為1 ∶3及以上時,LDHs-DNA復合物全部滯留在上樣孔中,泳道內對應質粒大小的位置未見任何條帶,證明此時DNA與 LDHs 的結合已經達到飽和,為pAN580質粒與LDHs納米顆粒的最佳結合負載比例。

    將LDHs與pAN580質粒DNA(1 μg/μL)按照質量比1 ∶3混合制備LDHs-DNA復合物,用 DnaseⅠ在37 ℃酶解消化10 min,同時以添加 DnaseⅠ的等量質粒DNA組作為對照,并進行瓊脂糖凝膠電泳試驗。圖3-B表明未添加LDHs的質粒DNA組被DnaseⅠ酶完全消化,而與LDHs-結合的質粒DNA組中條帶仍然保留在凝膠上樣孔中,而且相比未加核酸酶的組條帶亮度無明顯差異,說明LDHs納米基因載體能夠很好地保護 DNA 免受 DnaseⅠ的降解。

    2.4 LDHs-DNA納米基因載體復合物的表征

    粒度分布和Zeta電位分析是衡量納米基因載體性能的重要參數。zeta電位是反應納米顆粒在分散介質中的聚集和穩(wěn)定程度的重要表征之一,即其zeta電位的絕對值越大,納米顆粒之間的斥力就越大,這個納米顆粒的分散體系就越穩(wěn)定;反之,則體系越容易聚集甚至析出[26]。同時,表面帶有正電荷的納米材料可以與攜帶負電荷的核酸分子上的磷酸骨架通過靜電吸附的作用結合,形成納米載體-基因復合物。載體-基因復合物在細胞膜表面的富集,可提高基因運送到胞內表達的概率,這對于提高基因的表達量具有重要的意義[27]。如圖4所示,LDHs-DNA復合物的粒徑(后簡稱質粒)大于單材料(后簡稱材料)的粒徑;且質粒的zeta電位為(-33.1±0.5) mV,材料的zeta電位為(39.8±2.5) mV,在材料結合了帶負電的質粒DNA之后,LDHs-DNA復合物的zeta電位隨著材料結合比例的上升逐漸增加,表明LDHs能夠有效地負載質粒DNA,形成穩(wěn)定的載體-基因復合物。

    2.5 LDHs對植物的毒性試驗

    本試驗應用臺盼藍染色法及 FDA 染色法檢測不同濃度LDHs對煙草BY-2細胞及水稻葉鞘原生質體的細胞毒性,以確定其應用于基因遞送的可行性及使用濃度。圖5-A可以看出,其正常生長的BY-2細胞增質量在前10 d內呈指數型增長,在 10 d 時到達峰值之后逐漸下降,這符合煙草BY-2細胞的一般生長規(guī)律。從圖5-B可知,隨著培養(yǎng)基中材料濃度的增加細胞增質量逐漸減少,從 25 μg /mL 增加至100 μg /mL過程中細胞增質量減少并無明顯差異,然而當濃度繼續(xù)增加時,細胞增質量出現明顯降低并且在500 μg/mL時達到試驗組最低值。因此在煙草植物細胞中,LDHs的使用濃度應該不高于100 μg/mL。

    如圖6-A所示,與未處理的對照擬南芥種子相比,在1~2 d時,所有組別的萌發(fā)率均維持在60%~80%,無明顯差異,證明不同濃度的LDHs對擬南芥種子的萌發(fā)均無顯著毒性 即使是濃度高達100 μg/mL。如圖6-B所示,通過血球計數板計數細胞數估算水稻原生質體的活力,對照組的原生質體細胞保持較高的活力水平,隨著培養(yǎng)基中材料濃度的增加原生質體的個數逐漸減少,從25 μg/mL增加至100 μg/mL過程中細胞個數減少量并無顯著差異,然而當濃度繼續(xù)增加時,細胞個數出現明顯降低(圖6-B)。因此在水稻葉鞘原生質體中,LDHs的使用濃度應該不高于 100 μg/mL。綜上可知,LDHs在植物中的使用濃度應該保持在不高于100 μg/mL的水平。

    2.7 LDHs負載熒光染料進入植物細胞

    植物細胞壁是由纖維素、果膠與半纖維素構成,具有一定的排阻效應。細胞壁是防止外界分子進入植物細胞的天然屏障之一。為了探究LDHs的生物分子遞送能力,本試驗選取常用的活體染料異硫氰酸熒光素(FITC)來測試LDHs在擬南芥植株上的分子遞送能力。圖7-A可知,單熒光染料組中,大量的熒光染料分子富集到細胞外,在植物細胞外有明顯的綠色熒光和植物體葉綠素自發(fā)的紅色熒光未有重疊,證明單熒光染料很難進入到植物細胞中。由圖 7-B、圖7-C可以觀察到,擬南芥植株外有明顯的綠色熒光(與葉綠體自發(fā)紅光合并后呈現出黃色光),進一步驗證了LDHs納米材料可以快速有效地運載外部熒光染料分子進入植物細胞。

    2.8 LDHs/DNA煙草植株的轉化

    選取質量比為3 ∶1的LDHs/DNA的納米材料-基因復合物浸潤4周齡的本氏煙草植株葉片,培養(yǎng) 96 h 后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。試驗組中清晰可見有綠色熒光蛋白信號,而野生型對照組中的煙草葉片中無綠色熒光蛋白的表達。結果說明,LDHs能夠有效保護并負載質粒DNA通過植物細胞壁進入完整煙草植株葉片細胞內。用Image J圖像處理軟件進行熒光強度的定量測算,結果如圖8所示,LDHs納米載體負載pAN580質粒處理的試驗組的GFP平均熒光強度約為野生型對照組的56倍。證明LDHs可以有效負載外源質粒DNA并將其遞送入完整的成熟植物體中表達,為植物的遺傳轉化提供了新的思路。

    3 討論與結論

    納米材料通過其獨特的物理性質和化學性質,在現階段的研究中納米基因載體成為最熱門的非病毒基因遞送載體之一。在眾多納米材料中,類水滑石材料由于具有良好的生物相容性、制備簡單、基因裝載量大、轉化效率高等多種優(yōu)勢,尤其在生物分子的負載與保護方面表現出的突出優(yōu)勢而成為植物納米基因載體的優(yōu)勢材料之一。Desigaux等通過自組裝和合成及離子交換合成并得到了穩(wěn)定的類水滑石-DNA的復合物,通過體外轉染試驗證明該復合物可以進入HeLa細胞中并實現了表達[28]。本試驗采用高速剪切的方法合成了硝酸根插層的LDHs作為植物基因遞送載體,其表面攜帶有高密度的正電荷,因此可以通過靜電接枝的方法與表面帶有負電荷的外源質粒DNA進行有效裝載和吸附。

    而合適的基因運載體不僅要具有大的比表面積、有效負載外源基因,更重要的是要在細胞內保護所攜帶的基因免受多種酶的水解,才能提高基因的表達效率[29]。植物細胞內部環(huán)境復雜,含有多種水解酶,當基因運載體負載外源基因進入植物細胞后,如果載體材料不能有效地保護核酸分子,按照細胞的運輸機質,那么外源的核酸分子將會大部分會被細胞內的溶酶體的水解作用等機制水解消化,從而大大降低基因的表達效率。因此納米基因載體系統(tǒng)對于基因的保護作用是外源基因成功表達的必要條件之一。由本試驗的瓊脂糖凝膠電泳結果可知,LDHs可以有效負載并保護質粒DNA免受外界核酸酶等物質的水解消化作用,可以推測類水滑石材料表面具有大量的正電荷,在與核酸分子磷酸骨架上的負電荷通過靜電接枝而緊密結合的同時,導致DNA的構象發(fā)生改變,將外界的核酸酶等物質與核酸分子隔絕開來,可以保護其在植物細胞內免受各種水解消化作用,有效提高基因的表達效率。

    試驗中發(fā)現,合成的LDHs材料可以直接轉化外界核酸分子進入完整的植物細胞中,并檢測到了目標基因綠色熒光蛋白的表達。這說明,LDHs可以負載外源基因跨過植物細胞壁的屏障運輸進入完整的細胞中表達。證明筆者所在實驗室合成的類水滑石材料是一種優(yōu)越的植物納米基因載體,在轉基因植物的研究上展現出了一定的潛力,為植物穩(wěn)定遺傳與性狀改良提供了新的思路。

    參考文獻:

    [1]Abdallah N A,Prakash C S,McHughen A G. Genome editing for crop improvement:challenges and opportunities[J]. GM Crops Food,2015,6(4):183-205.

    [2]Azencott H R,Peter G F,Prausnitz M R. Influence of the cell wall on intracellular delivery to algal cells by electroporation and sonication[J]. Ultrasound in Medicine & Biology,2007,33(11):1805-1817.

    [3]Bevan M. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation[J]. Nucleic Acids Research,1984,12(22):8711-8721.

    [4]Liu G,Campbell B C,Godwin L D. Sorghum genetic transformation by particle bombardment[J]. Methods in Molecular Biology,2014,1099:219-234.

    [5]Kwak S Y,Lew T T S,Sweeney C J,et al. Chloroplast-selective gene delivery and expression in planta using chitosan-complexed single-walled carbon nanotube carriers[J]. Nature Nanotechnology,2019,14(5):447-455.

    [6]孔倩倩,李志輝,王 瓊,等. 納米基因載體在植物遺傳轉化中的應用[J]. 生物技術通報,2010,215(6):6-12.

    [7]Mout R,Ray M,Yesilbag Tonga G Y,et al. Direct cytosolic delivery of CRISPR/Cas9-ribonucleoprotein for efficient gene editing[J]. ACS Nano,2017,11(3):2452-2458.

    [8]Zhang H,Goh N S,Wang J W,et al. Nanoparticle cellular internalization is not required for RNA delivery to mature plant leaves[J]. Nature Nanotechnology,2022,17(2):197-205.

    [9]Schwartz S H,Hendrix B,Hoffer P H,et al. Carbon dots for efficient siRNA delivery and gene silencing in plants[J]. Plant Physiology,2020,184(2):647-657.

    [10]Swyer T W,Strom J,Larson D F. Nanoparticle oxygen delivery to the ischemic heart[J]. Perfusion,2014,29(6):539-543.

    [11]Zhang H,Demirer G S,Zhang H L,et al. DNA nanostructures coordinate gene silencing in mature plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2019,116(15):7543-7548.

    [12]Cunningham F J,Goh N S,Demirer G S,et al. Nanoparticle-mediated delivery towards advancing plant genetic engineering[J]. Trends Biotechnology,2018,36(9):882-897.

    [13]An Z S,Cao B,Zhang J Z,et al. Efficient transient expression of plasmid DNA using poly [2-(N,N-dimethylamino) ethyl methacrylate] in plant cells[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2022,10:805996.

    [14]Zhao X,Meng Z G,Wang Y,et al. Pollen magnetofection for genetic modification with magnetic nanoparticles as gene carriers[J]. Nature Plants,2017,3(12):956-964.

    [15]Chang F P,Kuang L Y,Huang C A,et al. A simple plant gene delivery system using mesoporous silica nanoparticles as carriers[J]. Journal of Materials Chemistry B,2013,1(39):5279-5287.

    [16]Demirer G S,Zhang H,Matos J L,et al. High aspect ratio nanomaterials enable delivery of functional genetic material without DNA integration in mature plants[J]. Nature Nanotechnology,2019,14(5):456-464.

    [17]Mitter N,Worrall E A,Robinson K E,et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses[J]. Nature Plants,2017,3:16207.

    [18]Bao W L,Wan Y L,Baluka F. Nanosheets for delivery of biomolecules into plant cells[J]. Trends in Plant Science,2017,22(6):445-447.

    [19]Martin-Ortigosa S,Peterson D J,Valenstein J S,et al. Mesoporous silica nanoparticle-mediated intracellular cre protein delivery for maize genome editing via loxP site excision[J]. Plant Physiology,2014,164(2):537-547.

    [20]Zolghadrnasab M,Mousavi A,Farmany A,et al. Ultrasound-mediated gene delivery into suspended plant cells using polyethyleneimine-coated mesoporous silica nanoparticles[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2021,73:105507.

    [21]Khan A I,Lei L,Norquist A J,et al. Intercalation and controlled release of pharmaceutically active compounds from a layered double hydroxide[J]. Chemical Communications,2001,37(22):2342-2343.

    [22]Li B,Gu Z,Kurniawan N,et al. Manganese-based layered double hydroxide nanoparticles as a T1-MRI contrast agent with ultrasensitive pH response and high relaxivity[J]. Advanced Materials,2017,29:1700373.

    [23]Mitter N,Worrall E A,Robinson K E,et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses[J]. Nature Plants,2017,3(2):16207.

    [24]Bao W L,Wang J Y,Wang Q,et al. Layered double hydroxide nanotransporter for molecule delivery to intact plant cells[J]. Scientific Reports,2016,6:26738.

    [25]Karami Z,Ganjali M R,Dehaghani M Z,et al. Kinetics of cross-linking reaction of epoxy resin with hydroxyapatite-functionalized layered double hydroxides[J]. Polymers,2020,12(5):1157.

    [26]Zhang Y,Yang M,Portney N G,et al. Zeta potential:a surface electrical characteristic to probe the interaction of nanoparticles with normal and cancer human breast epithelial cells[J]. Biomedical Microdevices,2008,10(2):321-328.

    [27]Singh R,Kostarelos K. Designer adenoviruses for nanomedicine and nanodiagnostics[J]. Trends in Biotechnology,2009,27(4):220-229.

    [28]Desigaux L,Belkacem M B,Richard P,et al. Self-assembly and characterization of layered double hydroxide/DNA hybrids[J]. Nano Letters,2006,6(2):199-204.

    [29]Rhaese S,von Briesen H,Rübsamen-Waigmann H,et al. Human serum albumin-polyethylenimine nanoparticles for gene delivery[J]. Journal of Controlled Release,2003,92(1/2):199-208.

    收稿日期:2022-12-08

    基金項目:國家重點研發(fā)計劃(編號:2017YFD0200900)。

    作者簡介:孫仲旭(1997—),女,河北衡水人,碩士研究生,主要從事納米生物學研究。E-mail:sunfox9@163.com。

    通信作者:曾章華,博士,研究員,主要從事納米生物學研究。E-mail:zengzhanghua@caas.cn。

    猜你喜歡
    納米材料
    武器中的納米材料
    學與玩(2022年8期)2022-10-31 02:41:56
    納米材料在水基鉆井液中的應用
    河南科技(2022年8期)2022-05-31 22:28:08
    納米材料在電化學免疫傳感器中的應用
    化工管理(2021年7期)2021-05-13 00:45:28
    二維納米材料在腐蝕防護中的應用研究進展
    可研可用 納米材料綻放光彩——納米材料分論壇側記
    探討產品設計中納米材料的運用
    MoS2納米材料的制備及其催化性能
    用于有機污染物處理的磁性納米材料
    納米材料改性聚酰亞胺研究進展
    中國塑料(2015年2期)2015-10-14 05:34:10
    生物模板法制備納米材料
    国产精品亚洲一级av第二区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久久久久久免费视频了| 国产视频一区二区在线看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 午夜福利在线观看吧| 久久久久国产一级毛片高清牌| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品中文字幕在线视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品国产乱码久久久久久男人| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品永久免费网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | av线在线观看网站| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品成人在线| 人人澡人人妻人| 久久国产精品影院| 日韩欧美三级三区| 欧美乱妇无乱码| 成人影院久久| 国产精品久久久久久精品古装| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品二区激情视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲成人手机| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 一本综合久久免费| 色老头精品视频在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久香蕉精品热| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲少妇的诱惑av| 国产xxxxx性猛交| av欧美777| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 国产精品二区激情视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | a级毛片在线看网站| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品九九99| 美女高潮到喷水免费观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品综合久久久久久久免费 | 成人av一区二区三区在线看| 99热只有精品国产| 日韩大码丰满熟妇| 精品少妇久久久久久888优播| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 香蕉久久夜色| 99re在线观看精品视频| a在线观看视频网站| 在线播放国产精品三级| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久天堂一区二区三区四区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美大码av| 亚洲欧美激情在线| 成年人免费黄色播放视频| 欧美色视频一区免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 热re99久久精品国产66热6| 欧美黄色片欧美黄色片| 在线观看免费午夜福利视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产xxxxx性猛交| 麻豆av在线久日| 久久九九热精品免费| 久久这里只有精品19| 国产精品久久电影中文字幕 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲精品在线观看二区| 一级a爱片免费观看的视频| 91成人精品电影| 国产真人三级小视频在线观看| 午夜91福利影院| 久久人人97超碰香蕉20202| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲成人国产一区在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 男女免费视频国产| av福利片在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 人人澡人人妻人| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美黄色淫秽网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久久精品免费免费高清| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 操美女的视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 一级毛片女人18水好多| 一二三四在线观看免费中文在| 一级a爱片免费观看的视频| 日韩欧美三级三区| 亚洲人成77777在线视频| 中文欧美无线码| 午夜老司机福利片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 操美女的视频在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 成人av一区二区三区在线看| 99re在线观看精品视频| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲av日韩在线播放| 欧美色视频一区免费| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产成人免费无遮挡视频| 99国产精品一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 国产精品久久视频播放| 美女福利国产在线| 麻豆成人av在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久国内视频| 久久九九热精品免费| 亚洲成国产人片在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 美国免费a级毛片| 亚洲三区欧美一区| 村上凉子中文字幕在线| 黄片小视频在线播放| 18禁美女被吸乳视频| 免费观看a级毛片全部| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 老司机亚洲免费影院| 男人舔女人的私密视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产av精品麻豆| a在线观看视频网站| 欧美久久黑人一区二区| 免费看a级黄色片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 美女福利国产在线| 久久天堂一区二区三区四区| 国产亚洲欧美98| 曰老女人黄片| 十八禁网站免费在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 三级毛片av免费| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 色在线成人网| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 看黄色毛片网站| 国产一区在线观看成人免费| 中文字幕人妻熟女乱码| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜视频精品福利| 69av精品久久久久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 亚洲性夜色夜夜综合| 99久久综合精品五月天人人| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 窝窝影院91人妻| 国产精品久久久av美女十八| 免费观看a级毛片全部| 高清欧美精品videossex| 1024香蕉在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产视频一区二区在线看| 女人久久www免费人成看片| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲 国产 在线| 久久99一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 99re在线观看精品视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 手机成人av网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产亚洲欧美98| 亚洲精品成人av观看孕妇| 岛国毛片在线播放| 男女高潮啪啪啪动态图| 涩涩av久久男人的天堂| 久9热在线精品视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 美女高潮到喷水免费观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 韩国精品一区二区三区| 黄片大片在线免费观看| 欧美性长视频在线观看| 五月开心婷婷网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 在线观看免费午夜福利视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 成在线人永久免费视频| 黄色怎么调成土黄色| 免费黄频网站在线观看国产| 日本一区二区免费在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 在线观看舔阴道视频| 亚洲视频免费观看视频| 成熟少妇高潮喷水视频| videos熟女内射| 大香蕉久久成人网| 老司机在亚洲福利影院| 大香蕉久久网| 黄片播放在线免费| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久久国产成人精品二区 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 午夜久久久在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩视频一区二区在线观看| 国产激情欧美一区二区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲精品乱久久久久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最近最新免费中文字幕在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 欧美性长视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 91老司机精品| 国产又爽黄色视频| 极品人妻少妇av视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲专区字幕在线| 黑丝袜美女国产一区| 久久人妻av系列| 啦啦啦免费观看视频1| 日本一区二区免费在线视频| 丝袜在线中文字幕| 一区二区三区精品91| 老司机亚洲免费影院| 视频区欧美日本亚洲| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲国产精品sss在线观看 | 在线播放国产精品三级| avwww免费| 精品无人区乱码1区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 男女床上黄色一级片免费看| av天堂久久9| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 三级毛片av免费| 精品国产亚洲在线| 一级,二级,三级黄色视频| 国产在视频线精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一进一出好大好爽视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 午夜福利视频在线观看免费| 99热网站在线观看| 国产在线一区二区三区精| 久久亚洲真实| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产xxxxx性猛交| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品午夜福利视频在线观看一区| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品久久久久久精品古装| 国产欧美日韩精品亚洲av| 人人妻人人澡人人看| 91在线观看av| 一级a爱片免费观看的视频| 又大又爽又粗| 午夜91福利影院| 精品一区二区三卡| 老鸭窝网址在线观看| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产97色在线日韩免费| 欧美精品亚洲一区二区| 精品亚洲成国产av| 天堂中文最新版在线下载| www.精华液| 激情视频va一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 校园春色视频在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日本一区二区免费在线视频| 18禁观看日本| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲一区中文字幕在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产男靠女视频免费网站| 另类亚洲欧美激情| 丰满的人妻完整版| 国产av又大| 日韩免费高清中文字幕av| 国产一卡二卡三卡精品| x7x7x7水蜜桃| 97人妻天天添夜夜摸| 捣出白浆h1v1| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品在线美女| 午夜福利视频在线观看免费| 久久久久久久久久久久大奶| av国产精品久久久久影院| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 精品福利观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲欧美激情综合另类| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲人成77777在线视频| 老司机福利观看| 不卡一级毛片| 国产亚洲一区二区精品| 黄色女人牲交| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲中文av在线| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲色图av天堂| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产99久久九九免费精品| 欧美性长视频在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 精品国产一区二区久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产三级黄色录像| 日韩大码丰满熟妇| 香蕉久久夜色| 宅男免费午夜| 国产精华一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 国产在线一区二区三区精| 亚洲五月天丁香| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 夫妻午夜视频| 久久精品国产a三级三级三级| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲av成人一区二区三| 99热只有精品国产| 色综合欧美亚洲国产小说| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩欧美一区视频在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜激情av网站| 国产精品.久久久| 成人三级做爰电影| 美女视频免费永久观看网站| 香蕉丝袜av| 91大片在线观看| 中文字幕制服av| 久久人妻熟女aⅴ| 一级片'在线观看视频| 国产成人欧美| 久久久国产精品麻豆| 国产精品永久免费网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 又大又爽又粗| 咕卡用的链子| 欧美黄色片欧美黄色片| 婷婷丁香在线五月| 日韩欧美一区视频在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲,欧美精品.| 最近最新中文字幕大全电影3 | 久久久久视频综合| 亚洲第一av免费看| 国产精品免费大片| 午夜福利一区二区在线看| 在线播放国产精品三级| 男女床上黄色一级片免费看| 美女福利国产在线| 中文字幕人妻丝袜制服| 成年版毛片免费区| 欧美日韩成人在线一区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 免费观看精品视频网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲成人手机| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲国产精品合色在线| 日韩大码丰满熟妇| 国产高清视频在线播放一区| 午夜老司机福利片| 亚洲国产精品sss在线观看 | 看片在线看免费视频| 亚洲av电影在线进入| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产成人av激情在线播放| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲国产欧美网| 欧美激情高清一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 久久精品91无色码中文字幕| 美女视频免费永久观看网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产亚洲精品一区二区www | 水蜜桃什么品种好| 午夜福利在线免费观看网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| aaaaa片日本免费| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲黑人精品在线| 美国免费a级毛片| 女性生殖器流出的白浆| 久久人妻av系列| 黄色女人牲交| 久久久国产一区二区| 午夜影院日韩av| 99热国产这里只有精品6| 不卡一级毛片| 日韩大码丰满熟妇| 欧美精品亚洲一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品av久久久久免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一级片免费观看大全| 亚洲成人免费电影在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 一级a爱片免费观看的视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品卡一卡二卡四卡免费| 狠狠狠狠99中文字幕| 9热在线视频观看99| 国产成人精品久久二区二区91| 91九色精品人成在线观看| 久久久国产精品麻豆| 国精品久久久久久国模美| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品人妻1区二区| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲中文av在线| 91老司机精品| 搡老岳熟女国产| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 成人av一区二区三区在线看| 欧美日韩视频精品一区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美成狂野欧美在线观看| 在线观看66精品国产| 天天操日日干夜夜撸| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产男女超爽视频在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 日韩欧美一区视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 亚洲第一av免费看| 久久草成人影院| 亚洲第一av免费看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲美女黄片视频| 国产97色在线日韩免费| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲欧美激情综合另类| 韩国精品一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 18禁观看日本| 99久久精品国产亚洲精品| 人妻 亚洲 视频| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲七黄色美女视频| 动漫黄色视频在线观看| 在线av久久热| 亚洲,欧美精品.| 久久精品国产综合久久久| 亚洲五月天丁香| 999久久久国产精品视频| 中出人妻视频一区二区| 男女床上黄色一级片免费看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 青草久久国产| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 欧美成狂野欧美在线观看| videos熟女内射| 91大片在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久这里只有精品19| 久久久精品免费免费高清| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产男女内射视频| 日韩三级视频一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 制服诱惑二区| 国产xxxxx性猛交| xxxhd国产人妻xxx| 69av精品久久久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 老司机福利观看| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99精品久久久久人妻精品| 国产淫语在线视频| 91精品国产国语对白视频| 老鸭窝网址在线观看| 嫩草影视91久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品1区2区在线观看. | 午夜视频精品福利| www.精华液| 90打野战视频偷拍视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 最新在线观看一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲国产精品合色在线| 99热国产这里只有精品6| 人妻 亚洲 视频| 亚洲午夜理论影院| 大香蕉久久成人网| 丁香欧美五月| 免费观看精品视频网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品欧美亚洲77777| 午夜福利在线免费观看网站| 中文亚洲av片在线观看爽 | 国产精品久久久人人做人人爽| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲人成电影观看| 亚洲美女黄片视频| 怎么达到女性高潮| av网站免费在线观看视频| 老熟女久久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 男女之事视频高清在线观看| 成人av一区二区三区在线看| svipshipincom国产片| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产99白浆流出| 高清av免费在线| 色94色欧美一区二区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 女人精品久久久久毛片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 午夜老司机福利片| a级片在线免费高清观看视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| av视频免费观看在线观看| 十八禁人妻一区二区| 热re99久久精品国产66热6| 久久狼人影院| 日日夜夜操网爽| 天堂中文最新版在线下载| 在线观看www视频免费| 精品无人区乱码1区二区| 午夜福利乱码中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品偷伦视频观看了| 成人国产一区最新在线观看| 午夜久久久在线观看| 黄色视频不卡| 老司机亚洲免费影院| 成人手机av| 在线视频色国产色| 久久国产精品人妻蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 麻豆成人av在线观看| 人人妻人人澡人人看| 美女午夜性视频免费| 黄片播放在线免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产主播在线观看一区二区| 久久久国产一区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久人妻熟女aⅴ| 精品高清国产在线一区| 亚洲av电影在线进入| 黄色成人免费大全|