洋蔥黃色條紋突變體葉綠體基因組測序及嵌合體驗(yàn)證

惠林沖　陳微　張仕林　李威亞　何林玉　楊海峰　潘美紅

摘要：為鑒定洋蔥黃條紋突變體中葉綠體基因組基因突變，利用洋蔥黃色條紋突變體進(jìn)行黃色組織葉綠體基因組測序及差異位點(diǎn)驗(yàn)證分析，對突變體種子果夾表型特征與出苗后表型進(jìn)行對比分析，并利用ABP1-1、KMOX-1和MYB-2分子標(biāo)記對4份黃條紋黃化程度在50%以上的植株綠色和黃色組織DNA進(jìn)行分子標(biāo)記多態(tài)性檢測。結(jié)果表明，測序獲得突變體葉綠體基因組153 585 bp，與洋蔥葉綠體參考基因組比對篩選出5個差異位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增及測序分析發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組堿基的突變、插入并不導(dǎo)致黃條紋突變；突變果夾黃化程度與母株上種子出苗后黃化程度成正比，果夾越黃，種子出苗葉片越黃，3個分子標(biāo)記對同一株黃色和綠色組織進(jìn)行PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)綠色與黃色組織擴(kuò)增條帶不一致。綜上所述，洋蔥葉片黃色條紋突變是一種嵌合體突變。

關(guān)鍵詞：洋蔥；黃條紋；葉綠體；嵌合體；基因組測序

中圖分類號：S633.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）20-0043-06

綠色植物葉片容易突變成黃色條紋狀，可以在園藝花卉中得到應(yīng)用。不同植物的突變機(jī)制各不相同，有核基因突變［1-2］、核質(zhì)基因共同作用［3］及母系遺傳突變類型［4-5］。洋蔥黃條紋突變屬于母系遺傳，Tatebe研究表明，洋蔥黃色條紋正反雜交遺傳分析屬于母系遺傳［6］；楊海峰等研究發(fā)現(xiàn)，研究此突變材料自交無固定分離比例，且黃色條紋不退化，超微結(jié)構(gòu)觀察到類囊體膜結(jié)構(gòu)受損［7］，以上均是從生理形態(tài)特征進(jìn)行研究，未從分子角度研究黃色條紋突變機(jī)制。祝利霞用2個群體對甘藍(lán)型油菜黃化突變體基因精細(xì)定位，結(jié)果表明，Bnac.HO1基因在突變體中缺失了C基因組上的同源拷貝［8］。芥菜型油菜黃化突變體L638-y葉片葉綠素合成代謝受阻，受阻位點(diǎn)在CoprogenⅢ到ProtoⅨ的反應(yīng)步驟，該突變體可能是一種新類型的缺綠體突變體［9］。孫小秋等通過甲基磺酸乙脂（EMS）誘變獲得1對隱性核基因控制遺傳穩(wěn)定的水稻黃綠葉突變體ygl98，基因組序列分析發(fā)現(xiàn)突變體在編碼鎂離子螯合酶ChlD 亞基的OsChlD基因編碼區(qū)第1 522堿基處，堿基G突變?yōu)閴A基A，造成編碼蛋白序列丙氨酸突變成蘇氨酸［10］。Li等對銀杏葉片黃條紋突變體轉(zhuǎn)錄組測序分析及實(shí)時定量聚合酶反應(yīng)（RT-qPCR）分析發(fā)現(xiàn)PPO和NYC/NOL基因表達(dá)影響葉綠素的生物合成，并促進(jìn)葉綠素b降解為葉綠素a，而上調(diào)的基因Z-ISO、ZDS和LCYE增強(qiáng)了類胡蘿卜素的積累。因此，類胡蘿卜素與葉綠素比例的變化是形成銀杏葉片黃色條紋突變的主要因素，并未定位到基因突變位點(diǎn)［11］。

洋蔥黃色條紋突變具有母系遺傳特征，而葉綠體基因?yàn)槟赶颠z傳，相對核基因組保守性較高［12］。洋蔥葉綠體基因組已公布，包括正?？捎?種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（CMS-S和CMS-T）［13］，為了鑒定洋蔥黃條紋突變體是否是葉綠體基因組基因發(fā)生突變，擬對葉綠體基因組重測序，對差異位點(diǎn)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，在前期已對洋蔥黃條紋突變體形態(tài)特征、超顯微結(jié)構(gòu)等進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，利用分子標(biāo)記對同一株洋蔥黃色和綠色組織進(jìn)行DNA擴(kuò)增，開展葉綠體突變基因研究，以期為研究洋蔥葉綠體光合機(jī)制及遺傳發(fā)育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥黃條紋突變體收集于江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛試驗(yàn)基地，為中日照類型洋蔥，根據(jù)黃化程度不同選取不同類型洋蔥，HT01～HT04、HT06～H19共18個黃條紋突變材料（因HT05苗期黃化程度100%，苗木未能長到取樣時期），N20、N21為正常洋蔥植株，HT13黃色組織用于葉綠體基因組測序（圖1），材料特征見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 洋蔥葉綠體基因組測序及差異序列驗(yàn)證

采用洋蔥HT13突變材料全黃組織，提取DNA后送上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序，超聲波將DNA打斷進(jìn)行純化構(gòu)建測序文庫，質(zhì)檢合格后采用Illumina HiSeqTM平臺進(jìn)行測序，以NCBI數(shù)據(jù)庫中洋蔥葉綠體KM088013.1為參考基因組，進(jìn)行突變體葉綠體基因組de novo拼接和遺傳變異檢測。將基因組比對后，對差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)6對引物（表2），送蘇州金唯智生物科技有限公司合成。提取18份黃條紋突變材料黃色組織和2份正常洋蔥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增試劑購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，反應(yīng)體系為50 μL，包括4 μL DNA，5 μL 10×PCR 緩沖液，引物1和引物2分別 3 μL，4 μL dNTPs（10 mmol/L），0.5 μL TaqM和30.5 μL ddH2O，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min［14］，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，拼接結(jié)果使用DNAman軟件進(jìn)行序列比對分析。

1.2.2 洋蔥黃條紋嵌合體突變驗(yàn)證

將洋蔥黃條紋突變體開花期單株自交，種子受精灌漿后（未開裂），對種子外殼出現(xiàn)的黃色突變進(jìn)行標(biāo)記，收獲的種子進(jìn)行分類（全黃株、黃綠相間株、全綠株），秋季9月中旬播種和第2年4月對植株進(jìn)行表型統(tǒng)計(jì)，并取4株（HT01、HT11、HT13和HT19）黃條紋黃化程度在50%以上正常生長的洋蔥球葉片，分別提取黃色組織和綠色組織的DNA，利用筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的3個CDDP多態(tài)性豐富的分子標(biāo)記ABP1-1、KMOX-1和MYB-2［15］（相關(guān)數(shù)據(jù)未發(fā)表）。引物見表2，PCR擴(kuò)增條件同上述，PCR產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電壓為100 V，電泳2.5 h，硝酸銀染色，采用相機(jī)在膠片燈上拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥黃色條紋突變體葉綠體基因組測序分析

以洋蔥（Allium cepa L.）的葉綠體基因組序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/744671124/）作為參考，該參考基因組大小為153 529 bp，測序獲得洋蔥黃條紋突變體黃色組織葉綠體基因組大小153 585 bp，比已公布的正?？捎笫[多56 bp（圖2）。數(shù)據(jù)基于GATK校正比對結(jié)果，利用GATK軟件進(jìn)行SNP、small indel檢測，并過濾掉測序深度和比對質(zhì)量值較低的位點(diǎn)，得到高可信度的20個SNP和5個small indel數(shù)據(jù)集，采用Annovar程序結(jié)合洋蔥葉綠體基因組的gff3基因注釋信息對得到的SNP和small indel進(jìn)行注釋（表3）。

利用DNAman軟件對已公布的洋蔥可育株N（GenBank數(shù)據(jù)中登錄號：KM088013，下同）、CMS-S（KM088014）、CMS-T（KM088015）、可育株N（KF728080.1）和CMS-S（KF728079.1）進(jìn)行比對，排除洋蔥不育系CMS-S和CMS-T特有的突變、插入和缺失序列外，篩選出5個差異位點(diǎn)，包括堿基突變、插入和缺失（表4）。

2.2 洋蔥黃條紋突變體葉綠體基因組差異位點(diǎn)PCR驗(yàn)證

對18份突變材料黃色組織和2份正常洋蔥為對照的DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其中包括測序用的材料HT13，因擴(kuò)增條帶差別較小 在瓊脂糖凝膠電泳圖上不能完全區(qū)分條帶的差異。盡管引物3擴(kuò)增中有54 bp堿基的插入，但不能被清楚地區(qū)分開（圖3）。對所有的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收測序，DNAman軟件進(jìn)行比對，HT13材料葉綠體DNA全長測序中差異位點(diǎn)與PCR驗(yàn)證完全一致，說明黃條紋突變體基因組序列可靠。引物2中GAA突變TTC，檢測發(fā)現(xiàn)只有HT13、N20和N21這3份材料為TTC，其他17份突變材料均為GAA；引物3擴(kuò)增中除了HT04、HT06、HT08、HT14外，其他均有插入TTCTATTCTATATGTACATCTACTATATACATATTGTAAT TTTATCTAAATTTT片段，且2份綠色正常組織N20和N21均有插入片段（圖4）；同樣引物1、4、5中的插入或突變在黃條紋突變體和正常植株中均有出現(xiàn)，與黃條紋突變和黃化程度均無關(guān)系，洋蔥黃條紋突變體與葉綠體基因組序列堿基突變無關(guān)系。

2.3 洋蔥黃條紋突變體嵌合體驗(yàn)證

對洋蔥黃條紋突變體的種子果夾進(jìn)行觀察分類，分為全黃、半黃和全綠色3種類型，因種子外表皮是黑色，在未成熟果夾上做好標(biāo)記，分類收集種子（圖5）。播種后觀察苗期的表型：無固定分離比，外殼為全黃色，對應(yīng)種子出苗后也是全黃株；外殼綠色對應(yīng)種子苗期和生長期均為全綠色植株；黃綠相間的在苗期及生長期同樣表現(xiàn)出黃綠色相間條紋狀，黃化程度與母株上種子出苗后黃化程度成正比，具有嵌合體母系遺傳特征。

對4株（HT01、HT11、HT13和HT19）黃條紋黃化程度在50%以上的植株綠色和黃色組織DNA進(jìn)行分子標(biāo)記多態(tài)性檢測，3個標(biāo)記（ABP1-1、KMOX-1和MYB-2）結(jié)果顯示同一株綠色部分和黃色部分多態(tài)性存在差異，3個標(biāo)記均顯示4株黃綠2個部分DNA存在差異（圖6），表明洋蔥黃條紋突變體是一種嵌合體突變類型。

3 討論與結(jié)論

洋蔥黃色條紋突變屬于母系遺傳，研究發(fā)現(xiàn)黃色組織中仍然具有葉綠素，但含量減少，葉綠素合成受阻導(dǎo)致黃色條紋，葉色變異主要由核基因控制，也可由葉綠體基因或核質(zhì)互作控制［16］，葉綠體中含有大量的蛋白酶，以促進(jìn)蛋白穩(wěn)態(tài)和發(fā)育，擬南芥中EVR3編碼葉綠體金屬蛋白酶調(diào)控葉片斑紋的形成［17］。白茶新葉發(fā)現(xiàn)黃葉突變體，對黃綠2個部分轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，黃色葉片著色主要受色素代謝的影響，包括葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮的色素代謝［18］，百合黃色幼苗致死突變體lrysl1轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)葉綠體發(fā)育異常且相關(guān)的基因下調(diào)表達(dá)［19］。在葉片黃化突變基因定位研究中，黃瓜幼葉黃色突變體C777精細(xì)定位到y(tǒng)yl-1基因上SNP中G變成A，形成終止密碼子導(dǎo)致黃葉的出現(xiàn)［20］。而水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體albg是Os03g0597200基因從ATG開始第1 387位發(fā)生了1個堿基G的插入，導(dǎo)致葉色在苗期出現(xiàn)突變［21］。本研究中研究思路考慮轉(zhuǎn)錄組測序和突變基因的定位，可能是洋蔥葉綠體基因發(fā)生突變引起洋蔥黃條紋突變體。對洋蔥黃條紋黃色組織進(jìn)行葉綠體基因組測序，獲得153 585 bp，與洋蔥已公布的參考基因組KM088013進(jìn)行比對，盡管分析發(fā)現(xiàn)有20個SNP和5個插入或缺失，但與洋蔥其他幾個不育系類型進(jìn)行DNAman軟件序列分析，在不育系中有同樣在黃條紋中出現(xiàn)的堿基，并不是黃條紋葉綠體基因所特有的，篩選出5個差異位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物PCR驗(yàn)證，差異位點(diǎn)在黃條紋中和正常洋蔥中均存在突變和插入或缺失，并不是葉綠體基因組堿基的變化導(dǎo)致洋蔥出現(xiàn)黃條紋葉片。

田間發(fā)現(xiàn)具有典型黃條紋突變體的洋蔥單株人工自交后，果夾也具有黃化表型特征，分為全黃、黃綠相間和全綠色3種類型果夾，但種子無差別均為黑色，并做標(biāo)記分類播種后，洋蔥苗黃條紋的表型特征與母株上的果夾黃色區(qū)域表型特征對應(yīng)。與植物嵌合體有一定的聯(lián)系，基因突變也能產(chǎn)生嵌合體，典型特征是植物的莖尖分生組織由2種或2種以上遺傳型不同的細(xì)胞組成，共同發(fā)育成完整植株［22］。SSR、SNP/InDel作為檢測嵌合體已在植物中應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)橙子品種Zhiwenzhou是一種嵌合體［23］，葡萄開發(fā)新品種比較困難，Preiner等利用葡萄分生組織嵌合體2個新品種（Cabernet sauvignon和Babic），并利用SSR標(biāo)記進(jìn)行鑒定［24］。Zhou等對2種嵌合體進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）分析發(fā)現(xiàn)嵌合體不僅具有2個親本的特異性條帶，還分別產(chǎn)生了各自特有的新條帶，說明嵌合體在DNA可能存在著互作［25］。而王彩霞等利用69條ISSR引物對文心蘭黃化突變體和正常植株進(jìn)行遺傳變化分析發(fā)現(xiàn)，其中67條引物在黃化突變體和正常植株之間未呈現(xiàn)多態(tài)性，引物UBC827和UBC897對黃化突變體和正常植株的擴(kuò)增產(chǎn)物具有差異，分別多擴(kuò)增出1個約為600 bp和200 bp的條帶［26］。本研究利用前期在洋蔥中篩選CDDP分子標(biāo)記多態(tài)性豐富的ABP1-1、KMOX-1和MYB-2等3個標(biāo)記，對洋蔥黃條紋突變體的黃色組織和綠色組織進(jìn)行嵌合體驗(yàn)證，每個標(biāo)記在4株不同洋蔥突變株中均有特異條帶，同一株黃綠2個部分DNA有差異，說明洋蔥黃條紋突變體是嵌合體突變。

一般嵌合體存在長期保存的問題，尤其不適合低溫存儲，容易導(dǎo)致芽變，Kulus等利用包囊脫水技術(shù)冷凍保存周緣嵌合體菊花防止芽變［27］。而洋蔥黃條紋是通過種子進(jìn)行穩(wěn)定的母系遺傳，能夠很好的保存，是研究光合作用機(jī)制和形態(tài)學(xué)標(biāo)記的重要材料。

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收稿日期：2022-11-30

基金項(xiàng)目：江蘇省連云港市財(cái)政專項(xiàng)（編號：QNJJ2206）；連云港市第六期“521工程”科研項(xiàng)目（編號：LYG06521202134） 。

作者簡介：惠林沖（1988—），男，江蘇灌南人，碩士，助理研究員，從事蔬菜育種、栽培及分子生物學(xué)研究。E-mail：huilinchong@yeah.net。

通信作者：潘美紅，碩士，副研究員，從事蔬菜育種、栽培及利用研究。E-mail：7991454@163.com。