牙齦卟啉單胞菌對(duì)消化道腫瘤作用機(jī)制研究

占云梅，黃楊文，張桂生，劉新穎，黃小明，孟 凡

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000）

消化道腫瘤包括口腔癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等，嚴(yán)重威脅民眾的生命健康。據(jù)國家癌癥中心最新公布的數(shù)據(jù)顯示，我國消化道腫瘤依然呈現(xiàn)出高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn)，在部分腫瘤類型中甚至高于世界平均水平［1］，尋找更為切實(shí)可控的防治靶點(diǎn)是臨床科研不容忽視的重要命題。長期與人體共生的微生物，在消化道的不同菌落區(qū)域中以超過100 萬億的龐大數(shù)量寄生［2-3］，并以其性質(zhì)和數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化影響著機(jī)體的健康狀況。高通量基因測(cè)序（16S ribosomal RNA，16S rRNA）的發(fā)展，向人們證實(shí)了消化道微生物與特定疾病間的因果關(guān)系［3-6］。機(jī)制上來說，消化道黏膜作為機(jī)體先天性免疫的屏障之一，特定菌群的局部定植，可通過病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)腸上皮和相關(guān)免疫細(xì)胞表達(dá)包括Toll樣受體（Toll-like receptors, TLR）、NOD 樣受體（NOD-like receptors, NLR）等在內(nèi)的模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors, PRR），促發(fā)一系列炎癥級(jí)聯(lián)信號(hào)，引發(fā)異常增殖導(dǎo)致腫瘤［7］。

口腔是消化道的門戶，其微生物組分種類繁多、分布密集［8］?，F(xiàn)已證實(shí)，牙齦卟啉單胞菌是嚴(yán)重牙周炎的病原體［9］，且與口腔以外的多種疾病關(guān)系密切［10］，近期的多項(xiàng)臨床和動(dòng)物性研究更是指向其與消化系統(tǒng)腫瘤之間的直接因果關(guān)聯(lián)［11-12］。與此同時(shí)，GAO S G等［13］發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌的血清抗體對(duì)早期食管鱗癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）進(jìn)行診斷的敏感性、特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物（SCCA、CEA、CA19-9 等）；CHEN M F等［12］也證實(shí)，牙齦卟啉單胞菌與晚期ESCC 的TNM分期和預(yù)后不良相關(guān)，在小鼠腫瘤誘導(dǎo)模型中該菌可促進(jìn)異種移植瘤的發(fā)生和進(jìn)展。鑒于牙齦卟啉單胞菌在消化道腫瘤診斷中具有重要參考價(jià)值，同時(shí)也是腫瘤相關(guān)的潛在獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，充分了解其結(jié)構(gòu)功能及致病機(jī)制，或可為臨床提供新的診療視角?；诖耍疚木推渲饕玖σ蜃蛹跋嚓P(guān)致病機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 牙齦卟啉單胞菌主要毒力因子的構(gòu)成和作用

牙齦卟啉單胞菌是革蘭氏陰性厭氧菌，其主要毒力因子包含菌毛、脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）、牙齦蛋白酶、血凝素（Hemagglutinin, HA）等，可通過分泌外膜囊泡（Outer membrane vesicles, OM）的形式將LPS和牙齦蛋白酶等傳遞到遠(yuǎn)處作用而擴(kuò)大影響范圍［14］，侵襲包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的宿主細(xì)胞［15］。

1.1 牙齦卟啉單胞菌菌毛促細(xì)菌黏附和誘導(dǎo)早期炎癥菌毛是細(xì)菌外膜的延伸，可加強(qiáng)細(xì)菌與宿主之間的黏附。牙齦卟啉單胞菌存在2 種類型的菌毛，即長菌毛和小菌毛。編碼菌毛蛋白（41 kDa）的長菌毛基因FimA有6 種變體，分別為FimAⅠ型～Ⅴ型，以及Ⅰb型，編碼小菌毛蛋白（fa蛋白，67 kDa）的則為mfa1基因，雖然2 種菌毛蛋白都有助于牙齦卟啉單胞菌的黏附入侵［16］，但有研究表明，F(xiàn)imA缺陷菌株沒有典型的菌毛［16］，菌毛的致病性只與FimA基因型關(guān)聯(lián)密切，而與mfa1基因型無關(guān)［17-18］。其主要致病機(jī)制可歸納如圖1 所示：長菌毛通過結(jié)合整合素蛋白α5β1 與TLR2 的相關(guān)受體-趨化因子受體4 相互作用，抑制TLR2 介導(dǎo)的NF-κB 促炎通路，實(shí)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲和抗清除功能［19］；通過結(jié)合受體CD14 激活TLR2 和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號(hào)通路，誘發(fā)補(bǔ)體受體3（CR3）活化，并與之進(jìn)一步相互作用下調(diào)活性白細(xì)胞介素12（IL-12 p70，一種與細(xì)菌清除有關(guān)的細(xì)胞因子）［9］。此外，CAI J等［20］通過基因克隆構(gòu)建質(zhì)粒的方法證明了FimA 融合蛋白還可通過TLR4 信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，殺傷宿主細(xì)胞。值得注意的是，牙齦卟啉單胞菌菌毛的發(fā)生機(jī)制涉及前體亞單位蛋白的水解和重新聚合，聚合前的水解處理需要由牙齦蛋白酶參與［19］，而聚合可以被菌毛蛋白保守C端相應(yīng)的肽基抑制劑阻斷［21］。

1.2 牙齦卟啉單胞菌脂多糖維持自身營養(yǎng)并促炎癥發(fā)展脂多糖（LPS）是牙齦卟啉單胞菌外膜囊泡的外層組分，與細(xì)菌侵襲力密切相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)中可促進(jìn)多種細(xì)胞體系的增殖和遷移［22-23］。牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生2 種LPS：常規(guī)的O-LPS 和陰離子O-LPS（A-LPS），A-LPS一方面是蛋白酶等毒力效應(yīng)物質(zhì)的載體［19］，另一方面可促進(jìn)μ-氧基雙血紅素在細(xì)菌表面沉積［24］。眾所周知，牙齦卟啉單胞菌是血紅素依賴型細(xì)菌，需要利用外源性鐵和原卟啉以維持自身的生長繁殖及存活［25］。它的主要血紅素來源是血紅蛋白［26］，通過A-LPS 可實(shí)現(xiàn)將由血紅蛋白轉(zhuǎn)化的μ-氧基雙血紅素作為營養(yǎng)儲(chǔ)存下來［24］，而非酶糖化的血紅蛋白則可使血紅素獲取更容易［26］。致病性方面，牙齦卟啉單胞菌LPS 可通過與先天免疫Toll樣受體中的TLR1 和TLR4 相互作用，促進(jìn)細(xì)胞因子如IL-6、IL-8 和TNF-α 的分泌，進(jìn)而發(fā)揮促炎效應(yīng)［27］。LIU J等［28］從氧化應(yīng)激的角度，展示牙齦卟啉單胞菌的LPS 可通過誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB活化，促進(jìn)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）釋放介導(dǎo)炎癥，且p53作為炎癥介質(zhì)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外，DIOMEDE F 等［29］用牙齦卟啉單胞菌的LPS 作用于人的牙周膜干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞中的DNA 甲基化酶DNM1 顯著下降，同時(shí)組蛋白乙酰化酶p300 以及NF-κB 水平顯著提升，說明牙齦卟啉單胞菌的LPS還可通過調(diào)節(jié)表觀遺傳相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)炎癥誘導(dǎo)。

1.3 牙齦卟啉單胞菌半胱氨酸蛋白酶水解多種宿主蛋白促腫瘤侵襲牙齦卟啉單胞菌能產(chǎn)生2種半胱氨酸蛋白酶（Gingipains）：精氨酸特異性牙齦蛋白酶（RgpA、RgpB）和賴氨酸特異性牙齦蛋白酶（Kgp）。其中RgpA 和Kgp 擁有相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即都包含催化結(jié)構(gòu)域和血凝素（HA）結(jié)構(gòu)域，而RgpB只有催化結(jié)構(gòu)域［27］。Gingipains 參與細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，另外作為一種蛋白水解酶，還能降解包括宿主表面膜蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白、黏附蛋白、信號(hào)蛋白及補(bǔ)體、受體、細(xì)胞因子在內(nèi)的多種蛋白成分，作用非常廣泛。在獲取自身營養(yǎng)素的同時(shí)改變了免疫微環(huán)境，對(duì)宿主細(xì)胞造成損傷，是重要的毒力因子。有研究［27］表明，Gingipains能與蛋白酶活化受體（PAR）中的PAR2 或PAR4 結(jié)合，磷酸化后激活NF-κB、ERK1/2-Ets1、p38/HSP27 等通路，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）的前體pro-MMP9、pro-MMP9在經(jīng)進(jìn)一步切割水解后可形成活化的MMP9，并通過正反饋活化pro-MMP9，形成循環(huán)放大效應(yīng)。MMP9 因可降解宿主細(xì)胞基底膜及胞外基質(zhì)，通常認(rèn)為與侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，Gingipains 水解過程還可通過非經(jīng)典途徑激活β-連環(huán)蛋白，這被認(rèn)為是牙齦卟啉單胞菌促瘤的另一種潛在機(jī)制［30］。

1.4 牙齦卟啉單胞菌血凝素協(xié)同Gingipains 獲取自身生長營養(yǎng)素牙齦卟啉單胞菌通過獲取外源性血紅素滿足自身營養(yǎng)需求，這個(gè)過程是由Gingipains和血凝素共同完成的［31］。具體表現(xiàn)為，血凝素與宿主紅細(xì)胞表面受體結(jié)合，Rgp 將氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，后者進(jìn)一步被Kgp水解，釋放出血紅素，并最終以μ-氧基雙血紅素的形式保留在細(xì)胞表面［24］。通過這種協(xié)同分工，牙齦卟啉單胞菌實(shí)現(xiàn)對(duì)營養(yǎng)素的獲取。

1.5 牙齦卟啉單胞菌肽基精氨酸脫氨酶瓜氨酸化蛋白質(zhì)擴(kuò)大炎癥程度和范圍牙齦卟啉單胞菌還能產(chǎn)生肽基精氨酸脫氨酶（Peptidylarginine deiminases, PAD），這是目前能產(chǎn)生這種酶的唯一病原體。通過去除蛋白質(zhì)和多肽中的精氨酸殘基，使之轉(zhuǎn)化成瓜氨酸，在改變?cè)锌臻g構(gòu)象的基礎(chǔ)上，對(duì)宿主和自身蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，并最終解除宿主炎癥信號(hào)的控制。宿主體內(nèi)有5種鈣依賴性PAD可實(shí)現(xiàn)這種瓜氨酸化，分別為PAD1、2、3、4/5、6，它們通常均與癌癥相關(guān)［30］。有學(xué)者認(rèn)為，PAD 通過分泌的方式傳播到血液中，可使身體的不同部位產(chǎn)生瓜氨酸，最終引發(fā)多種疾病［32］。ZHAO X D 等［33］在實(shí)驗(yàn)中敲除小鼠牙齦卟啉單胞菌脫氨酶（Porphyromonas gingivalis peptidylarginine deiminase, PPAD）基因，通過流式細(xì)胞術(shù)和ELISA，發(fā)現(xiàn)PPAD 可顯著增加輔助性T 細(xì)胞Th17 細(xì)胞的數(shù)量，但減少調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞Treg 的數(shù)量；在進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)中他們得到了相同的結(jié)果，說明PPAD 也可對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用。

2 牙齦卟啉單胞菌誘發(fā)消化道腫瘤產(chǎn)生的機(jī)制

2.1 牙齦卟啉單胞菌分泌抗凋亡磷酸激酶并調(diào)控線粒體凋亡通路抑制宿主細(xì)胞凋亡LEE J 等［34］通過構(gòu)建牙齦卟啉單胞菌NDK 缺陷突變株進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，首次證明了牙齦卟啉單胞菌分泌的核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase, NDK）可磷酸化熱休克蛋白HSP27，參與抑制牙齦上皮細(xì)胞（Gingival epithelial cells, GEC）的凋亡。在這之前，曾有研究［35］提示，三磷酸腺苷（ATP）與嘌呤受體P2X7 結(jié)合可使細(xì)胞凋亡，而NDK 可通過參與分解ATP 來抑制這一凋亡路徑?？傊?，牙齦卟啉單胞菌NDK 是重要的抗凋亡蛋白。與此功能類似的是，牙齦卟啉單胞菌還調(diào)控2 條線粒體凋亡通路，分別是PI3K/Akt 和JAK/STAT 通路［36-37］。它們產(chǎn)生的活化蛋白激酶B（Akt）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（STAT）可使促凋亡蛋白Bad減少，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl 的比例升高，最終發(fā)揮抗凋亡作用。此外，Bcl-2 與Akt 激發(fā)的NF-κB 通路還協(xié)同抑制半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3），后者是一種促凋亡蛋白。

2.2 牙齦卟啉單胞菌調(diào)控細(xì)胞周期并上調(diào)促炎信號(hào)通路以促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖是生長繁殖的前提，受細(xì)胞周期的精密調(diào)節(jié)。KUBONIWA M等［38］發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌感染GEC 可通過調(diào)控P53、PI3K 和細(xì)胞周期蛋白等改變細(xì)胞周期。具體表現(xiàn)為，下調(diào)抑癌基因P53水平，下調(diào)PI3K/Akt路徑負(fù)調(diào)控因子-同源性磷酸酶張力蛋白（Phosphatase and tensin homolog, PTEN）基因水平，以及上調(diào)周期蛋白A的表達(dá)水平，三者協(xié)同促進(jìn)宿主細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化，并使S期進(jìn)程加快。MENG F等［39］在ESCC中也證實(shí)了牙齦卟啉單胞菌可通過激活NF-κB（p65）信號(hào)路徑上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和細(xì)胞性骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因（c-Myc）水平［39］。此外，在人類口腔上皮中，牙齦卟啉單胞菌還能通過上調(diào)參與免疫的多個(gè)關(guān)鍵基因，激活NF-κB、TLR 及MAPK通路，促進(jìn)增殖［40］。

2.3 牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)宿主上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲牙齦卟啉單胞菌潛在致癌特性之一，表現(xiàn)為它可以促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT），實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，這主要通過產(chǎn)物MMPs發(fā)揮作用。除上述提及的路徑以外，有研究［41］表明，牙齦卟啉單胞菌感染GEC 后可誘導(dǎo)控制EMT 的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Zeb1高表達(dá)，促進(jìn)MMP-9表達(dá)增多。且牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)EMT 的過程同時(shí)上調(diào)了Zeb1 和Zeb2［27］。值得一提的是，這是通過FimA 菌毛蛋白驅(qū)動(dòng)的。非活性狀態(tài)下的糖原合成酶激酶-3β（p-GSK3β）在口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌（OSCC）中發(fā)揮了重要的EMT介質(zhì)作用，表現(xiàn)為促進(jìn)EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug、Snail和Zeb1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而抑制黏附分子E-鈣黏蛋白的表達(dá)［42］。此外，牙齦卟啉單胞菌還能通過Notch 信號(hào)通路中的Notch1 提高對(duì)化療藥物紫杉醇的耐藥性，降低化療效果，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［43］。

2.4 牙齦卟啉單胞菌抑制宿主免疫并調(diào)節(jié)自噬以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃避免疫攻擊在免疫調(diào)節(jié)方面，B7-H1受體（即程序性死亡配體PD-L1）介導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活化，牙齦卟啉單胞菌可誘導(dǎo)口腔上皮中的B7-H1受體高表達(dá)，導(dǎo)致T細(xì)胞活化無能或凋亡［44］，產(chǎn)生免疫逃避。在OSCC 中，牙齦卟啉單胞菌還能通過誘導(dǎo)高表達(dá)趨化因子CXCL2、CCL2 和細(xì)胞因子IL-6、IL-8，招募髓系來源的抑制細(xì)胞（MDSC），并依托MDSC 對(duì)T 細(xì)胞活化強(qiáng)大的免疫抑制性，降低宿主存活率［45］。此外，牙齦卟啉單胞菌還能對(duì)骨髓來源的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗吞噬作用，使癌變細(xì)胞免受吞噬細(xì)胞的攻擊［46］；而通過對(duì)自噬小體進(jìn)行修飾，可維持自身在自噬體內(nèi)長久存活，避免被溶酶體降解。值得一提的是，細(xì)菌這種抗吞噬溶解的功能是通過自身蛋白分泌系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。

2.5 牙齦卟啉單胞菌在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控宿主表觀遺傳以促進(jìn)疾病進(jìn)展miRNA 是靶向作用于mRNA 的一類單鏈RNA 小分子，參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。牙齦卟啉單胞菌感染可對(duì)宿主細(xì)胞的多種miRNA進(jìn)行差異性調(diào)節(jié)。比如通過上調(diào)miRNA-203，降低細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3（SOCS3）表達(dá)水平，激活下游靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄激活子3（Stat3），誘導(dǎo)GEC 抗凋亡［47］；上調(diào)miRNA-21，負(fù)向調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）和轉(zhuǎn)錄激活因子1（AP1），提高Cyclin D1表達(dá)水平，促進(jìn)OSCC增殖［48］；上調(diào)miRNA-194，降低粒狀轉(zhuǎn)錄因子3（GRHL3）和PTEN 表達(dá)，提高p-Akt水平，促進(jìn)ESCC 增殖和遷移等［49］。此外，牙齦卟啉單胞菌還能對(duì)宿主DNA 和組蛋白分別或同時(shí)進(jìn)行修飾實(shí)現(xiàn)促炎、促增殖效應(yīng)［50］。

3 總結(jié)與展望

消化道癌癥起病隱匿，被診斷時(shí)往往已到晚期，預(yù)后不甚理想，早期發(fā)現(xiàn)和采取干預(yù)顯得尤為重要。除了家族遺傳傾向性、不良生活飲食習(xí)慣等常規(guī)致癌因素外，細(xì)菌感染塑造的異常免疫微環(huán)境對(duì)機(jī)體的影響亦不容忽視。得益于16SrRNA 基因測(cè)序技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌與消化道癌癥存在直接關(guān)聯(lián)。通過對(duì)牙齦卟啉單胞菌主要毒力因子及致病機(jī)制的了解，我們看到了針對(duì)免疫微環(huán)境方面更多的腫瘤診療價(jià)值。糞菌移植治療已在臨床初見成效，我們?cè)O(shè)想就細(xì)菌毒力成分和相關(guān)致病機(jī)制使用特異性的靶點(diǎn)制劑，或?qū)⑵渑c傳統(tǒng)放化療結(jié)合起來，以期提高治療效果。但這之前，我們可能需要明確在腫瘤進(jìn)展的不同階段細(xì)菌的分布和作用是否具有差異性，以及這種分布和作用機(jī)制在不同性質(zhì)的宿主個(gè)體間是否同質(zhì)，這需要更多的大數(shù)據(jù)研究支持。同時(shí)，考慮到機(jī)體作為一個(gè)有機(jī)整體的高度復(fù)雜性，龐大的消化菌群之間也存在相互作用，目前多種病原體或病原體與健康菌群共存條件下致病能力和機(jī)制的研究尚不足。需更多且系統(tǒng)地研究，進(jìn)一步探索交互環(huán)境下各種信號(hào)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，以期為臨床實(shí)踐提供更有價(jià)值的參考策略。