靶向HSP90抗腫瘤天然藥物的研究進展

馬穎超，張凌晗，冷小敏，朱秀志，謝富華

（1. 贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院；2. 贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物技術教研室，江西 贛州 341000）

熱休克蛋白90（Heat shock protein90， HSP90）主要存在于真核和原核細胞中，是細胞內(nèi)最重要、含量最豐富的分子伴侶蛋白，在維持細胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定構象與正常功能中起重要作用。天然藥物通過與HSP90 的調節(jié)位點結合引起HSP90 構象改變，并誘導底物蛋白的降解，從而發(fā)揮抑制作用，抑制HSP90 下調其下游蛋白并影響腫瘤進程，使其成為腫瘤治療的新靶點。本文對靶向HSP90 抗腫瘤天然藥物的分類、作用機制及其研究進展進行綜述。

1 HSP90的生物學特性

1.1 HSP 的發(fā)現(xiàn)與分類熱休克蛋白（HSP）是生物體在受到物理、化學、生物、精神等刺激時發(fā)生應激反應而產(chǎn)生的一類蛋白質。HSP 蛋白是1962 年意大利科學家RITOSSA F M 發(fā)現(xiàn)的，他在研究果蠅唾液腺染色體時，發(fā)現(xiàn)當這些果蠅被無意中置于高溫下，染色體中會出現(xiàn)特征性膨脹［1］。因此，他推斷這種“膨脹”現(xiàn)象是由于熱應激后基因激活導致特定蛋白質的表達增加。1974 年，有人從果蠅幼蟲的唾液腺等部位分離到新的蛋白質，并把它命名為“熱休克蛋白”［2］。根據(jù)同源程度和分子量的大小，熱休克蛋白共分為5 類，分別為大分子熱休克蛋白（100～110 KD）、HSP90（83～93 KD）、HSP70（66～78 KD）、HSP60（60 KD）以及小分子熱休克蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs）（15～30 KD）。其中，人類的HSP90蛋白根據(jù)其細胞定位又可分為4種亞型：存在于胞漿中的HSP90α和HSP90β、存在于內(nèi)質網(wǎng)中的葡萄糖調節(jié)蛋白（GRP94）以及存在于線粒體基質中的HSP75/腫瘤壞死因子受體相關蛋白-1（Tumor necrosis factor receptor-associated protein1，TRAP-1）［3］。

1.2 HSP90的結構HSP90 在細胞內(nèi)主要存在形式是同源二聚體，其中每個單體包括3 個高度保守的結構域：N 端結構域（N-terminal domain， NTD）、C端結構域（C-terminal domain， CTD）和中間結構域（Middle domain， MD）［4］，每個結構域執(zhí)行特定的功能。NTD 與ATP 結合，也稱為核苷酸結合位點。CTD 負責蛋白質的二聚化，并含有特殊的序列MEEVD 或KDEL，其取決于HSP90 的亞型及其在細胞質或雌激素受體（Estrogen receptor， ER）中的定位水平［5］。

1.3 HSP90的功能熱休克反應的主要調節(jié)因子是HSP90，是細胞內(nèi)最重要、含量最為豐富的分子伴侶蛋白，在維持細胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定構象與正常功能中起著重要作用［6］。其功能是將新生的多肽鏈折疊成活性構象，促進聚集或錯誤折疊的蛋白質糾正，還可通過泛素-蛋白酶體途徑對蛋白質進行加工。據(jù)報道，HSP90 在腫瘤細胞中具有較高的ATP 酶活性，其對腫瘤細胞中抑制劑的結合親和力是正常細胞的20～200 倍［7］。BIEBL M M 等［8］發(fā)現(xiàn)HSP90 具有穩(wěn)定致癌蛋白的獨特作用，可以作為癌癥治療的靶點。此外，研究結果表明，HSP90在肝癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌、腎癌等腫瘤中過表達，腫瘤的惡性程度和預后程度跟HSP90 的高表達有關，抑制HSP90可以下調下游蛋白、促進腫瘤細胞凋亡和延緩腫瘤進展［9-14］。

2 靶向HSP90的天然藥物及其抗腫瘤作用

由于具有多種生物活性和理想的治療效果，天然藥物已經(jīng)得到了越來越多的關注，在抗腫瘤藥物的研究中也占有相當大的比例。這些藥物除了直接抑制癌細胞增殖和誘導其凋亡，還可通過免疫調節(jié)、抑制轉移等作用間接誘導腫瘤細胞死亡。比如紫杉醇是靶向HSP90 的天然藥物，其通過阻滯細胞周期從而誘導細胞凋亡；表沒食子兒茶素沒食子酸酯可通過抑制HSP90 伴侶功能誘導腫瘤細胞凋亡；魚藤素具有抗血管生成作用以及對細胞轉化和多種癌細胞有較強的抑制作用；水飛薊賓是HSP90-C末端抑制劑，可誘導幾種HSP90 依賴性客戶蛋白的降解。

2.1 靶向HSP90并促進腫瘤細胞凋亡的天然藥物

2.1.1 紫杉醇紫杉醇（Taxol）是一種來源于紅豆杉科植物紅豆杉的根、樹葉以及樹皮的次生代謝物，分子式C47H51NO14。其可增加微管蛋白聚合、微管蛋白捆綁、細胞周期阻滯［15］。實驗證實，紫杉醇可誘導肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤細胞凋亡［16-18］。研究發(fā)現(xiàn)，通過親和純化紫杉醇可與HSP90 結合，從而產(chǎn)生刺激反應［19-21］。這種刺激反應不僅使惡性腫瘤對紫杉醇敏感，而且對神經(jīng)保護劑的開發(fā)有指導作用。紫杉醇與HSP90 結合的位點尚未闡明，但有研究［22］表明，紫杉醇對胃癌細胞SGC-7901生長的抑制作用呈劑量和時間依賴性。紫杉醇誘導SGC-7901細胞凋亡具有典型的特征，包括染色質凝集、染色質新月體形成、細胞核碎裂和凋亡小體形成等形態(tài)學改變，其還可降低SGC-7901細胞Bcl-2表達，上調Bax表達，從而促進細胞凋亡［22］。

紫杉醇是細胞阻斷劑，能夠誘導多種癌細胞凋亡，它的抗癌效果與其誘導細胞凋亡的能力密切相關。紫杉醇對人絨癌細胞的主要作用靶點是微管系統(tǒng)。其能促進微管聚合，抑制微管降解，使細胞分裂阻滯在G2/M 期。在同一濃度的紫杉醇作用下，細胞凋亡率隨著作用時間的延長而增加［16］。紫杉醇具有抑制腫瘤發(fā)展和提高生存率的作用，但因溶解度差、骨髓毒性、過敏反應和耐藥性等問題制約了其臨床應用，因此，紫杉醇常與其他化療藥物聯(lián)合應用，以增強抗腫瘤作用，減少不良反應。比如，ROUSSEL E 等［23］將紫杉醇和冬凌草甲素衍生物Geridonin 聯(lián)用，Geridonin 通過激活Caspase 級聯(lián)增強紫杉醇誘導的細胞凋亡。Geridonin 和紫杉醇協(xié)調凋亡的作用是通過線粒體途徑，通過上調凋亡蛋白的同時下調Bcl-2 家族的抗凋亡。其主要通過ROS 介導的PTEN/PI3K/Akt 途徑協(xié)同抑制胃癌細胞增殖，ROS 的積累是紫杉醇誘導細胞凋亡的關鍵步驟。

2.1.2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate， EGCG）是綠茶中的重要成分，分子式：C22H18O11。其是HSP90的一種新型抑制劑，具有抗炎作用，抑制促炎細胞因子活性。EGGC 可通過抑制HSP90 同型二聚體降低與癌癥相關的HSP90 客戶蛋白ErbB2、Raf-1、p-AKT、p-ERK 以及Bcl-2 等水平。其機制是通過其在HSP90的C末端ATP結合位點處或附近結合的能力，通過破壞ATP 結合，誘導不正常的構象變化，并抑制HSP90伴侶功能［24］。

EGCG 可降低線粒體膜電位，支持G0/G1 期細胞周期阻滯，從而促進肝癌細胞凋亡。此外，EGCG誘導癌細胞凋亡與Bcl-2 和NF-κB 表達顯著降低有關［25］。EGCG 也可以抑制食管癌生長，誘導凋亡，降低Bcl-2 蛋白表達，增加Caspase-3 和Bax 蛋白表達。在25～400 μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，用不同濃度的EGCG 處理食管癌細胞Eca109 和Ec9706 細胞24 h和48 h 后發(fā)現(xiàn)，細胞存活率呈劑量和時間依賴性。用不同濃度的EGCG 處理24 h 后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Bcl-2 蛋白表達顯著下調，Bax、Caspase-3 蛋白表達顯著上調［26］。

2.1.3 魚藤素魚藤素（Deguelin）是從非洲植物Mundulea sericea（豆科植物）和其他植物中分離出來的魚藤類化合物［27］。其是一種HSP90 抑制劑，對細胞轉化和多種癌細胞有較強的凋亡和抗血管生成作用，但對正常細胞無細胞毒性［28-29］。魚藤素可在不同類型的腫瘤細胞中誘導凋亡，包括結腸癌、胃癌、白血病、乳腺癌和肝癌細胞［30-34］。最近研究［35］發(fā)現(xiàn)，魚藤素具有抗癌活性的部分原因是它與HSP90α 的ATP 口袋結合，導致許多HSP90 客戶蛋白的表達下降，包括突變的p53、細胞周期素依賴激酶4（CDK4）、絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）激酶1/2（MEK1/2）、AKT 和低氧因子（HIF）-1α，以及已知的魚藤素靶點如環(huán)氧化酶-2（COX-2）、壞死因子κB（NF-κB）和核孔蛋白98 kDa（NUP98）。魚藤素也是PI3K 和Akt 的天然抑制劑，可通過阻斷細胞周期的G2/M 期和增加癌前和惡性細胞的凋亡來抑制細胞增殖［36］。魚藤素已被證明可通過滅活Akt磷酸化誘導腫瘤細胞凋亡［37］，在腫瘤發(fā)生、轉移、凋亡和血管生成的綜合過程中，因在誘導凋亡細胞和防止腫瘤惡變方面起著關鍵作用。XU H等［38］推測，魚藤素可通過誘導ROS抑制下游的Akt通路，從而導致細胞死亡。魚藤素還增加了Bax 活性，同時導致Caspase-3和Caspase-9 裂解和Bcl-2 表達下調，從而誘導肺SCC 細胞凋亡。其誘導細胞凋亡機制主要表現(xiàn)為Bax上調、Bcl-2下調和Caspase-3激活。

2.1.4 水飛薊賓水飛薊賓（Silybin）是一種來自水飛薊的類黃酮，具有多種藥理活性，包括對各種腫瘤細胞的抗增殖和凋亡活性。水飛薊賓被鑒定為HSP90-C 末端抑制劑，能夠誘導幾種HSP90 依賴性客戶蛋白，比如HER2、Raf-1 和Akt，以濃度依賴性方式降解，而自身水平保持恒定［39］。用不同濃度的水飛薊賓處理HepG2 細胞，促凋亡蛋白p53、Bax、APAF-1 和Caspase-3 表達上調，同時降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的水平。

大量證據(jù)表明，線粒體與凋亡細胞死亡有關，線粒體去極化和Cytc釋放間存在直接關系，APAF-1是一種130 kD 的蛋白質，在線粒體控制細胞凋亡中起核心作用。水飛薊賓治療可引起肝癌細胞中APAF-1的表達，并與釋放的形成Cytc的凋亡體相互作用，從而激活Caspase-3，促進腫瘤細胞凋亡［40］。用不同濃度水飛薊賓處理MDA-MB-231 和MCF-7細胞后發(fā)現(xiàn)，p-JNK 表達增加，p-ERK1/2 和p-P38表達降低。證實水飛薊賓誘導MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞凋亡與MAPK 信號通路的調節(jié)有關。Western blot 結果表明，MDA-MB-231 和MCF-7 細胞中促凋亡蛋白Bax 表達增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達減少［41］。WANG Y X 等［42］研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素能有效誘導胃癌MGC803 細胞凋亡，使MGC803 細胞阻滯于G2/M 期，同時在蛋白和mRNA 水平上降低p-STAT3 及其下游靶基因Mcl-1、Bcl-xl、Survivin 的蛋白表達。此外，水飛薊賓還引起Caspase-3 和Caspase-9 蛋白及mRNA 水平的增加。水飛薊素還可通過下調CDK1、CyclinB1、Survivin、Bcl-xl、Mcl-1和激活Caspase-3、Caspase-9，通過STAT3 途徑誘導MGC803細胞凋亡并引起細胞周期阻滯。

2.2 干擾HSP90輔助伴侶的天然藥物研究表明，HSP90 與其底物蛋白之間的相互作用還需要一些輔助伴侶分子（Co-chaperones）的參與，如HSP70、HOP、CDC37和P23等。這些蛋白激酶在細胞周期、信號轉導和基因表達中都起著重要的作用，其中，CDC37 的作用是獨一無二的，它可以特異性地介導多種蛋白激酶與HSP90的結合。

2.2.1 芹菜素芹菜素（Apigenin）是一種廣泛存在于芹菜、洋蔥、蘋果、橘子等蔬菜水果中的黃酮類化合物，其在芹菜根中最為豐富。芹菜素具有多種生物學作用，如抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓等［43］。研究表明，芹菜素作用于原代多發(fā)性骨髓瘤細胞24 h后，能促進HSP90/CDC37 的多個底物蛋白（Raf-1/Scr 和Cdk4）發(fā)生降解，伴隨HSP90 功能抑制，細胞內(nèi)Caspase-8 和Caspase-3 活化，誘導細胞凋亡。Western blot 結果顯示，芹菜素可降低Mcl-1、Bcl-2、Bcl-XL、XIAP 和Survivin 等多種抗凋亡蛋白的表達，PARP 前體表現(xiàn)出類似的減少，伴隨著其裂解片段水平的增加，這些數(shù)據(jù)表明芹菜素可誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡［44］。芹菜素能夠對前列腺癌細胞系、多發(fā)性骨髓瘤細胞系及原代骨髓瘤細胞產(chǎn)生廣泛的影響，如抑制細胞增殖、阻斷細胞周期、誘導細胞凋亡，但對正常的外周血單個核細胞幾乎沒有影響，提示芹菜素具有潛在的臨床應用開發(fā)前景。

2.2.2 雷公藤紅素雷公藤紅素（Celastrol，CSL）又名南蛇藤素或南蛇藤醇，是從雷公藤根皮中提取出的一種三萜單體，具有抗炎、治療神經(jīng)性退化疾病等多種藥理活性，分子式C29H38O4。從結構上看，其芳香酮基上的C2 和C6 有很強的親核活性，從而具有抗腫瘤、抗微生物、抗氧化、細胞毒性和抗瘧疾等作用［45］。雷公藤紅素是一種新型的HSP90 抑制劑，能抑制細胞周期相關蛋白Cdk2/4/6、Cyclin D1（均為HSP90 客戶蛋白），同時，雷公藤紅素能抑制HSP90 的ATP 酶活性，破壞HSP90-Cdc37-Cdks 復合物，使Cdk4、Cdk6、Cdc37 從HSP90 復合體中解離［46］。

XU L N 等［47］發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可誘導卵巢癌細胞生長抑制、使細胞周期停滯在G2/M 期，增加細胞內(nèi)活性氧（ROS）積聚，誘導細胞凋亡，從而抑制卵巢癌細胞的生長。LIU X H 等［48］證實了雷公藤紅素對膠質瘤細胞的抗腫瘤作用，闡明了其通過調節(jié)ROS/JNK 和Akt/mTOR 信號通路誘導膠質瘤細胞在G2/M期阻滯、凋亡。細胞實驗結果顯示，在雷公藤紅素的作用下，早期和晚期凋亡細胞均呈劑量依賴性增加；Western blot 檢測與細胞凋亡相關的中樞信號蛋白的表達證明，雷公藤紅素能顯著提高PARP 和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 蛋白水平，且呈時間和劑量依賴性［48］。

3 結論與展望

近些年，HSP90 成為腫瘤分子靶向治療的新靶點。通過對幾種作用于HSP90 的天然藥物的探討，我們發(fā)現(xiàn)，其通過不同的作用機制誘導腫瘤細胞的凋亡，既可以通過抑制信號通路的方式，也可以通過與HSP90 的輔助伴侶分子結合的方式誘導細胞凋亡。天然藥物既可以單獨作用于癌細胞，也可以與其他化合物聯(lián)用，可能會引起更好的藥效。隨著對HSP90 生物活性的研究，其作用機制更加明確，肯定可以發(fā)現(xiàn)毒性較低、對癌癥患者的治療更為有益的天然藥物或化合物。