高效液相色譜法同時測定摩羅丹中5 種成分含量

張汶婕，宗 鎮(zhèn)，吳 陵

（安徽省銅陵市食品藥品檢驗中心，安徽 銅陵 244000）

摩羅丹（分蜜丸與濃縮丸）由百合、茯苓、玄參等18味中藥制成，有和胃降逆、健脾消脹、通絡定痛功效，可用于治療胃疼、脹滿、痞悶等。其所含成分復雜，加之中藥制劑所用藥材和藥材飲片因產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制方法等的不同易導致質(zhì)量差異較大。現(xiàn)行質(zhì)量標準［1-2］僅針對其成分延胡索和延胡索乙素設置了薄層色譜鑒別項，文獻［3 - 4］增加了麥冬、人參皂苷Rg1、沒食子酸、當歸、川芎的薄層色譜鑒別項，但僅對芍藥苷進行了定量研究，難以有效控制其整體質(zhì)量。鑒于此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定摩羅丹中哈巴苷、哈巴俄苷、人參皂苷Rb1、芍藥苷、延胡索乙素的含量，以為全面評價該制劑質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000 型高效液相色譜儀［配有二極管陣列檢測器（DAD），美國Thermo Fisher Scientific 公司］；XSE205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KH5200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

摩羅丹（邯鄲制藥股份有限公司，批號分別為00422126，00321015，00122021的產(chǎn)品為大蜜丸，規(guī)格為每丸9 g，批號為S00320142的產(chǎn)品為小蜜丸，規(guī)格為每55粒9 g）；哈巴苷對照品（批號為111729 - 201707，含量96.8%），芍藥苷對照品（批號為110736-202145，含量94.6%），延胡索乙素對照品（批號為110726-202020，含量99.3%），哈巴俄苷對照品（批號為111730-202110，含量96.8%），人參皂苷Rb1對照品（批號為110704 -201223，含量95.9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）［5-10］，梯度洗脫（0～10 min 時3%A，10～11 min 時3%A →15%A，11～15 min 時15%A，15～30 min 時15%A →20%A，30～40 min 時20%A →25%A，40～47 min 時25%A，47～70 min 時25%A →36%A，70～75 min 時36%A →3%A；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～12 min時210 nm（哈巴苷），12～26 min時230 nm（芍藥苷），26～55 min 時280 nm（延胡索乙素、哈巴俄苷），55～75 min 時203 nm（人參皂苷Rb1）［11］；柱溫：20 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取各對照品適量，精密稱定，加70%甲醇，制成分別含哈巴苷0.021 4 mg/mL、芍藥苷2.582 6 mg/ mL，延胡索乙素0.088 2 mg/ mL，哈巴俄苷0.126 4 mg/mL，人參皂苷Rb14.512 1 mg/mL 的混合對照品貯備液。精密量取2 mL，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，制成含哈巴苷1.712 μg/ mL、芍藥苷206.6 μg/ mL、延胡索乙素7.056 μg/ mL、哈巴俄苷10.11μg/mL、人參皂苷Rb1361.0μg/mL 的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品（剪碎）約5.0 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W、頻率40 kHz）處理45 min，室溫放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按摩羅丹處方及工藝分別制備缺玄參、白芍、延胡索、三七的單一陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備相應陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗和專屬性試驗：分別取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果供試品溶液色譜圖，在與混合對照品溶液色譜圖相同保留時間處有相應色譜峰；5 種成分色譜峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

1.哈巴苷 2.芍藥苷 3.延胡索乙素 4.哈巴俄苷 5.人參皂苷Rb1A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C - F.陰性對照品溶液（分別缺玄參、白芍、延胡索、三七）圖1 高效液相色譜圖1.Harpagide 2.Paeoniflorin 3.Tetrahydropalmatine 4.Harpagoside 5.Ginsenoside Rb1A.Mixed reference solution B.Test solution C - F.Negative reference solution（lacking Scrophulariae Radix，Paeoniae Radix Alba，Corydalis Rhizoma and Notoginseng Radix et Rhizoma，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2項下混合對照品貯備液0.4，1.2，2.0，2.8，3.6，4.4 mL，分別置25 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，得系列混合對照品溶液。各取10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍。結(jié)果見表1。

表1 線性關系及檢測限、定量限考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ（n=6）

檢測限與定量限考察：精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，逐步稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以信噪比（S/N）分別約為3∶1 和10∶1 時待測成分質(zhì)量濃度記為檢測限和定量限。結(jié)果見表1。

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果哈巴苷、芍藥苷、延胡索乙素、哈巴俄苷、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.79%，0.42%，1.10%，1.30%，0.56%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品（批號為00422126）溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果哈巴苷、芍藥苷、延胡索乙素、哈巴俄苷、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為1.90%，0.52%，1.00%，1.70%，0.88%（n= 6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批（批號為00422126）樣品6份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果哈巴苷、芍藥苷、延胡索乙素、哈巴俄苷、人參皂苷Rb1的平均含量分別為0.008 8，1.10，0.036，0.051，1.74 mg/g，RSD分別為1.20%，0.88%，1.50%，1.40%，1.10%（n= 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：將已知含量的樣品（批號為00422126）剪碎，取9 份，每份約2.5 g，精密稱定，分別精密加入2.2 項下混合對照品貯備液0.5，1.0，1.5 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取4 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算5種成分的含量。結(jié)果見表3（-為未測出）。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of five components in samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 提取條件選擇

預試驗中分別比較了以50%，70%，100%甲醇和50%，70%，100%乙醇為提取溶劑時的提取效果。結(jié)果表明，與50%，100%甲醇比較，以70%甲醇提取時，更能兼顧到5 種成分提取率，且雜質(zhì)干擾少。還比較了浸泡過夜、索氏提取、超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）、加熱回流法等提取方法，結(jié)果顯示，浸泡過夜和索氏提取2 種方法提取率均較低，超聲提取法與加熱回流法2 種方法提取時各成分提取量無明顯差異，而超聲提取法更簡便。最后考察提取時間，分別超聲提取30，45，60 min，發(fā)現(xiàn)45 min 時各成分可提取完全。因此，正式試驗中對摩羅丹樣品采用70%甲醇超聲提取45 min。

3.2 指標成分選擇

摩羅丹組方中，百合養(yǎng)陰潤肺，麥冬養(yǎng)陰生津，石斛益胃生津，玄參滋陰降火，共為君藥；蒲黃、三七止血，川芎、當歸活血，茯苓、白術(shù)健脾，雞內(nèi)金健胃，共為臣藥；地榆涼血止血，澤瀉利水滲濕，茵陳清利濕熱，九節(jié)菖蒲開竅化痰，共為佐藥；白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，烏藥行氣止痛，延胡索活血行氣，共為使藥。本研究中兼顧君臣佐使藥，選取方中君藥玄參主要活性成分哈巴苷、哈巴俄苷，臣藥三七主要藥效成分人參皂苷Rb1，以及使藥白芍代表性成分芍藥苷，延胡索主要藥效成分延胡索乙素為定量研究指標成分，以全面評價摩羅丹的整體質(zhì)量。

3.3 色譜條件選擇

檢測波長：預試驗中以DAD檢測器，在190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描混合對照品溶液，測定各組分最大吸收波長，顯示哈巴苷、人參皂苷Rb1在203 nm，芍藥苷在230 nm，哈巴俄苷在278 nm、延胡索乙素在282 nm 波長處有最大吸收。哈巴苷的最大吸收波長屬紫外末端吸收，影響定量準確性，故參考現(xiàn)行藥典標準設定檢測波長為210 nm。因282 nm 與278 nm 十分接近，考察后發(fā)現(xiàn)280 nm 波長對定量無影響，故選取280 nm 波長測定延胡索乙素和哈巴俄苷。

流動相：預試驗中對甲醇- 水、乙腈- 水、甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈- 0.05%磷酸水溶液等流動相體系進行考察，結(jié)果顯示，有機相為乙腈時洗脫能力強，基線更平穩(wěn)，柱壓較低，無機相中加入磷酸后，峰形和分離度均得到了改善。故選用乙腈- 0.05%磷酸水溶液作為梯度洗脫的流動相。

柱溫：在檢測波長與流動相體系確定的情況下，柱溫分別設定為20，30，40 ℃，結(jié)果顯示，樣品中最易受到雜質(zhì)峰干擾的延胡索乙素及哈巴俄苷在20 ℃時分離度均最高，故柱溫選擇20 ℃。

3.4 含量分析

摩羅丹屬中藥成方保護品種，處方中各組分劑量和制法工藝未公開。故在預試驗中對玄參飲片（購自北京同仁堂安徽連鎖藥店有限責任公司銅陵店）進行含量測定，結(jié)果哈巴苷含量為1.19 mg/g，哈巴俄苷含量為0.367 mg/g，差異較大。參考文獻［12- 15］，不同產(chǎn)地玄參所含哈巴苷或哈巴俄苷含量存在極顯著差異，且不同加工方法也會導致兩者含量有顯著差異。摩羅丹與自購玄參飲片中哈巴苷、哈巴俄苷含量差異顯著的原因可能在此。

3.5 方法評價

該方法操作簡便，結(jié)果準確，重復性好，可用于同時測定摩羅丹中哈巴苷、芍藥苷、延胡索乙素、哈巴俄苷、人參皂苷Rb1的含量。