高效液相色譜法同時(shí)測定人工牛黃甲硝唑膠囊中甲硝唑和膽紅素含量*

陳 路，李 苗，黃金秋，蘭 彤，宮立孟△

（1.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所·國家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑質(zhì)量研究與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430075；2.湖北生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，湖北 武漢 430073）

人工牛黃甲硝唑膠囊對(duì)急性智齒冠周炎、局部牙槽膿腫、牙髓炎牙根炎療效較好［1-2］。該方主要由人工牛黃和甲硝唑組成，其中人工牛黃主要成分有牛磺酸、牛膽粉、膽紅素等，有清熱解毒、化痰定驚功效［3-5］。膽紅素是制劑質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。2020 年版《中國藥典》暫未收載人工牛黃甲硝唑膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》，其中甲硝唑與膽紅素的含量需分別測定，操作煩瑣。且測定甲硝唑含量的紫外- 可見分光光度法專屬性不強(qiáng)，易受輔料等雜質(zhì)干擾；測定膽紅素含量的高效液相色譜（HPLC）法，流動(dòng)相和提取溶劑均用到了三氯甲烷，其對(duì)人體有害，且易揮發(fā)，在光照條件下易氧化，分解為劇毒的碳酰氫和氯化氫，作為溶劑對(duì)液相流路部分有侵蝕效應(yīng)［6］。鑒于此，本研究中建立了同時(shí)測定人工牛黃甲硝唑膠囊中膽紅素和甲硝唑含量的HPLC法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；SK8200HP 型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；XS205 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；CLXXXUVM2 型純水機(jī)（瑞士Elga公司）。

1.2 試藥

人工牛黃甲硝唑膠囊（企業(yè)A 1批，批號(hào)為201101；企業(yè)B3批，批號(hào)分別為366201191，366210503，366201061；規(guī)格均為每粒含甲硝唑200 mg、人工牛黃5 mg）；甲硝唑?qū)φ掌罚ㄅ?hào)為100191 - 201808，含量100.0%），膽紅素對(duì)照品（批號(hào)為100077-202009，含量98.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：1%醋酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～6.0 min 時(shí)92%A，6.0～6.1 min 時(shí)92%A →2%A，6.1～16.0 min 時(shí)2%A，16.0～16.1 min 時(shí)2%A →92%A，16.1～22.0 min 時(shí)92%A）；流速：1 mL/ min；檢測波長：320 nm（甲硝唑）、449 nm（膽紅素）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL（甲硝唑）、5μL（膽紅素）。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取膽紅素對(duì)照品適量，精密稱定，加二氯甲烷制成含膽紅素8 μg/mL 的對(duì)照品溶液Ⅰ；取甲硝唑?qū)φ掌愤m量，105 ℃干燥2 h，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成含甲硝唑0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液Ⅱ。

供試品溶液：取樣品適量（約10 粒，相當(dāng)于人工牛黃50 mg），精密稱定，置50 mL 棕色容量瓶中，加提取溶劑［二氯甲烷- 甲醇- 水- 鹽酸（90∶10∶0.3∶0.03，V/V/V/V）］30 mL，冰浴超聲（功率500 W，頻率53 kHz）20 min 使溶解，用提取溶劑定容，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液Ⅰ。取樣品適量（約1 粒，相當(dāng)于甲硝唑200 mg），精密稱定，置200 mL容量瓶中，加50%甲醇振搖使溶解并定容，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液Ⅱ。

陰性對(duì)照品溶液：按人工牛黃甲硝唑膠囊的處方及工藝分別制備缺人工牛黃或甲硝唑的單一陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液Ⅰ和Ⅱ。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下6 種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)位置處有吸收峰。理論板數(shù)按膽紅素、甲硝唑峰計(jì)均不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1。

1.膽紅素 2.甲硝唑A1.對(duì)照品溶液Ⅰ B1.供試品溶液Ⅰ C1.陰性對(duì)照品溶液Ⅰ A2.對(duì)照品溶液Ⅱ B2.供試品溶液Ⅱ C2.陰性對(duì)照品溶液Ⅱ圖1 高效液相色譜圖1.Bilirubin 2.MetronidazoleA1.Reference solution Ⅰ B1.Test solution Ⅰ C1.Negative reference solution Ⅰ A2.Reference solution Ⅱ B2.Test solution ⅡC2.Negative reference solution ⅡFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取膽紅素對(duì)照品約10 mg，置100 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，制成含膽紅素98.90 μg/ mL 的對(duì)照品貯備液Ⅰ，分別量取適量，稀釋，制成含膽紅素1.98，3.96，5.93，7.91，9.89，11.87，13.85μg/mL的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以膽紅素質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y1=25 474X1+7 329（r=0.999 9，n=7）。結(jié)果表明，膽紅素質(zhì)量濃度在1.98～13.85μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。取甲硝唑?qū)φ掌愤m量，105 ℃干燥2 h，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成含甲硝唑1 006.4μg/mL的對(duì)照品貯備液Ⅱ，分別量取適量，稀釋，制成含甲硝 唑20.13，50.32，80.51，100.64，120.77，150.96，201.28μg/mL的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以甲硝唑質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y2= 23 902X2- 59 310（r= 0.999 9，n= 7）。結(jié)果表明，甲硝唑質(zhì)量濃度在20.13～201.28 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限考察：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下對(duì)照品貯備液Ⅰ適量，加二氯甲烷稀釋，制成含膽紅素0.098 9μg/mL的溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得膽紅素峰的信噪比為9.4，按信噪比10∶1 計(jì)算，膽紅素定量限為0.10 μg/ mL。取對(duì)照品貯備液Ⅱ適量，加50%甲醇稀釋，制成含甲硝唑0.040 3 μg/ mL 的溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得甲硝唑峰的信噪比為7.1，按信噪比10∶1計(jì)算，甲硝唑定量限為0.057μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液Ⅰ和Ⅱ各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，計(jì)算峰面積。結(jié)果膽紅素和甲硝唑峰面積的RSD分別為0.42%和0.21%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液Ⅰ和Ⅱ各適量，分別在室溫下放置0，4，12，16，18，24 h及0，4，8，12，24，36，48 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液Ⅰ峰面積的RSD為0.82%（n=6），表明其室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；供試品溶液Ⅱ峰面積的RSD為0.40%（n=7），表明其室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為201101）內(nèi)容物適量，各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果膽紅素、甲硝唑平均含量分別為0.032 mg/ 粒和101.42%，RSD分別為1.00%和0.31%（n=6）。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為201101）內(nèi)容物適量，各9 份，精密加入膽紅素對(duì)照品及甲硝唑?qū)φ掌愤m量，按2.2項(xiàng)下方法分別制備膽紅素及甲硝唑的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取B 企業(yè)3 批樣品各適量，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再分別按2.1項(xiàng)下色譜條件及法定方法進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of content determination of bilirubin and metronidazole in samples（n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

目前，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中規(guī)定膽紅素的流動(dòng)相中均含有三氯甲烷［7-8］，且僅針對(duì)膽紅素的檢測。三氯甲烷為易制毒物且對(duì)環(huán)境污染大，故本研究中對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化，采用對(duì)環(huán)境傷害較小的1%醋酸水溶液-乙腈（5∶95，V/V）代替原有含三氯甲烷的流動(dòng)相，同時(shí)兼顧了甲硝唑的檢測。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，本研究中最終在該流動(dòng)相基礎(chǔ)上采用梯度洗脫，2個(gè)組分均在合理的時(shí)間范圍內(nèi)洗脫。

3.2 波長和溶劑選擇

由于甲硝唑和膽紅素最大吸收波長相差較大，故采取雙波長檢測。結(jié)合甲硝唑和膽紅素掃描圖譜和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，確定甲硝唑檢測波長為320 nm，膽紅素檢測波長為449 nm。參考2020 年版《中國藥典》中甲硝唑膠囊的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，甲硝唑提取溶劑采用50%甲醇。結(jié)合型膽紅素由膽紅素蛋白和鈣元素聚合而成，難溶于水和有機(jī)溶劑［9-10］。游離膽紅素的分子結(jié)構(gòu)為折疊型，故易在二氯甲烷、苯、三氯甲烷等有機(jī)溶劑中溶解，為了將結(jié)合型膽紅素解離轉(zhuǎn)化為游離膽紅素，多用酸作為解離劑［11-12］。故膽紅素多用三氯甲烷和酸組合來提取。據(jù)報(bào)道，在提取溶劑中加入甲醇對(duì)樣品的滲透性較好，且能提高提取效率［13-14］。因二氯甲烷毒性低于三氯甲烷，預(yù)試驗(yàn)中考察了不同比例二氯甲烷和甲醇的提取效率及參考現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，確定了二氯甲烷- 甲醇- 水-鹽酸（90∶10∶0.3∶0.03，V/V/V/V）為提取溶劑。

3.3 進(jìn)樣量選擇

預(yù)試驗(yàn)中在進(jìn)樣量為10μL 時(shí)，膽紅素濃度較高時(shí)峰形欠佳，柱效過低，當(dāng)進(jìn)樣量≤5 μL 時(shí)峰形良好。另外，不同來源的人工牛黃中膽紅素含量差異較大，為適應(yīng)檢測需求，將進(jìn)樣量設(shè)為5μL。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了可同時(shí)測定人工牛黃甲硝唑膠囊中甲硝唑和膽紅素含量的HPLC 法。該方法與制劑法定標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果相近，且改進(jìn)了甲硝唑的檢測方法，優(yōu)化了膽紅素的提取溶劑。所建立的方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于本品中2 個(gè)有效成分的同時(shí)測定與質(zhì)量控制，也為其他含牛黃制劑的測定提供了參考。