金蓮花軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

林鳳屏，翁 嘉，陳霞飛，李錦妹，歐陽珠

（惠州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 惠州 516003）

金蓮花軟膠囊由金蓮花單味藥材經(jīng)煎煮、干燥、粉碎、制粒而成，有抗菌消炎作用，主要用于治療上呼吸道感染、牙周炎、腮腺炎、口腔潰瘍、手足口病，為兒科常用藥，具有副作用小、療效確切的優(yōu)點(diǎn)。有研究表明，金蓮花軟膠囊可抑制人冠狀病毒OC43 復(fù)制及病毒感染引起的宿主細(xì)胞相關(guān)因子的高表達(dá)［1-3］。該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為原國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號YBZ02792008，YBZ30232005 - 2010Z）。前一標(biāo)準(zhǔn)中收載了金蓮花藥材的理化鑒別、薄層色譜（TLC）鑒別及蘆丁含量的測定方法（紫外- 可見分光光度法），后一標(biāo)準(zhǔn)中收載了金蓮花藥材的TLC 鑒別及槲皮素含量測定的高效液相色譜（HPLC）法，但此2 種標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容與2020 年版《中國藥典（一部）》金蓮花制劑（包括口服液、片、膠囊、顆粒、潤喉片）相比專屬性不強(qiáng)。鑒于此，本研究中參考2020 年版《中國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)［4-11］對金蓮花軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升進(jìn)行探討?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC - 20A 型 及Agilent 1260 型高效 液 相色譜儀（日本Shimadzu 公司及美國Agilent 公司，均配置二極管陣列檢測器）；XS205型及XS204型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度分別為0.01 mg，0.1 mg）；Camag Peprostar 3 型薄層成像系統(tǒng)（瑞士Camag 公司）；KQ - 250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

金蓮花軟膠囊樣品10批（A廠，批號分別為L17K061，L17C061，L17L161，L18C051，L18B281，L18A111，L17A131；B 廠，批號分別為170408，170904，180108）；葒草苷對照品（批號為111777-201302，含量≥98%），牡荊苷對照品（批號為111687-200602，含量≥98%），金蓮花對照藥材（批號為121089 - 201204），均購于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

取樣品內(nèi)容物1.5 g，混勻，加80%乙醇25 mL，超聲（功率250 W、頻率40 kHz，下同）處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取3 次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。取葒草苷、牡荊苷對照品各適量，分別加甲醇制成每1 mL含葒草苷0.6 mg、牡荊苷0.3 mg的單一對照品溶液。取金蓮花對照藥材0.5 g，加80%乙醇15 mL，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。按金蓮花軟膠囊處方及工藝制備缺金蓮花藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。吸取上述溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯- 丁酮- 甲酸- 水（12∶6∶1∶1.5，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和單一對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

1-3.供試品溶液 4.陰性對照品溶液 5.對照藥材溶液6.葒草苷對照品溶液 7.牡荊苷對照品溶液圖1 薄層色譜圖1 - 3.Test solution 4.Negative reference solution 5.Reference medicinal solution 6.Orientin reference solution 7.Vitexin reference solutionFig.1 TLC chromatograms

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇- 乙腈- 0.1%磷酸水溶液（10∶12∶78，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：349 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取葒草苷對照品10 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻；精密吸取2 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得對照品溶液。將10粒樣品內(nèi)容物混勻，取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取2.2.2 項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液及2.1 項(xiàng)下陰性對照品溶液各10 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照品溶液在與對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖2。

1.葒草苷A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.OrientinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取葒草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，制得不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液；各取10μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以葒草苷質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=25.699X+8.276 2（R2=0.999 9）。結(jié)果表明，葒草苷質(zhì)量濃度在1.68～168.97 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品（批號為L17K061）溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h時按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.70%（n=7），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為L17K061）適量，精密稱定，共6 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果葒草苷的平均含量為4.21 mg/ g，RSD為0.60%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（4.211 mg/ g）的樣品（批號為L17K061）6份，每份約0.125 g，精密稱定，分別加入葒草苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.165 45 mg/mL）3 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液（從“精密加入甲醇50 mL”起），按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取10 批樣品各適量，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法計算樣品含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of orientin in samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 薄層色譜

預(yù)試驗(yàn)中考察了不同展開劑，包括乙酸丁酯- 甲酸-水（7∶2.5∶2.5，V/V/V）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（1∶8∶1∶1，V/V/V/V）的上層溶液、三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7∶3∶4，V/V/V）、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（8∶6∶1∶1.5及12∶6∶1∶1.5，V/V/V/V），根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果及考慮減少有毒有害試劑的使用，確定展開系統(tǒng)為乙酸乙酯- 丁酮- 甲酸- 水（12∶6∶1∶1.5，V/V/V/V）。同時對不同廠家（德國Merck公司，青島海洋化工廠，煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所）的薄層板、不同試驗(yàn)溫度（4 ℃和40 ℃）和相對濕度（32%和88%）進(jìn)行考察，結(jié)果表明，不同板材及溫度、濕度變化對色譜效果無影響，表明本方法耐用性良好。

3.2 含量測定

金蓮花軟膠囊抗菌主要有效成分為黃酮類化合物，包括葒草苷、牡荊苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、金蓮花苷等成分［12-14］。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中缺少對金蓮花藥材有效成分的定量研究，無法更好地滿足該制劑的質(zhì)量控制要求。本研究中采用HPLC 法測定金蓮花軟膠囊中葒草苷的含量，方法簡便，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好。另外，預(yù)試驗(yàn)中還對不同流速（0.9 mL / min 和1.1 mL/ min）、不同柱溫（30 ℃和40 ℃）及不同色譜柱進(jìn)行了考察，結(jié)果三者小幅變動對測定結(jié)果無影響，表明所建立的測定方法耐用性良好，可用于金蓮花軟膠囊的含量測定。