林下鐵皮石斛不同發(fā)育時(shí)期的成分變化研究進(jìn)展

黃佑國(guó)施蕊李彪何舒嚴(yán)星茹張澳何霞紅

(1.西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/昆明生態(tài)林業(yè)產(chǎn)業(yè)國(guó)際科技研發(fā)中心/西南林業(yè)大學(xué)園林與園藝學(xué)院，云南 昆明 650224；2.玉溪三農(nóng)高原特色現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司，云南 澄江 652599)

前言

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物，是一類(lèi)藥用范圍較廣的中藥，也是一類(lèi)觀賞植物，被稱為“救命仙草”，今人稱之為“藥中黃金”，國(guó)際上有“藥界大熊貓”的美稱。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，石斛有2300多年的藥用歷史。鐵皮石斛為多年生草本，莖直立、圓柱形，長(zhǎng)而細(xì)；生長(zhǎng)在海拔100～3000m的地區(qū)，花期通常在4—6月。這類(lèi)植物一般附生于半陰濕的巖石上，不耐寒，特別是其幼苗，對(duì)生長(zhǎng)條件要求非?？量?。

自然界中的野生鐵皮石斛生長(zhǎng)緩慢且繁殖能力差，以及長(zhǎng)期以來(lái)過(guò)度采摘、生態(tài)破壞等因素，野生資源面臨著嚴(yán)重威脅。因此，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)禁止采摘野生品種。市場(chǎng)上流通的鐵皮石斛主要由人工培育而來(lái)，我國(guó)很多地區(qū)均有種植。然而這種植物生長(zhǎng)期間所采用的大肥大水種植模式、農(nóng)藥濫用導(dǎo)致農(nóng)殘重金屬超標(biāo)導(dǎo)致鐵皮石斛的品質(zhì)下降。因此，實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛藥材的零化學(xué)農(nóng)藥、零化學(xué)肥料施用，保障中藥材的安全性和優(yōu)質(zhì)性極為重要。陳寶玲等的報(bào)道中指出立體復(fù)合栽培模式能夠顯著提高該藥物的經(jīng)濟(jì)效益，且生態(tài)環(huán)保，這種栽培模式值得在各大種植區(qū)進(jìn)行推廣。

根據(jù)《中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)》(2020年)，進(jìn)入中國(guó)藥典的品種有鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)、金釵石斛(D.nobile Lindl.)、霍山石斛(D.huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum Lindl.)和流蘇石斛(D.fimbriatum Hook)等。但鐵皮石斛因其較高的藥理價(jià)值而備受關(guān)注并且被單獨(dú)列出。鐵皮石斛(D.officinale Kimura et Migo)含有多種重要活性成分，包括多糖、生物堿、氨基酸與微量元素、聯(lián)芐類(lèi)和菲類(lèi)以及黃酮類(lèi)等。鐵皮石斛在治療萎縮性胃炎、糖尿病、癌癥、心血管疾病和白內(nèi)障以及延緩衰老等方面起著重要作用，鐵皮石斛多糖(DOPs)和生物堿，以及少量黃酮類(lèi)化合物能治療低血糖，并具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。鐵皮石斛的生物堿具有抗氧化和神經(jīng)保護(hù)活性作用，鐵皮石斛具有良好的抗細(xì)胞毒性和抗氧化功能。

目前有關(guān)鐵皮石斛有效成分可參考的文獻(xiàn)研究也比較多，主要是對(duì)鐵皮石斛的莖展開(kāi)研究，對(duì)其花、葉的研究并不多見(jiàn)。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)這種植物的花含有大量的資源成分，如有機(jī)酸類(lèi)和萜類(lèi)等，這些成分具有較強(qiáng)的生物活性，可以起到增強(qiáng)機(jī)體體質(zhì)、治療炎癥、抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)痛等作用。李芳等探討了鐵皮石斛莖、葉、花不同部位黃酮含量，發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)在花中的含量最高。之后探討了黃酮的藥用價(jià)值，指出該物質(zhì)具有很高的抗氧化活性，可以有效清除體內(nèi)自由基、延緩人體細(xì)胞的氧化和衰老，是極具開(kāi)發(fā)潛力的天然抗氧化劑。鐵皮石斛作為熱門(mén)中藥材之一，除了其藥用部位莖以外，石斛花、石斛葉藥理作用的研究也具有重要意義。

鐵皮石斛林下原生境種植也取得了初步成功。楊洪斌通過(guò)在瑞麗中緬邊境干邦亞山區(qū)種植鐵皮石斛10年來(lái)的實(shí)踐，逐步摸索出仿野生林下種植的實(shí)用技術(shù)；之后對(duì)石斛藥用價(jià)值進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，其藥用品質(zhì)可以與野生鐵皮石斛媲美。陳向東配制出林下種植營(yíng)養(yǎng)土并進(jìn)行植物栽培，之后展開(kāi)一系列節(jié)約、環(huán)保的實(shí)驗(yàn)，最終確定出營(yíng)養(yǎng)土的最佳配比，這為石斛的栽培提供了新思路，該項(xiàng)研究在當(dāng)時(shí)受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。

迄今，對(duì)林下鐵皮石斛的研究和報(bào)道雖已較多，但林下鐵皮石斛成分代謝變化和分子機(jī)制尚不清楚。隨著高通量組學(xué)在中藥研究的應(yīng)用，代謝組是基因組與表型組的媒介，代謝組的研究對(duì)理解植物代謝機(jī)理，提升植物的抗逆性具有積極意義，為增加作物產(chǎn)量與品質(zhì)提供了理論上的指導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄組可以檢測(cè)到所有正在表達(dá)的基因的變化動(dòng)態(tài)，結(jié)合基因表達(dá)和代謝物積累的數(shù)據(jù)基于“代謝物+基因”共表達(dá)分析，解析生物分子功能和調(diào)控機(jī)制，能有效篩選出鐵皮石斛次生代謝產(chǎn)物的代謝通路和有效成分累積的關(guān)鍵調(diào)控基因，進(jìn)而開(kāi)展后續(xù)的數(shù)據(jù)挖掘。本研究利用代謝組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等分析林下鐵皮石斛特定條件下特定時(shí)間的生物代謝積累規(guī)律以及構(gòu)建相關(guān)時(shí)間內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)。

1 不同種植模式的鐵皮石斛研究進(jìn)展

由于鐵皮石斛長(zhǎng)期大水大肥的人工種植，導(dǎo)致其產(chǎn)量高、品質(zhì)低，吳紀(jì)賢研究了活樹(shù)捆綁和橫桿捆綁種植方式的可行性，并與溫室大棚種植進(jìn)行對(duì)比，前者能夠節(jié)約土地資源，尤其是在土地資源緊張的地區(qū)，捆綁種植技術(shù)可在有限的空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)植物多樣化，且易于管理和維護(hù)，在種植業(yè)提質(zhì)增效、成本管理方面是溫室大棚無(wú)法企及的。近年來(lái)，有學(xué)者探討了鐵皮石斛仿野生林下種植新模式的推廣價(jià)值。李帆等基于UPLC-MS/MS代謝組學(xué)技術(shù)分析不同栽培模式下鐵皮石斛類(lèi)黃酮化合物的差異性發(fā)現(xiàn)，林下活樹(shù)附生和巖壁附生栽培明顯提升黃酮、類(lèi)黃酮化合物的生物合成水平，保障了藥材質(zhì)量。王金旺等以鐵皮石斛為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的摸索后，提出3種人工培育策略，即活樹(shù)附生栽培、新伐毛竹附生栽培、巖壁附生栽培，之后對(duì)不同栽培模式下的石斛展開(kāi)生長(zhǎng)性狀以及檢測(cè)分析，進(jìn)而確定出其折干率、水分、灰分等的含量，經(jīng)過(guò)對(duì)比得出最佳栽培方式。研究發(fā)現(xiàn)，該植物采用新伐毛竹附生栽培，其長(zhǎng)勢(shì)較活樹(shù)附生栽培差，但比巖壁附生種植好。其品質(zhì)也是活樹(shù)附生栽培略好。

Wang等采用不同的分離方法和技術(shù)，從不同附生立木和種質(zhì)的石斛中分離到內(nèi)生真菌，包括曲霉、鐮刀菌等，并對(duì)這些真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究，以確定其特征。這為石斛與內(nèi)生真菌的相互關(guān)系研究提供了新思路，為該植物的生物防治和生態(tài)保護(hù)提供了參考。

2 鐵皮石斛關(guān)鍵部位間差異研究進(jìn)展

鐵皮石斛是珍貴的中藥材，屬于蘭科植物，具有多種功效。在中國(guó)和其他亞洲國(guó)家[1]，由于其高藥用價(jià)值，過(guò)度開(kāi)發(fā)和棲息地破壞而瀕臨滅絕，目前我國(guó)已出臺(tái)相關(guān)法規(guī)禁止采摘野生石斛。

Wang等測(cè)定了鐵皮石斛全植株、根、莖、葉和PLB等各器官中多糖、黃酮類(lèi)和生物堿的含量，通過(guò)方差分析和多重比較檢測(cè)樣本間3個(gè)成分含量存在顯著差異，DOPs在植物器官中的分布位莖>全植物>葉>根。鐵皮石斛莖中多糖含量最高，為402.93mg·g-1DW(干重)。而PLBs的多糖含量低于植物器官，平均含量為75.30mg·g-1DW，PLB和葉片可以分析這些代謝物特定生物合成途徑的候選酶編碼基因的表達(dá)水平?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序中基因差異表達(dá)(DEGs)的結(jié)果，鑒定驗(yàn)證了參與主要代謝物生物合成途徑的酶的編碼基因。首次報(bào)道了鐵皮石斛生物堿生物合成中SG、GS和VS等酶的編碼基因。此外，一些參與調(diào)控生物堿生物合成的轉(zhuǎn)錄因子在鐵皮石斛的葉片和PLB中存在差異表達(dá)。

Yang Qian-yu等基于以往發(fā)表的擬南芥CaM和CML基因家族蛋白序列，對(duì)小蘭嶼蝴蝶蘭和鐵皮石斛的全基因組進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示，這2種植物的全基因組中均預(yù)測(cè)到4個(gè)CaM蛋白和54個(gè)CML蛋白；之后對(duì)二者作進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析，將CaM和CML蛋白家族各分為10個(gè)亞家族；對(duì)小蘭嶼蝴蝶蘭進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果顯示，該植物中9個(gè)基因在葉中的數(shù)量比在花、莖、根中的數(shù)量更多，2個(gè)基因在葉中的數(shù)量相對(duì)更多，3個(gè)基因在花中的數(shù)量相較于其他部分的含量更多；對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果顯示該植物中4個(gè)基因在與美胞膠膜菌共生萌發(fā)文庫(kù)中的數(shù)量比在非共生文庫(kù)中的數(shù)量更多。由此得出以上2種蛋白家族基因在蘭科植物不同組織中的含量各異，且二者均影響著石斛種子與美孢膠膜菌共生萌發(fā)的生物學(xué)調(diào)控。這為后續(xù)人類(lèi)深入研究CaM和CML基因家族的生物學(xué)特性做了鋪墊。

Lin J B等借助Illumina HiSeq 4000高通量測(cè)序方法檢測(cè)并探討鐵皮石斛植物甾醇的生物合成機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)比分析植物甾醇生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛植物甾醇生物合成分為3個(gè)階段，共有50個(gè)Unigenes(30種酶)參與。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究后，發(fā)現(xiàn)DXR和HMED的數(shù)量較MK和MVD更多；在植物成熟階段，其莖、葉SMT1的數(shù)量相較于生長(zhǎng)期更多，SMT2則為相反的情況。以上研究結(jié)論為后續(xù)石斛的開(kāi)發(fā)利用提供了參考。

Han Rong-Chun等以霍山石斛為研究對(duì)象，克隆出GMPP基因并借助qPCR技術(shù)檢測(cè)霍山種植區(qū)3種不同石斛(霍山石斛、鐵皮石斛、銅皮石斛)中GMPP基因的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)霍山石斛GMPP基因cDNA序列長(zhǎng)1867bp，進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，基因共編碼415個(gè)氨基酸；之后對(duì)石斛進(jìn)行序列分析，由此得出其所含GMPP與鐵皮石斛、黃花石斛相似性高達(dá)99%，此外還展開(kāi)了一系列進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)這3種石斛的GMPP親緣關(guān)系較近；qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，GMPP基因在霍山石斛莖中數(shù)量最多，在葉組織也分布較為集中，然后是花，根中表達(dá)量最低。另外，霍山種植的3種石斛中霍山石斛的基因數(shù)量最多，這是由于這些組織中多糖含量各異，兩者之間存在密切相關(guān)性。這對(duì)闡明霍山石斛多糖生物合成機(jī)制具有積極意義。

3 鐵皮石斛不同發(fā)育時(shí)期關(guān)鍵物質(zhì)研究進(jìn)展

鐵皮石斛(Dendrobium offcinale Kimura et Migo)是蘭科石斛屬多年生鐵野生繁殖及市場(chǎng)供應(yīng)。當(dāng)前鐵皮石斛已在生物學(xué)、化學(xué)、藥理學(xué)等方面取得一定的研究進(jìn)展。然而從總體來(lái)看，人類(lèi)對(duì)于基因功能的研究較薄弱，不利于植物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

從現(xiàn)有的情況看，鐵皮石斛基因組草圖序列已公布，這對(duì)于后續(xù)學(xué)術(shù)界揭示該植物及其近似種的系統(tǒng)繁育機(jī)制具有重要意義。在鐵皮石斛基因組中，人類(lèi)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個(gè)CIPK編碼基因，對(duì)這些基因之間的分子功能、信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的相互作用機(jī)制，以及基因調(diào)控植物生長(zhǎng)的機(jī)制相關(guān)研究較少。而這方面的研究將會(huì)有助于植物的培育，進(jìn)而給企業(yè)帶來(lái)更多經(jīng)濟(jì)效益。

李依民等對(duì)鐵皮石斛中4個(gè)CIPKs編碼基因鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)DoCIPK1基因在葉和莖中的數(shù)量非常接近，但在根中的數(shù)量較多；研究還發(fā)現(xiàn)，DoCIPK3轉(zhuǎn)錄本在莖和根中的豐度是葉中的數(shù)倍；另外，DoCIPK2與DoCIPK4的表達(dá)模式趨同，二者在莖、葉中的數(shù)量接近，但在根部的數(shù)量較多。該研究為后續(xù)探討基因在石斛生理適應(yīng)中的分子功能創(chuàng)造了條件。鐵皮石斛植物的形態(tài)發(fā)生過(guò)程歷經(jīng)種胚活化以及原球莖的形成、成熟與退化等時(shí)期，總體上可以分為8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期，即種胚活化突破種皮、原球莖形成、原分生組織形成、頂端分生組織形成、橢球形原球莖、葉原基維管系統(tǒng)形成、根端分生組織形成、原球莖退化和苗的形成。

安紅強(qiáng)等克隆鐵皮石斛泛素結(jié)合酶基因DoUBC24，然后采用先進(jìn)技術(shù)檢測(cè)并分析其蛋白結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而確定該基因的時(shí)空差異表達(dá)情況，最終得出基因在植株生長(zhǎng)過(guò)程中所起的作用。qRT-PCR分析顯示，該基因在植株葉原基維管系統(tǒng)形成、原球莖退化階段的表達(dá)顯著下調(diào)，相反地，其在橢球形原球莖、根端分生部位含量較多；基因在各部位中含量由高到低依次為花>莖>種子>根>葉。鐵皮石斛泛素結(jié)合酶DoUBC24基因在鐵皮石斛原球莖不同發(fā)育階段的數(shù)量各不相同，故有研究人員認(rèn)為該基因參與了原球莖發(fā)育過(guò)程。

安紅強(qiáng)收集并整理了原球莖時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并篩選了26個(gè)表達(dá)最穩(wěn)定的基因進(jìn)行測(cè)試。之后經(jīng)過(guò)一系列的分析，最終選取19個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因，在其研究中主要是使用geNorm等方法。

范靜等經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究后，發(fā)現(xiàn)DoTrxL2在石斛原球莖不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中均有表達(dá)差異，具體表現(xiàn)為，這類(lèi)基因于原球莖形成早期表達(dá)量較高，由此推測(cè)其參與了原球莖形成過(guò)程；其在種子和花中數(shù)量較多，推測(cè)該基因參與了植物生殖發(fā)育過(guò)程。

安紅強(qiáng)等采用RT-q PCR分析表明，DoEMB8在原球莖不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較為恒定，在PLB(Protocorm like body)中的表達(dá)量較原球莖不同時(shí)期要高。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，該基因在種子中的表達(dá)量最高，是根中的數(shù)倍，這意味著其在胚胎發(fā)育階段穩(wěn)定且高表達(dá)，因而推測(cè)這類(lèi)基因能夠促進(jìn)植物胚胎發(fā)育。魏明等經(jīng)過(guò)深入的研究，揭示了蘭科菌根真菌對(duì)石斛光合作用的影響機(jī)理，由此得出的結(jié)論是，蘭科菌根真菌能夠一定程度的加快石斛幼苗發(fā)育，這是因?yàn)榫嵘酥参镏衟epc基因的數(shù)量，這對(duì)于人工種植鐵皮石斛、提升其產(chǎn)量具有重要意義。

4 總結(jié)

本研究對(duì)不同栽培模式全生長(zhǎng)季節(jié)的鐵皮石斛以及不同組織部位通過(guò)表型、理化數(shù)據(jù)分析，研究鐵皮石斛在不同生境中生長(zhǎng)的差異形成機(jī)理；鐵皮石斛品質(zhì)相關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)性研究。通過(guò)綜述對(duì)鐵皮石斛各生育期關(guān)鍵組織，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期林下鐵皮石斛品質(zhì)進(jìn)行比較，以期能系統(tǒng)全面地解析鐵皮石斛在不同種植模式下的全季節(jié)發(fā)育期的分子功能和調(diào)控機(jī)制，篩選出重點(diǎn)代謝通路或者基因、代謝產(chǎn)物等，以期后續(xù)對(duì)林下鐵皮石斛進(jìn)行成分代謝變化和分子機(jī)制變化研究。