去白細胞混合濃縮血小板制備的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用效果觀察*

郭敏 李建民 劉建輝 楊寧 張靜 李玉秋 程菲 劉旭枝 賀強 和苗 楊文娟

(1.河北省血液中心，河北 石家莊 050071；2.河北省人民醫(yī)院 輸血科)

為提高血液資源的利用率和緩解臨床應(yīng)用血小板的緊張狀況，以及作為技術(shù)貯備和戰(zhàn)略貯備等新高度要求，在借鑒國內(nèi)白膜法[1-3]制備去白細胞混合濃縮血小板成功經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，針對國內(nèi)起始血液采集規(guī)格[4](200 mL/300 mL/400 mL)與國外[5](450 mL/500 mL)有所不同的國情面前，以及國內(nèi)用于制備去白細胞混合濃縮血小板血袋廠家可供耗材的特性，并結(jié)合單位自身實際情況及采取一些改良做法的基礎(chǔ)上，通過白膜法來制備去白細胞混合濃縮血小板并將其應(yīng)用到臨床，現(xiàn)就其中40 例制備、質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用的跟蹤案例情況進行調(diào)查回顧，并與去白細胞單采血小板40 例的質(zhì)量及臨床應(yīng)用情況進行對比，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 帶留樣裝置400 mL 采血聯(lián)袋(山東威高，如圖1所示)，帶白細胞過濾器的T 型匯集聯(lián)袋(山東威高，如圖2所示)，KUBOTA-9942 離心機(日本久保田)，微電腦配平儀(山東威高)，TSCD-Ⅱ無菌接駁機(日本泰爾茂)，XHZ-Ⅳ血小板恒溫振蕩保存箱(蘇州市醫(yī)用儀器廠)，mindray BC-6600血細胞計數(shù)儀(深圳邁瑞生物)，ADAM-rWBC 殘留白細胞計數(shù)儀(納若恩態(tài))，MC 電子天平(杰力衡器)， FJ-Ⅰ型分漿夾板(蘇州市醫(yī)用儀器廠)，SE-250 熱合機(韓國申通)，BacT/ALERT 3D(480)全自動細菌培養(yǎng)儀(瑞士梅埃理)。

圖1 帶留樣裝置采血袋

圖2 T 型去白匯集聯(lián)袋

1.2 方法

1.2.1 制備濃縮血小板起始血液采集方法及貯存條件要求

使用帶留樣裝置400 mL 四聯(lián)采集袋按操作規(guī)程要求對制備濃縮血小板的起始血液進行采集[6]及貯存[7]。

1.2.2 起始血液的離心條件 在血袋配平后，以2 800 g，14 min，20～24℃，剎車設(shè)置3，為條件進行離心。

1.2.3 血漿量控制式白膜的分離提取方法 將離心后起始血液置于分漿夾板內(nèi)，先將上部血漿轉(zhuǎn)移第一個轉(zhuǎn)移袋中直至血漿約剩30 mL 左右時(約一橫指高度，寧少勿多)止流，將白膜收集袋置于電子秤上，稱重記錄數(shù)值，再將殘留血漿緩慢轉(zhuǎn)移至白膜袋中并稱重(通過血漿密度可換算成mL)和記錄，然后將白膜連同一定量紅細胞(以多收集白膜和少損失紅細胞為雙控手法)一起轉(zhuǎn)移至白膜收集袋中(要求分離的白膜擠過三通)并止流，并依白膜袋中初始收集的血漿量為基礎(chǔ)水平，白膜袋中血漿量不足40 mL 者，用第一轉(zhuǎn)移袋中血漿(可通過對血漿進行輕微搖晃產(chǎn)生泡沫)進行回補(此操作可較為準確控制白膜中的血漿量，其次可達到?jīng)_洗導(dǎo)管和提高白膜回收率等多重效果)至40 mL，最后將MAP添加至紅細胞袋中并混勻，熱合斷離成懸浮紅細胞和含白膜的兩部分。

1.2.4 白膜的貯存及解聚要求 分離后的白膜置于20 ～24℃血小板振蕩保存箱內(nèi)非振蕩保存下進行自然解聚，解聚時間最長≤24 h。

1.2.5 白膜匯集合并去白細胞混合濃縮血小板的制備方法

在檢測結(jié)果合格后，將同血型400 mL 起始血液制備的7袋白膜(血漿含量為40 mL)，使用帶白細胞過濾器的T 型匯集聯(lián)袋，通過無菌連接逐一進行合并，合并中注意充分混勻、減少白膜掛壁狀況，使之集中至第1 個匯集袋中，熱合去除不需要的部件；合并后白膜經(jīng)配平后，以400 g、10 min、20～24℃、剎車設(shè)置3，為離心條件進行離心，離心后，如上部血漿分層好、無紅細胞掛壁狀況，則將混合白膜離心后置于分漿夾板內(nèi)進行分離，將上部血漿經(jīng)血小板型白細胞過濾器轉(zhuǎn)移至血小板保存袋中，即制備成去白細胞的混合濃縮血小板；離心后，如上部血漿分層不好、有紅細胞掛壁狀況，則將上部血漿轉(zhuǎn)移至第2 個轉(zhuǎn)移袋中，熱合去除不需要的部件，再次進行輕離心，離心后再重復(fù)上述分離操作，即制備成去白細胞的混合濃縮血小板。

1.2.6 去白細胞混合濃縮血小板質(zhì)量評判依據(jù) 以《全血及成分血質(zhì)量要求》(18469-2012)中去白細胞單采血小板質(zhì)量控制要求[8]及以團體標準(T/CAME 11-2020)《去白細胞混合濃縮血小板的制備和質(zhì)量控制》的質(zhì)量控制要求[9]對制備的去白細胞混合濃縮血小板質(zhì)量進行評判。

1.2.7 血細胞計數(shù)及白細胞殘留量檢測方法 按mindray BC-6600 血細胞計數(shù)儀和ADAM-rWBC 殘留白細胞計數(shù)儀廠家說明書的操作要求，對單一和混合的濃縮血小板制品進行相關(guān)的數(shù)據(jù)檢測。

1.2.8 血小板細菌培養(yǎng)方法 按BacT/ALERT 3D(480)全自動細菌培養(yǎng)儀廠家說明書操作要求，完成血小板的BPN厭氧菌和BPA 需氧菌的細菌培養(yǎng)。

1.3 對照組設(shè)置 為驗證去白細胞混合濃縮血小板質(zhì)量及臨床療效，本實驗選用對等空白條件下，去白細胞單采血小板樣為對照對象(由MS＋、Trima、Amicus 血小板采集儀及配套耗材按各自操作說明書采集制備)，組成對照組樣例。

1.4 去白細胞混合濃縮血小板臨床輸血是否有效的評判方法 一是通過CCI(the corrected count of increment)指標進行判定，CCI 是通過檢測患者輸注血小板1 h 或24 h 后的血小板計數(shù)來評價血小板輸注后的實際效果。 通常認為，輸注1 h后的CCI＜7 500 或輸注24 h 后的CCI＜4 500，應(yīng)考慮血小板輸注無效，其計算公式[10]為:CCI ＝PI(×109/L)×體表面積(m2)/輸注血小板的絕對數(shù)量(×1011)×1 000，式中輸注后血小板增加數(shù)(PI)＝輸注后血小板計數(shù)-輸注前血小板計數(shù)；體表面積＝0.006 10×患者身高(cm)＋0.012 80×患者體重(kg)＋0.015 29；1 000 為調(diào)節(jié)系數(shù)。 二是通過PPR(percentage of platelet recovery)指標進行判定，計算輸注1 h 后的PPR＜30%或輸注24 h 后的PPR＜20%，應(yīng)考慮血小板輸注無效，其PPR 計算公式[10]為:PPR(%)＝PI(×109/L)×總血容量(L)/[輸注血小板的絕對數(shù)量(×1011)×100×F]×100%，式中總血容量＝患者的體重×0.07；一般脾功能正常的患者F＝0.62，無脾患者F＝0.91，脾腫大患者F＝0.23。

1.5 臨床輸用對象情況 年齡在19 ～61 歲之間，患有包括急慢性白血病、再生障礙性貧血、骨髓纖維化、淋巴瘤、骨質(zhì)增生異常、多發(fā)性骨髓瘤、干燥綜合癥、免疫性血小板減少性紫癜等疾病的男女患者，并根據(jù)身高、體重等指標測算出相應(yīng)指數(shù)，選擇血小板輸注后24 h 來計算的CCI 和PPR 并作為輸注效果評價的衡量指標。

1.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件中配對t檢驗對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和結(jié)果分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組和對照組血小板產(chǎn)品的質(zhì)量檢測情況 跟蹤調(diào)查實驗組40 例去白細胞混合濃縮血小板和對照組40 例去白細胞單采血小板產(chǎn)品的質(zhì)量檢測結(jié)果，如表1 所示。

表1 實驗組和對照組血小板產(chǎn)品的質(zhì)量檢測情況

2.2 實驗組和對照組血小板臨床應(yīng)用效果觀察情況 如表2 所示。

表2 實驗組和對照組血小板臨床應(yīng)用效果觀察情況

3 討論

我國2018 年全國發(fā)出單采血小板177.9 萬單位、手工血小板發(fā)出52.4 萬單位[11]，手工血小板總占比為22.8%，而國外輸血事業(yè)發(fā)達國家如法國臨床使用混合濃縮血小板比率達51.6%， 德國為38.5%， 瑞士為35.0%，英國為19.3%(2012 年為14.7%)[12]，以及在歐美國家，機制血小板的臨床使用占所有血小板種類的40%～50%，而白膜法(BC-PC)制備血小板占臨床使用血小板總數(shù)的80%[13]。 對比發(fā)現(xiàn)國內(nèi)手工血小板臨床應(yīng)用和國外還存在一定差距，導(dǎo)致這種差距的原因是多方面的，如標準制約、制備耗材不全、傳統(tǒng)理念束縛等，但從節(jié)約和充分利用血液資源以及作為技術(shù)貯備和戰(zhàn)略貯備等新高度要求角度出發(fā)，去白細胞混合濃縮血小板制備及臨床應(yīng)用都值得重視和關(guān)注。

去白細胞混合濃縮血小板不單純是個制備活，其涵蓋了原料耗材、工藝技術(shù)、軟硬件技術(shù)、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證等等方面，可相互影響亦可相輔相成。 隨著去白細胞混合濃縮血小板相關(guān)標準的出臺以及與制備緊密關(guān)聯(lián)的使用耗材的技術(shù)成熟和批準上市，為其制備奠定了堅實基礎(chǔ)。 本文在制備去白細胞混合濃縮血小板上，采取了一些旨在保證產(chǎn)品質(zhì)量和確保臨床治療效果的做法。 1)耗材選擇:選擇帶留樣裝置采集袋的目的是預(yù)防血液采集過程中的血液細菌污染；使用血小板保存袋存放白膜是延長其保存時間便于后續(xù)的匯集操作；使用帶白細胞過濾器的T 型匯集聯(lián)袋是出于以下考慮，一是采用無菌連接匯集操作可確保多袋匯集時不發(fā)生細菌污染，二是如果發(fā)生離心效果不佳導(dǎo)致血小板中紅細胞混入量過高時，可采取再次輕離心的補救操作以去除多余紅細胞，降低血小板中紅細胞混入量，三是在分離過程中可同時進行濾除白細胞的操作以提高效率。 2)單一血小板血漿量及去白細胞混合濃縮血小板總?cè)萘靠刂?單一白膜分離中留存40 mL 血漿的意義在于，一是當血小板懸浮儲存于35～40 mL 血漿時，其恢復(fù)率和存活率都很好[5，20]，且歐盟相關(guān)標準中也要求血漿的容量應(yīng)＞40 mL[14]這一規(guī)定，盡管這一要求與國內(nèi)標準要求的濃縮血小板容量50 ～76 mL[8]不盡相同，但并不影響產(chǎn)品質(zhì)量，且在容量超負荷控制方面更具優(yōu)勢。如以此容量并以7 袋為基準進行1 個治療量去白細胞混合濃縮血小板制備，其總?cè)萘吭?50～532 mL 的范圍內(nèi)，大大超出《全血及成分血質(zhì)量要求》(18469-2012)中去白細胞單采血小板質(zhì)量控制要求[8]及以團體標準《去白細胞混合濃縮血小板的制備和質(zhì)量控制》(T/CAME 11—2020)[9]血小板容量即250～300 mL 之要求。 另外，制備中采取的血小板先期容量控制方法，與文獻報道的全血制備的血小板平均體積減少至最終體積為15 ～20 mL/U 時，體外性質(zhì)如血小板形態(tài)、平均血小板體積、低滲休克反應(yīng)、聚集和血小板因子3 活性可保持在儲存5 d 的體積減少的血小板中[5，21]的出發(fā)點一致，具有解決容量超標問題及無需別的補救措施等優(yōu)點。3)采取7 袋匯集做法的原由:一則較單一血小板最低量血小板計數(shù)要求(≥4.0×1010)更容易滿足起始血液隨機采集、制備這一雙盲(采集和制備前血小板計數(shù)檢測并非常規(guī)化的操作)現(xiàn)狀；二則考慮到血小板濾除白細胞過程中損失(不同質(zhì)量濾器損失消耗量一般為10%～15%)，其最低標準理論計算結(jié)果為:血小板計數(shù)(×1011)＝4.0×1010×7×(1-10)%≈2.52×1011(≥2.50×1011)，仍能滿足相關(guān)標準要求，如果單一血小板中存在計數(shù)值相對高者，其最終計數(shù)值則更會高，這一做法也與文獻報道的如需過濾，血小板袋數(shù)應(yīng)適當增加1～2袋，以補充過濾、留取標本的消耗[15]的做法有異曲同工的效果；三則以7 袋為基準進行一個治療量去白細胞混合濃縮血小板制備時，可確保其總?cè)萘靠刂圃?50 ～300 mL 的范圍內(nèi)，一般平均在280 mL 左右內(nèi)，此舉，可防止單一白膜中血漿量過多導(dǎo)致的匯集后總?cè)萘窟^多，會加重輸注者的循環(huán)壓力[16]的風(fēng)險；四則選擇以7 袋為基準進行匯集的做法，隨著白膜層儲存時間的延長，血小板對外界刺激的敏感性降低，使本已經(jīng)形成微聚體的血小板充分解聚[17]，更有利于血小板回收率的提高，血液標本的酶免加核酸檢測一般用時為48 h＞白膜解聚的最長24 h 用時，也就是說在檢測結(jié)果合格后采取的多袋白膜匯集時，白膜均可達到較好的解聚效果；五則固定式制備操作更有利于標準化和規(guī)范化操作，可操作性好，可更加確保產(chǎn)品質(zhì)量，較文獻報道的用7 人份400 mL全血中白膜匯集制備混合濃縮血小板，又經(jīng)洗滌去上清后再加入200 mL 血漿以控制產(chǎn)品總?cè)萘吭?50 mL 左右[18]的做法更加簡便有效，但在單人血漿和多人血漿懸浮血小板上，單人血漿在抗體和感染風(fēng)險上切實較多人血漿有優(yōu)勢，目前情況下可在分離非懸浮用單一白膜時盡可能減少血漿用量以降低混合血漿量比重，且這種風(fēng)險將來會隨著血小板保存添加劑的應(yīng)用而得到極大改善和解決。 4)制備中應(yīng)注意的一些細節(jié)問題:一是一次離心時選擇相對較大的離心力可提高白膜回收率、保證正常規(guī)格量血漿、在白膜壓實程度及白膜解聚時間達12 h 以上時并不影響濃縮血小板回收率；二是針對血小板中的紅細胞混入量，因白膜匯集后容積變大，血袋裝杯時更易保持直立效果，再加上采用海綿填充法[19]加持，可增強直立效果和在離心過程中減少壁掛紅細胞現(xiàn)象，對降低血小板中紅細胞混入有實效，與文獻報道的混合濃縮血小板中紅細胞混入量低[20]的結(jié)論一致。 5)進一步拓展制備的設(shè)想:一則在制備中采取和選擇一些別的做法能夠帶來進一步的好處，但也增加了一定的困難程度，如理論上單一產(chǎn)品中血小板計數(shù)值更高，在合并混合后其血小板計數(shù)值也應(yīng)更高，這就給匯集份數(shù)遞減(如4～6 袋)提供了可能；二則若采集量少單日不足完成治療量匯集的可從兩日量中去完成；三則血小板保存添加劑批準上市后，對去白細胞混合濃縮血小板制備帶來的新變化。 從實驗的結(jié)果上看，本實驗產(chǎn)品質(zhì)量無論是在血小板容量、血小板計數(shù)、紅細胞混入量和白細胞殘留量等指標上均可符合相關(guān)標準要求，與去白細胞單采血小板質(zhì)量并無明顯差異，同時設(shè)計的制備方法相對簡便易行，可操作性強，但仍存在逐步完善及持續(xù)改進之處。

文獻報道血小板成分中去除白細胞顯著降低了HLA 免疫(初級免疫減少＞80%，二級免疫減少40%)[21]，而接受血小板輸注的患者高達40%可發(fā)生同種免疫導(dǎo)致的輸注無效，這種風(fēng)險已被證明通過所有血液成分的普遍濾除白細胞而減少[22]，本實驗濾除混合濃縮血小板中的白細胞的目的也正在于此，且濾除效果符合國家相關(guān)標準要求。 另文獻報道在單采血小板和混合濃縮血小板的比較中，針對非異變致敏受者兩種產(chǎn)品的治療作用是等效的[23]，這說明混合濃縮血小板除特定需求外，完全可以滿足其他的治療要求，這與表2的調(diào)查結(jié)果相一致。

綜上所述，針對去白細胞混合濃縮血小板，只要制備方法得當，其質(zhì)量及臨床應(yīng)用效果與去白細胞單采血小板基本相當，在應(yīng)對臨床血小板供應(yīng)緊張時不失為一種很好的補充策略。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。